CN109825568B

CN109825568B - 辐射敏感基因标记物及在鉴别低let射线辐射中的应用

Info

Publication number: CN109825568B
Application number: CN201910019814.2A
Authority: CN
Inventors: 周平坤; 周兆明; 周成; 刘晓丹
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2019-01-09
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2039-01-09
Also published as: CN109825568A

Abstract

本发明提供了辐射敏感基因标记物及在鉴别低LET射线辐射中的应用。该辐射敏感基因标记物包括Wnt7b、Tprkb、Pira1、Pde4dip、Limk2、Ctns、Kcnk6、Csf2rb、Cd80和Sesn2。基于检测被辐射的生物体内辐射敏感基因标记物的基因表达水平，从而用于鉴别被辐射的生物体是否被低LET射线(如：X射线、β射线、γ射线等)辐射暴露，从而提供辐射剂量参考，用于核辐射损伤风险评估。

Description

辐射敏感基因标记物及在鉴别低LET射线辐射中的应用

技术领域

本发明属于辐射生物学射线类型检测领域，具体涉及辐射敏感基因标记物及在鉴别低LET射线辐射中的应用。

背景技术

X线及其他低线性能量传递(Linear energy transfer，LET)射线如β、γ射线、电子线等在医疗卫生、工农业生产、特种医学、科学研究等各领域具有广泛应用基础。LET是评价射线质的一个参数。相对于高LET射线(如重离子、快中子、碳、氮、氧、氖等)，低LET射线在单位长度上电离密度明显偏小，射线的散射作用非常显著。加上作为电磁波本身具有的穿透效应、荧光效应等，X线的辐射防护也成为了日渐关注的问题。

在日常大量使用CT检查与肿瘤放射治疗中，尤其是基于数字X线摄影或数字减影血管造影的骨科、肿瘤介入、心脏传导束支消融手术中，医护人员的放射防护工具包括铅衣、围脖、眼罩等往往无法完全阻隔术中X线。导致相关及相邻科室(如上下楼层手术室)医护人员出现明显升高的甲状腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发病。除了X射线在医学上的应用，低LET射线目前已被广泛应用于工业勘探、武器装甲及金属质量检测、反恐安检等领域。短期高剂量或长期低剂量低LET射线累积对从业人员及检查对象的健康影响已经成为目前广泛关注的问题。低LET线对机体可以造成不可逆损伤，有可能引发恶性肿瘤、血液***疾病及炎症纤维化等不良反应。

此外，低LET射线也是核武器***中释放出的射线类型之一(如β粒子、γ射线等)。现代战争中面临的电磁波武器防护也同样涉及各种低LET射线。潜在辐射威胁还可来自于工业探伤用或医用放射源，在转运、存储、运行过程中一旦发生放射源密封性被破坏或放射源丢失，可造成低LET射线辐射。面向从业人员的辐射卫生及健康监测、有效应对各类辐射突发事件，基于生物学效应对暴露射线进行有效区分与判定已越来越受到重视。这将对核安全、辐射事故的处理、暴露人群的及时妥善治疗都具有关键意义。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明的第一目的在于提供辐射敏感基因标记物，该辐射敏感基因标记物被申请人证实仅针对于低线性能量传递(low-linear energytransfer,LET)射线(如X射线)具有高度特异的辐射敏感性，对高线性能量传递(high-linear energy transfer,LET)射线(如重离子射线)无辐射敏感性。

本发明的第二目的在于提供该辐射敏感基因标记物在鉴别低LET射线辐射中的应用。基于检测被辐射的生物体内辐射敏感基因标记物的基因表达水平，从而用于鉴别被辐射的生物体是否被低LET射线(如：X射线、β射线、γ射线等)辐射暴露，从而提供辐射剂量参考。

本发明的第三目的在于提供一种用于鉴别生物体是否被低LET射线辐射的试剂盒及其应用，采用含有本发明辐射敏感基因标记物的试剂盒能够更加快速、便捷和准确的鉴别低LET射线并提供剂量参考。

本发明的第四目的在于提供一种获得本发明辐射敏感基因标记物的方法。

本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

第一方面，本发明提供的辐射敏感基因标记物，该辐射敏感基因标记物包括10个辐射敏感基因：Wnt7b(Wnt Family Member 7B，Wnt家族蛋白7b)、Tprkb(TP53-RelatedProtein Kinase Binding Protein，TP53相关蛋白激酶结合蛋白)、Pira1(Paired-Ig-LikeReceptor A1，配对-Ig-样受体A1)、Pde4dip(Phosphodiesterase 4DInteractingProtein，磷酸二酯酶4D相互作用蛋白)、Limk2(LIM Domain Kinase 2，LIM域激酶2)、Ctns(Cystinosin,Lysosomal Cystine Transporter，胱氨酸，溶酶体胱氨酸转运蛋白)、Kcnk6(Potassium Two Pore Domain Channel Subfamily K Member 6，钾双孔域通道亚家族K成员6)、Csf2rb(Colony Stimulating Factor 2Receptor Beta Common Subunit，菌落刺激因子2受体β共同亚基)、Cd80(Cd80 Molecular，Cd80分子)和Sesn2(Sestrin 2，Sestrin 2蛋白)。

上述的辐射敏感基因标记物中，优选地，所述Wnt7b的核苷酸序列如下：

AGAGAGGTGGTTAGTGGACCCAGGCAGGGCACTGGCTGTCCCAATGCTGT(如SEQ ID NO：1所示)(5’-3’)；

所述Tprkb的核苷酸序列如下：

GCGCCAAGTCTGCAAAGCCAGGTGCTCTCATAGTGCAGTTCTGGGGTTGT(如SEQ ID NO：2所示)(5’-3’)；

所述Pira1的核苷酸序列如下：

CCAGGATCTGTGATCGCCTCCAAAAGAGCAATGACCATCTGGTGTCAGGG(如SEQ ID NO：3所示)(5’-3’)；

所述Pde4dip的核苷酸序列如下：

GGGGGGAAGGAACTAATGACATCGTCTCAGACGTTCATCTCTAACCAGCC(如SEQ ID NO：4所示)(5’-3’)；

所述Limk2的核苷酸序列如下：

TGAGTATGCTTGCACTGTCCCCAGCAAGTGTGGGAGTGGGGCCTGCACTA(如SEQ ID NO：5所示)(5’-3’)；

所述Ctns的核苷酸序列如下：

GCCTTCAGAACCAAGTCCTGGGGGCTTAGAGGACCTTGCTTACCTATGTC(如SEQ ID NO：6所示)(5’-3’)；

所述Kcnk6的核苷酸序列如下：

CAGAGCCCAAGCCACATCTACTACTGTGTGCCTAGCACAGAAAAGCATGG(如SEQ ID NO：7所示)(5’-3’)；

所述Csf2rb的核苷酸序列如下：

TGAGCACACATTCCAGGTCCAGTACAAGAAGAAATCGGACAGCTGGGAGG(如SEQ ID NO：8所示)(5’-3’)；

所述Cd80的核苷酸序列如下：

GCTCTTTGGGGCAGGATTCGGCGCAGTAATAACAGTCGTCGTCATCGTTG(如SEQ ID NO：9所示)(5’-3’)；

所述Sesn2的核苷酸序列如下：

TGGCTGCCTGTGTGGGAGAGGAGTAAGGACCTCCAGGGACTAGCACTCCA(如SEQ ID NO：10所示)(5’-3’)。

第二方面，本发明还提供上述辐射敏感基因标记物在鉴别低LET射线辐射中的应用。

上述的应用中，优选地，该应用包括以下步骤：

检测被辐射的生物体内辐射敏感基因标记物Wnt7b、Tprkb、Pira1、Pde4dip、Limk2、Ctns、Kcnk6、Csf2rb、Cd80和Sesn2的基因表达水平，当其表达水平均出现显著高调，则可鉴别确定被辐射的生物体为低LET射线辐射暴露。

上述的应用中，所述生物体可以包括人、动物等。

上述的应用中，优选地，所述低LET射线包括X射线、β射线和γ射线等中的一种或多种。

上述的应用中，优选地，所述敏感基因标记物的基因表达水平为其转录水平差异表达倍数的平均值。

第三方面，本发明还提供一种用于鉴别生物体是否被低LET射线辐射的试剂盒，所述试剂盒含有上述辐射敏感基因标记物。

第四方面，本发明还提供上述的试剂盒在鉴别低LET射线辐射中的应用。

第五方面，本发明还提供一种以非治疗目的获取上述辐射敏感基因标记物的方法，包括如下步骤：

对小鼠进行不同射线类型、不同剂量单次梯度剂量照射和分次梯度剂量照射后，提取新鲜肺组织做基因芯片或实时定量聚合酶链式反应，基于全基因组基因表达阵列对24周肺组织全基因组表达水平进行分析，分析不同射线照射，辐射剂量与基因表达的趋势关系，获得基因表达量随低LET射线辐射剂量升高而升高，且不随高LET射线辐射剂量变化而变化的表达基因组合，即该辐射敏感基因标记物。

上述的方法中，不同射线类型、不同剂量单次梯度剂量照射和分次梯度剂量照射可以采取如下方式，例如：X线梯度剂量单次照射(0、10.5、12.5、14.5、17.5Gy)、X线梯度剂量分次照射(0、10、20、30、40Gy分5次照射)、碳离子(Carbon-ions)梯度剂量单次照射(0、7.5、10.5、12.5、14.5Gy)、碳离子(Carbon-ions)梯度剂量分次照射(0、5、10、15、20Gy分5次照射)。

上述的方法中，优选地，所述不同射线类型包括低LET射线和高LET射线；更加优选地，所述高LET射线包括快中子射线、负π介子射线和重离子射线等中的一种或多种。

本发明是通过X线或其他低LET射线照射后，根据小鼠肺组织相关辐射敏感基因转录水平应激性改变而建立的一种生物学剂量评估手段。

本发明利用小鼠接受不同LET射线全肺照射后24周的全基因组转录组学分析筛选出相关敏感基因组合。该特异性基因组合对高LET射线无反应，但接受低LET射线照射后能够驱动该基因组合出现显著高调，并通过该生物学效应，根据基因表达水平-X射线预测模型快速进行X射线辐射鉴别。

本发明采取的小鼠模型为小鼠放射性肺损伤模型，其是研究放射性肺炎、肺纤维化与辐射剂量关系、正常组织辐射反应、呼吸***疾病与免疫应答反应机制的重要工具，在放射生物学、放射治疗学与抗肺损伤药物研发中具有不可替代的作用。放射性肺损伤早期主要表现为放射性肺炎(通常继发于照射后3个月内)，由于大量T淋巴细胞受到激活产生免疫应答反应，一种淋巴细胞性肺泡炎；晚期可发展为间质性肺纤维化(照射后6个月左右)。小鼠放射性肺损伤的病理生理学过程与人类极为相似，因此可以作为可靠的参考实验模型。

本发明中，若生物体所接受的为混合射线，即同时含有高LET射线、低LET射线的情形，本发明方法可以准确鉴别低LET射线部分。

本发明的有益效果：

(1)本发明的辐射敏感基因标记物仅针对于低线性能量传递(low-linear energytransfer,LET)射线(如X射线等)具有高度特异的辐射敏感性，对高线性能量传递(high-linear energy transfer,LET)射线(如重离子射线等)无辐射敏感性，基于检测被辐射的生物体内辐射敏感基因标记物的基因表达水平，从而用于鉴别被辐射的生物体是否被低LET射线(如：X射线、β射线、γ射线等)辐射暴露，从而提供辐射剂量参考，用于核辐射损伤风险评估。

(2)采用含有本发明辐射敏感基因标记物的试剂盒能够更加快速、便捷和准确的鉴别低LET射线并提供剂量参考。

附图说明

图1为本发明实施例1中C57BL/6小鼠接受不同射线类型、不同剂量单次梯度剂量照射和分次梯度剂量照射后，24周肺组织全基因组转录水平分析后获得剂量依赖的上调基因(dose-dependent up-regulation genes)子集维恩图[X线梯度剂量单次照射(0、10.5、12.5、14.5、17.5Gy)、X线梯度剂量分次照射(0、10、20、30、40Gy分5次照射)、碳离子(Carbon-ions)梯度剂量单次照射(0、7.5、10.5、12.5、14.5Gy)、碳离子(Carbon-ions)梯度剂量分次照射(0、5、10、15、20Gy分5次照射)]。

图2为本发明实施例1中维恩图分析获得的126个X射线特异性基因热图。

图3为本发明实施例1中维恩图分析最显著(Top 10)X射线特异性基因组成的低LET射线生物学鉴别基因组合的基因热图。

图4为本发明实施例2中筛获得的10个特异性敏感基因在X射线照射后24周的表达量(log2 fold-change)。

图5为本发明实施例2中筛获得的10个特异性敏感基因在梯度剂量X射线、重离子照射后24周的基因表达值(P<0.0001)。

图6为受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

以下实施例中所采用的化学试剂等，若无特殊说明，均为市售获得。

实施例1辐射敏感基因标记物的筛选获取

1、动物实验照射及分组：采用8-10周龄C57BL6雌性小鼠，SPF级饲养，饲养条件为，温度(23±1)℃，相对湿度55％±5％，压力差≤10Pa，每日光照12h，自由摄食饮水。

2、照射前经异氟烷诱导麻醉后，转移至专用小鼠胸部照射装置并妥善固定。采用X线及重离子(碳离子，carbon-ions)射线进行全肺野照射。X线是低LET射线的代表之一，是经医用直线加速器加速后照射(能量6-10MV)。作为高LET射线的主要代表，重离子射线是经回旋加速器(直径达20-30米)加速后引流的碳粒子束流(能量280MeV)，具有极高的能量与速度。

3、照射及分组包括X线梯度剂量单次照射：0、10.5、12.5、14.5、17.5Gy、X线梯度剂量分次照射：0、10、20、30、40Gy分5次照射、重离子梯度剂量单次照射：0、7.5、10.5、12.5、14.5Gy、重离子梯度剂量分次照射：0、5、10、15、20Gy分5次照射。

4、空白对照组不接受射线照射(0Gy)。对照组与各剂量实验组每组均随机分配3只小鼠。

5、照射后第24周行取新鲜肺组织、经总RNA抽提试剂(Trizol)处理后采用RNeasyMini试剂盒分离提取总RNA。为了避免DNA污染，用DNase I处理RNA。纯化的RNA在45.0μl无核酸酶的水中洗脱，并-20.0℃储存。使用NanoDrop ND-1000分光光度计评估RNA浓度和纯度。使用2100Bioanalyzer和相应的RNA Nano Chip测定RNA样品的完整性和纯度。基于全基因组基因表达阵列对样品进行分析。使用自带软件包进行表达矩阵的生成，数据注释和处理。在随后的统计测试中，对数据进行log2转换以说明基因的表达上升或者下降。为分析不同时间点辐射与基因表达趋势关系，采用R语言软件包进行聚类分析，包括主成分分析，层次聚类，K均值聚类和自组织映射来识别剂量相关基因表达。

基于全基因组基因表达阵列对24周肺组织全基因组表达水平进行分析，分析不同射线照射，辐射剂量与基因表达的趋势关系，获得基因表达量随低LET射线辐射剂量升高而升高，且不随高LET射线辐射剂量变化而变化的表达基因组合，即该辐射敏感基因标记物。

具体筛选过程如下：

参见图1和图2，X线梯度剂量单次照射(0、10.5、12.5、14.5、17.5Gy)、X线梯度剂量分次照射(0、10、20、30、40Gy分5次照射)、碳离子(Carbon-ions)梯度剂量单次照射(0、7.5、10.5、12.5、14.5Gy)、碳离子(Carbon-ions)梯度剂量分次照射(0、5、10、15、20Gy分5次照射)后24周，肺组织全基因组转录水平分析后获得剂量依赖的上调基因(dose-dependentup-regulation genes)子集。维恩图分析获得126个X射线特异性基因。

参见图3，分别对不同射线照射后小鼠肺组织基因表达水平进行热图分析显示：基因表达量随X射线剂量增加而升高，呈剂量相关性；基因表达量不随重离子射线剂量变化而改变。筛选获得了10个辐射敏感基因组合：Wnt7b(Wnt Family Member7B，Wnt家族蛋白7b)、Tprkb(TP53-Related Protein Kinase Binding Protein，TP53相关蛋白激酶结合蛋白)、Pira1(Paired-Ig-Like Receptor A1，配对-Ig-样受体A1)、Pde4dip(Phosphodiesterase4D Interacting Protein，磷酸二酯酶4D相互作用蛋白)、Limk2(LIM Domain Kinase 2，LIM域激酶2)、Ctns(Cystinosin,Lysosomal Cystine Transporter，胱氨酸，溶酶体胱氨酸转运蛋白)、Kcnk6(Potassium Two Pore Domain Channel Subfamily K Member 6，钾双孔域通道亚家族K成员6)、Csf2rb(Colony Stimulating Factor 2 Receptor Beta CommonSubunit，菌落刺激因子2受体β共同亚基)、Cd80(Cd80 Molecular，Cd80分子)和Sesn2(Sestrin 2，Sestrin 2蛋白)。

所述Tprkb的核苷酸序列如下：

所述Pira1的核苷酸序列如下：

所述Pde4dip的核苷酸序列如下：

所述Limk2的核苷酸序列如下：

所述Ctns的核苷酸序列如下：

所述Kcnk6的核苷酸序列如下：

所述Csf2rb的核苷酸序列如下：

所述Cd80的核苷酸序列如下：

所述Sesn2的核苷酸序列如下：

实施例2

本实施提供实施例1筛选获得的辐射敏感基因标记物在鉴别低LET射线辐射中的应用。

参见图4，10个基因在梯度剂量X射线、碳离子射线照射后的表达倍数差异，重离子射线照射组几乎无辐射反应。

参见图5，10个基因在梯度剂量X射线、碳离子射线照射24周的基因表达值差异，差异具有统计学意义(P<0.0001)。

参见图6，受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)图，10个基因在梯度剂量X射线、碳离子射线照射后的基因表达平均值对X线的鉴别能力。曲线下面积(Area under the Curve，AUC)等于0.984，95％置信区间(Confidenceinterval，CI)为0.952–1.000，且在上述10个基因表达平均值等于1.033时，鉴别X射线敏感度95.83％，特异度100％，表明上述10个基因平均表达值对X射线辐射有良好鉴别能力。

将本发明辐射敏感基因标记物做成用于鉴别是否被低LET射线辐射的试剂盒，能够更加快速、便捷和准确的鉴别低LET射线并提供剂量参考，有助于市场化销售使用。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神、所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 辐射敏感基因标记物及在鉴别低LET射线辐射中的应用

<130> GAI18CN6324

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> Wnt7b

<400> 1

agagaggtgg ttagtggacc caggcagggc actggctgtc ccaatgctgt 50

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> Tprkb

<400> 2

gcgccaagtc tgcaaagcca ggtgctctca tagtgcagtt ctggggttgt 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Pira1

<400> 3

ccaggatctg tgatcgcctc caaaagagca atgaccatct ggtgtcaggg 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Pde4dip

<400> 4

ggggggaagg aactaatgac atcgtctcag acgttcatct ctaaccagcc 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Limk2

<400> 5

tgagtatgct tgcactgtcc ccagcaagtg tgggagtggg gcctgcacta 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> Ctns

<400> 6

gccttcagaa ccaagtcctg ggggcttaga ggaccttgct tacctatgtc 50

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> Kcnk6

<400> 7

cagagcccaa gccacatcta ctactgtgtg cctagcacag aaaagcatgg 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> Csf2rb

<400> 8

tgagcacaca ttccaggtcc agtacaagaa gaaatcggac agctgggagg 50

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> Cd80

<400> 9

gctctttggg gcaggattcg gcgcagtaat aacagtcgtc gtcatcgttg 50

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> Sesn2

<400> 10

tggctgcctg tgtgggagag gagtaaggac ctccagggac tagcactcca 50

Claims

1.辐射敏感基因标记物组合，其特征在于：该辐射敏感基因标记物组合由Wnt7b、Tprkb、Pira1、Pde4dip、Limk2、Ctns、Kcnk6、Csf2rb、Cd80和Sesn2组成，所述辐射为X射线辐射，所述辐射敏感基因标记物为基因表达量随X射线辐射剂量升高而升高、且不随碳离子射线辐射剂量变化而变化的表达基因。

2.根据权利要求1所述的辐射敏感基因标记物组合，其特征在于：

所述Wnt7b的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述Tprkb的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述Pira1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述Pde4dip的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述Limk2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述Ctns的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述Kcnk6的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述Csf2rb的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

所述Cd80的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

所述Sesn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

3.检测权利要求1或2所述辐射敏感基因标记物组合的基因表达水平的试剂在制备用于鉴别X射线辐射暴露与碳离子射线辐射暴露的试剂盒中的应用。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤：

检测被辐射的生物体内辐射敏感基因标记物Wnt7b、Tprkb、Pira1、Pde4dip、Limk2、Ctns、Kcnk6、Csf2rb、Cd80和Sesn2的基因表达水平，当其表达水平均出现显著高调，则确定被辐射的生物体为X射线辐射暴露，所述生物体为小鼠。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：敏感基因标记物的基因表达水平为其转录水平差异表达倍数的平均值。

6.一种用于鉴别X射线辐射暴露与碳离子射线辐射暴露的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有检测被辐射的生物体内权利要求1或2所述辐射敏感基因标记物组合的基因表达水平的试剂，所述生物体为小鼠。

7.权利要求6所述试剂盒在制备用于鉴别X射线辐射暴露与碳离子射线辐射暴露的试剂盒中的应用。

8.一种以非治疗目的获取权利要求1或2所述辐射敏感基因标记物组合的方法，其特征在于，包括如下步骤：

对小鼠进行不同射线类型、不同剂量单次梯度剂量照射和分次梯度剂量全肺野照射后，提取新鲜肺组织做基因芯片或实时定量聚合酶链式反应，基于全基因组基因表达阵列对24周肺组织全基因组表达水平进行分析，分析不同射线照射、辐射剂量与基因表达的趋势关系，获得基因表达量随X射线辐射剂量升高而升高、且不随碳离子射线辐射剂量变化而变化的表达基因组合，即辐射敏感基因标记物组合；

其中，所述不同射线类型、不同剂量单次梯度剂量照射和分次梯度剂量照射为：X射线梯度剂量单次照射0、10.5、12.5、14.5、17.5Gy，X射线梯度剂量分次照射0、10、20、30、40Gy分5次照射，碳离子射线梯度剂量单次照射0、7.5、10.5、12.5、14.5Gy，碳离子射线梯度剂量分次照射0、5、10、15、20Gy分5次照射。