CN109811002A - 化学试剂增加水稻等位基因替换编辑效率 - Google Patents

Abstract

本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及水稻基因编辑中的等位基因替换。本申请使用化学试剂来增加水稻等位基因替换编辑效率。特别地，本申请涉及使用化学试剂例如化合物SCR7或RS‑1来增加在水稻基因编辑中的等位基因替换效率的用途和方法。

Description

化学试剂增加水稻等位基因替换编辑效率

技术领域

本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及水稻基因编辑中的等位基因替换。本申请提高了水稻中等位基因替换编辑的效率。

背景技术

基因编辑技术，特别是以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术，是遗传研究领域革命性的技术。它在植物基因功能研究和作物遗传育种方面发挥了重大的作用。基因编辑主要是通过不同的序列特异核酸酶(ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1)在基因组特定位置产生双链断裂，进而通过自身的非同源末端连接或者是同源重组机制，实现对基因组的修饰，包括缺失、***和替换等。

基因替换编辑技术是基因编辑技术中的一种，它是通过核酸酶介导对目标基因进行替换的编辑技术，特别是基于CRISPR/Cas9***的基因编辑技术，可以在基因组靶向位点处产生DNA双链断裂(DSB)，以人为提供的外源供体DNA为模板，通过同源重组(HR)介导的DNA修复途径来实现对目标基因的替换。与***缺失的突变相比，基因替换编辑技术在农作物遗传改良与基因功能鉴定中具有更重要的作用和实际应用价值。

同源重组修复是一种精确的修复方式，对于维持基因组的完整性和稳定性至关重要。但是在真核生物中，非同源末端连接修复效率远远大于同源重组的修复效率，所以真核生物中基因替换具有很大的挑战性，也是基因编辑领域研究的一个热点。同源重组修复主要发生在细胞的G2期和S期^[1]，在整个G1期几乎没有同源重组修复。Gutschner等人利用蛋白质工程方法，直接同步Cas9的表达与细胞周期，控制基因组的时空编辑，来增加同源重组的效率^[2]。Yang等人也证实将细胞同步在G2/M期后基因敲入的效率会增加3到6倍^[3]。

Cpf1作为新一代的基因编辑工具，有很多与CRISPR/Cas9不同的优势，其中Cpf1剪切之后产生的是粘性末端，这有会更有利于基因的定点***。Begemann等人曾在水稻中用Cpf1做基因定点***，效率达到了8％，这是其他的核酸酶都没法达到的效率^[4]。

基因替换编辑技术中关键的一步是产生双链断裂的同时能将DNA模板递送到位，Butt等人应用CRISPR/Cas9***，将模板串联在gRNA的后面，这样在产生双链断裂的同时，模板可以及时地用来修复，从而提高基因替换的效率^[5]。

双生病毒科病毒是一类具有环状单链DNA(circular single strand DNA)基因组的植物病毒，寄主范围广泛，包括单子叶和双子叶植物。基因组大小为2.5-3.0kb，病毒感染寄主细胞后会通过滚环复制产生大量的DNA复制子，可作为同源重组修复的模板。Baltes等人最早将双生病毒复制子用于提高植物基因替换编辑的效率，与传统的农杆菌转化相比，菜豆黄矮病毒(Bean yellow dwarf virus，BeYDV)的复制子可以将基因替换的效率提高一到两个数量级^[6]。随后他们实验室又将这一技术应用到西红柿上，创造了可遗传的基因敲入后代，与传统的DNA导入方法相比，基因敲入的效率提高了10倍^[7]。同样地，菜豆黄矮病毒复制子也被应用于马铃薯，用来提高基因替换的效率^[8]。Gil-Humanes等人在小麦中利用小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus，WDV)用于DNA模板复制，将基因敲入的效率大大提高，在报告***中效率提高了110倍，在一个内源基因位点效率也提高到原来的12倍^[9]。Wang等人将小麦矮缩病毒的***引入到水稻上用于基因替换编辑，使基因替换编辑的效率达到了19.4％^[10]。

DNA修复蛋白例如KU70/80和Ligase4等参与经典的非同源末端连接修复途径，抑制这些蛋白的功能可以增加基因替换的效率。Qi等人的研究表明，在拟南芥ku70突变体中，基于同源重组的基因定点整合的效率可以提高5-16倍；在lig4突变体中，基因定点整合的效率可以提高3-4倍^[11]。Endo等人也在水稻中证实，同时突变ligase4可以极大地提高基因定点***的效率^[12]。

53BP1是双链断裂修复机制中的一个重要调节因子，能够通过抑制末端切除使修复更倾向于NHEJ修复，是HDR修复过程中最开始的一个限速步骤。Canny等人通过在人和老鼠的细胞中表达53BP1的抑制子i53，阻断53BP1的积累，从而将HDR的效率提高了5.6倍^[13]。

Yu等人用高通量筛选的方法，在多功能干细胞中从大约4000个已知功能的小分子中鉴定出两个小分子L755507和Brefeldin A，其可以增加同源重组的效率^[14]。研究人员还通过用Cas9/sgRNA复合物靶向基因的同时结合化合物SCR7抑制DNA连接酶VI和/或抑制NHEJ所需的基因(即编码ku70和ku80的基因)，从而提高基因定点***的效率^[15,16,17]。

RAD51和其他RecA家族蛋白组装在单链DNA上形成突触前丝，完成同源重组的重要步骤，Jayathilaka等人通过对10000个化合物的筛选，鉴定出RS-1能增强哺乳动物中RAD51的结合^[18]。之后，Song等人在动物细胞中揭示了RS-1可以将TALLEN和CRISPR/Cas9的基因敲入效率提高2到5倍，并且认为非同源末端连接抑制子SCR7的作用甚微^[19]。Rad52也是一个重要的同源重组蛋白，Shao等人的研究表明，Rad52和Cas9共表达或者Rad52与Cas9融合策略都可以在荧光报告***中使基因替换的效率增加3倍。并且发现，联合使用Rad52和化合物SCR7可以将HDR效率显著提高40％左右^[20]。酵母的Rad54蛋白的表达也能增加拟南芥中基因定点***的效率^[21,22]。

目前为止还没有在植物上通过化合物提高基因替换效率的相关报道。我们用实验验证了两种化合物SCR7和RS-1都可以不同程度地提高水稻基因替换编辑的效率。

发明内容

在一个方面，本发明涉及化合物SCR7或RS-1用于增加在水稻基因编辑中的等位基因替换效率的用途。在一个优选的实施方案中，所采用的化合物SCR7的浓度为1-20μM，优选地2μM、5μM或10μM。在另一个优选的实施方案中，所采用的化合物RS-1的浓度为5-20μM，优选地7.5μM或15μM。在一个进一步优选的实施方案中，在水稻细胞，优选地水稻愈伤细胞的转化过程中，优选地在转化的侵染和共培养阶段，使用化合物SCR7或RS-1。在一个更进一步优选的实施方案中，所述转化为瞬时转化或稳定转化。

在另一个方面，本发明涉及用于增加在水稻基因编辑中的等位基因替换效率的方法，其包括将水稻细胞，优选地水稻愈伤细胞，与化合物SCR7或RS-1相接触，优选地在转化过程中，更优选地在转化的侵染和共培养阶段。在一个优选的实施方案中，所采用的化合物SCR7的浓度为1-20μM，优选地2μM、5μM或10μM。在另一个优选的实施方案中，所采用的化合物RS-1的浓度为5-20μM，优选地7.5μM或15μM。在一个进一步优选的实施方案中，所述转化为瞬时转化或稳定转化。

特别地，在本发明的技术方案的实施中使用载体23172和/或载体23691。

附图说明

图1显示了23172载体图谱。

图2显示了23172载体T-DNA区域示意图。

图3显示了23172载体上供体(donor)替换部分突变序列。

图4显示了GUUS报告***载体23691载体图谱。

图5显示了GUUS报告***23691载体T-DNA示意图。

图6显示了GUS染色蓝色斑点计数结果。

图7显示了化合物SCR7的化学结构式。

图8显示了化合物RS-1的化学结构式。

序列表信息

SEQ ID NO:1为pr35S(35S启动子序列)。

SEQ ID NO:2为cCas9(Cas9基因序列)。

SEQ ID NO:3为tNos(Nos终止子序列)。

SEQ ID NO:4为prOsU6(水稻U6启动子序列)。

SEQ ID NO:5为gRNA(水稻ALS向导RNA序列，含靶标序列)，其中第1-19位核苷酸为gRNA靶标序列。

SEQ ID NO:6为prZmUbi(玉米Ubi启动子序列)。

SEQ ID NO:7为cPMI(筛选标记PMI序列)。

SEQ ID NO:8为供体DNA(供体片段)，其中第401-426位核苷酸为目标替换序列，两边的为左右臂序列，替换序列上的突变见图3。

SEQ ID NO:9为prCMP(CMP启动子序列)。

SEQ ID NO:10为GUUS-GU(GUUS***GU部分序列)。

SEQ ID NO:11为GUUS-US(GUUS***US部分序列)。

SEQ ID NO:12为xOsALS(水稻ALS靶标序列含PAM)，其中最后三个核苷酸“ggg”为PAM序列。

SEQ ID NO:13为cPAT(筛选标记PAT序列)。

SEQ ID NO:14为t35s(35s终止子序列)。

SEQ ID NO:15为引物MV5610。

SEQ ID NO:16为引物MV5621。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.应用化学试剂对水稻GUUS瞬时转化报告***和稳定转化***中的基因替换概率进行验证

1.材料与方法

1.1.双元载体构建

实验中用到的23172载体所含的SpCas9表达盒的各个元件，用于基因替换的供体序列，以及水稻ALS基因的sgRNA表达盒的各个元件均由金斯瑞(GenScript)进行合成，载体的构建方法采用标准的酶切连接的方法。该载体含有的6-磷酸甘露糖异构酶基因表达盒作为植物中的筛选标记。水稻U3和U6启动子序列参考文献^[23]。

实验中用到的GUUS^[24]报告载体23691所含的各个元件，以及含有的SpCas9目标序列(包含水稻ALS基因sgRNA的目标序列)均在金斯瑞(GenScript)进行合成，载体的构建方法采用标准的酶切连接的方法。该载体含有的草丁膦-N-乙酰转移酶基因表达盒作为植物中的筛选标记。

1.2.水稻的农杆菌转化

实验中水稻转化品种为IR58025B，采用农杆菌转化方法，具体操作见参考文献^[25]。

1.2.1.GUUS报告***瞬时转化

GUUS报告***载体23691和含有SpCas9的载体23172共转化水稻愈伤细胞。在转化的侵染和共培养阶段加入不同浓度的SCR7和RS-1。

1.2.2.稳定转化

含有SpCas9的载体23172转化水稻愈伤细胞，在转化的侵染和共培养阶段加入SCR7和RS-1。

1.3.水稻GUUS报告***中基因替换概率的检测方法

GUUS基因包含水稻ALS基因sgRNA的目标序列，它作为目标基因被SpCas9识别后发生DNA断裂，GUUS通过SSA修复途径被修复为GUS，可以认定为水稻愈伤细胞发生基因替换，GUS经过染色会显蓝色，采用蓝色斑点计数的方法进行计数。

1.4.水稻稳定转化***中基因替换概率的检测方法

选择水稻中的ALS基因作为目标基因进行编辑，用于基因替换的供体含有已突变的目标序列。设计引物，特异性的扩增水稻ALS基因目的区域的序列，采用Sanger测序方法对T0代转基因植株进行检测。基因替换的植株除了目标位点是双峰，其余均为单峰。所用到的引物序列如表1。

表1：水稻ALS基因引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		MV5610	cgtgcgcgccGAAGATGCTCGATACCCCAG
MV5621	CAAGGAGAGTACTTCGTGTGATGAC

2.实验结果

2.1.水稻GUUS瞬时转化***中的基因替换概率

本实验设计选取不同浓度的SCR7(2μM，5μM，10μM)和RS-1(7.5μM，15μM)，添加在转化的侵染和共培养阶段，经过GUS染色实验后进行蓝色斑点计数。结果表明SCR7 5/10μM和RS-1 15μM处理后的蓝色斑点数显著增加。结果如下显示在图3中，其中“CK”为对照。

2.2.水稻稳定转化***中的基因替换概率

本实验设计选取了10μM的SCR7和15μM的RS-1，添加在转化的侵染和共培养阶段，对转化植株进行Sanger测序。结果表明SCR710μM和RS-1 15μM处理后基因替换效率均有所增加(参见表2)。

表2

3.讨论

本研究主要针对基因替换效率在植物中较低的问题，通过在水稻转化过程中添加化学试剂进行了优化。在瞬时转化体系中，通过在侵染和共培养阶段的化学试剂的添加，两种化学物质使基因替换的概率都有所提高，10μM SCR7使重组概率提高了2倍左右，和15μMRS-1使重组概率也提高2倍左右。在转化农杆菌稳定转化中，在侵染和共培养阶段添加10μMSCR7和15μM RS-1，通过对比试验表明，在添加15μM RS-1转化体系中基因替换概率为0.36％，是不添加化学试剂对照0.16％的2.25倍，而添加10μM SCR7在转化体系中效果不明显。通过在转化体系中添加15μM RS-1，可以显著提高水稻中基因编辑替换的效率。

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序列表

<110> 先正达参股股份有限公司(Syngenta Participations AG)

先正达生物科技（中国）有限公司(Syngenta Biotechnology China Co., Ltd.)

<120> 化学试剂增加水稻等位基因替换编辑效率

<130> 81775-CN-REG-ORG-NAT-1

<141> 2019-01-24

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pr35S（35S启动子序列）

<400> 1

agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttca 60

tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacttg gtggagcacg 120

acacgctagt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggcaattg 180

agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 240

gtcacttaat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 300

ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 360

cacccacgag gagcatcgtg gtaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 420

attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 480

acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag g 521

<210> 2

<211> 4170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cCas9（Cas9基因序列）

<400> 2

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atcaccgacg agtacaaggt gccgagcaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgacagg 120

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gccaccaggc tgaagaggac cgccaggagg aggtacacca ggaggaagaa caggatctgc 240

tacctgcagg agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacagg 300

ctggaggaga gcttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agaggcaccc gatcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccga ccatctacca cctgaggaag 420

aagctggtgg acagcaccga caaggccgac ctgaggctga tctacctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tcaggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaacccgga caacagcgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccg 600

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgagcg ccaggctgag caagagcagg 660

aggctggaga acctgatcgc ccagctgccg ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720

ctgatcgccc tgagcctggg cctgaccccg aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780

gacgccaagc tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgag cgacgccatc 900

ctgctgagcg acatcctgag ggtgaacacc gagatcacca aggccccgct gagcgccagc 960

atgatcaaga ggtacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgagg 1020

cagcagctgc cggagaagta caaggagatc ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080

ggctacatcg acggcggcgc cagccaggag gagttctaca agttcatcaa gccgatcctg 1140

gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga acagggagga cctgctgagg 1200

aagcagagga ccttcgacaa cggcagcatc ccgcaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260

gccatcctga ggaggcagga ggacttctac ccgttcctga aggacaacag ggagaagatc 1320

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aacctgccga acgagaaggt gctgccgaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

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agcggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaacag gaaggtgacc 1680

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agcggcgtgg aggacaggtt caacgccagc ctgggcacct accacgacct gctgaagatc 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaacgag gagaacgagg acatcctgga ggacatcgtg 1860

ctgaccctga ccctgttcga ggacagggag atgatcgagg agaggctgaa gacctacgcc 1920

cacctgttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagagga ggaggtacac cggctggggc 1980

aggctgagca ggaagctgat caacggcatc agggacaagc agagcggcaa gaccatcctg 2040

gacttcctga agagcgacgg cttcgccaac aggaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacct tcaaggagga catccagaag gcccaggtga gcggccaggg cgacagcctg 2160

cacgagcaca tcgccaacct ggccggcagc ccggccatca agaagggcat cctgcagacc 2220

gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggcaggc acaagccgga gaacatcgtg 2280

atcgagatgg ccagggagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaacag cagggagagg 2340

atgaagagga tcgaggaggg catcaaggag ctgggcagcc agatcctgaa ggagcacccg 2400

gtggagaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

gacatgtacg tggaccagga gctggacatc aacaggctga gcgactacga cgtggaccac 2520

atcgtgccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtgct gaccaggagc 2580

gacaagaaca ggggcaagag cgacaacgtg ccgagcgagg aggtggtgaa gaagatgaaa 2640

aactactgga ggcagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agaggaagtt cgacaacctg 2700

accaaggccg agaggggcgg cctgagcgag ctggacaagg ccggcttcat taaaaggcag 2760

ctggtggaga ccaggcagat caccaagcac gtggcccaga tcctggacag caggatgaac 2820

accaagtacg acgagaacga caagctgatc agggaggtga aggtgatcac cctgaagagc 2880

aagctggtga gcgacttcag gaaggacttc cagttctaca aggtgaggga gatcaataat 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gattaaaaag 3000

tacccgaagc tggagagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgaggaag 3060

atgatcgcca agagcgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat caggaagagg 3180

ccgctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg cagggacttc 3240

gccaccgtga ggaaggtgct gtccatgccg caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300

cagaccggcg gcttcagcaa ggagagcatc ctgccgaaga ggaacagcga caagctgatc 3360

gccaggaaga aggactggga tccgaagaag tacggcggct tcgacagccc gaccgtggcc 3420

tacagcgtgc tggtggtggc caaggtggag aagggcaaga gcaagaagct gaagagcgtg 3480

aaggagctgg tgggcatcac catcatggag aggagcagct tcgagaagaa cccagtggac 3540

ttcctggagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcattaa actgccgaag 3600

tacagcctgt tcgagctgga gaacggcagg aagaggatgc tggccagcgc cggcgagctg 3660

cagaagggca acgagctggc cctgccgagc aagtacgtga acttcctgta cctggccagc 3720

cactacgaga agctgaaggg cagcccggag gacaacgagc agaagcagct gttcgtggag 3780

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttcag caagagggtg 3840

atcctggccg acgccaacct ggacaaggtg ctgagcgcct acaacaagca cagggacaag 3900

ccgatcaggg agcaggccga gaacatcatc cacctgttca ccctgaccaa cctgggcgcc 3960

ccggccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgacagga agaggtacac cagcaccaag 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gaccaggatc 4080

gacctgagcc agctgggcgg cgacagcagc ccgccgaaga agaagaggaa ggtgagctgg 4140

aaggacgcca gcggctggag caggatgtga 4170

<210> 3

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tNos（Nos终止子序列）

<400> 3

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 4

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> prOsU6（水稻U6启动子序列）

<400> 4

tttgtgaaag ttgaattacg gcatagccga aggaataaca gaatcgtttc acactttcgt 60

aacaaaggtc ttcttatcat gtttcagacg atggaggcaa ggctgatcaa agtgatcaag 120

cacataaacg cattttttta ccatgtttca ctccataagc gtctgagatt atcacaagtc 180

acgtctagta gtttgatggt acactagtga caatcagttc gtgcagacag agctcatact 240

tgactacttg agcgattaca ggcgaaagtg tgaaacgcat gtgatgtggg ctgggaggag 300

gagaatatat actaatgggc cgtatcctga tttgggctgc gtcggaaggt gcagcccacg 360

cgcgccgtac cgcgcgggtg gcgctgctac ccactttagt ccgttggatg gggatccgat 420

ggtttgcgcg gtggcgttgc gggggatgtt tagtaccaca tcggaaaccg aaagacgatg 480

gaaccagctt ataaacccgc gcgctgtagt cagctt 516

<210> 5

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA（水稻ALS向导RNA序列，含靶标序列）

<400> 5

tgcctatgat cccaagtggg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tttt 104

<210> 6

<211> 1993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> prZmUbi（玉米Ubi启动子序列）

<400> 6

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020

ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380

tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980

gttacttctg cag 1993

<210> 7

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cPMI（筛选标记PMI序列）

<400> 7

atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact 60

gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca 120

catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat 180

gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa 240

ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccac tctccattca ggttcatcca 300

aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat 360

gccgccgagc gtaactataa agatcctaac cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg 420

cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa ttttccgaga ttgtctccct actccagccg 480

gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac tttttacaac agcctgatgc cgaacgttta 540

agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg 600

attttaaaat cggccctcga tagccagcag ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt 660

tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg ttctccccgc tattgctgaa tgtggtgaaa 720

ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc 780

gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaaa 840

tacattgata ttccggaact ggttgccaat gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag 900

ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca gaactggact tcccgattcc agtggatgat 960

tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc 1020

gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca acgttgtgga aaggttctca gcagttacag 1080

cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc 1140

cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaa 1176

<210> 8

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 供体DNA（供体片段）

<400> 8

tttgggctgc ctgctgcagc tggtgcttct gtggctaacc caggtgtcac agttgttgat 60

attgatgggg atggtagctt cctcatgaac attcaggagt tggcattgat ccgcattgag 120

aacctcccgg tgaaggtgat ggtgttgaac aaccaacatt tgggtatggt tgtgcaatgg 180

gaggataggt tttacaaggc aaatagggcg catacatact tgggcaaccc agaatgtgag 240

agtgagatat atccagattt tgtgactatt gctaaagggt tcaatattcc tgcagtccgt 300

gtaacaaaga agagtgaagt ccgtgccgcc atcaagaaga tgctcgatac cccagggcca 360

tacttgttgg atatcatcgt cccacaccag gagcatgtgc tgcctatgat tcctattggc 420

ggcgccttca aggacatgat cctggatggt gatggcagga ctgtgtatta atctataatc 480

tgtatgttgg caaagcacca gcccggccta tgtttgacct gaatgaccca taaagagtgg 540

tatgcctatg atgtttgtat gtgctctatc aataactaag gtgtcaacta tgaaccatat 600

ggtcttctgt tttacttgtt tgatgtgctt ggcatggtaa tcctaattag cttcctgctg 660

tctaggtttg tagtgtgttg ttttccgtag gcatatgcat cacaagatat catgtaagtt 720

tcttgtccta catatcaata atgagaataa agtacttcta tgcaatagct ctgagttaag 780

tgtttcaaca atttctgaac ttatgtttgc tcagcactca gc 822

<210> 9

<211> 397

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> prCMP（CMP启动子序列）

<400> 9

tggcagacaa agtggcagac atactgtccc acaaatgaag atggaatctg taaaagaaaa 60

cgcgtgaaat aatgcgtctg acaaaggtta ggtcggctgc ctttaatcaa taccaaagtg 120

gtccctacca cgatggaaaa actgtgcagt cggtttggct ttttctgacg aacaaataag 180

attcgtggcc gacaggtggg ggtccaccat gtgaaggcat cttcagactc caataatgga 240

gcaatgacgt aagggcttac gaaataagta agggtagttt gggaaatgtc cactcacccg 300

tcagtctata aatacttagc ccctccctca ttgttaaggg agcaaaatct cagagagata 360

gtcctagaga gagaaagaga gcaagtagcc tagaagt 397

<210> 10

<211> 1507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GUUS-GU（GUUS***GU部分序列）

<400> 10

atggtacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60

ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120

gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180

cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240

ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300

aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360

tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420

cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480

ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540

aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 600

tctgttgact ggcaggtacc aagctgcgaa tcttcgtttt tttaaggaat tctcgatctt 660

tatggtgtat aggctctggg ttttctgttt tttgtatctc ttaggatttt gtaaattcca 720

gatctttcta tggccactta gtagtatatt tcaaaaattc tccaatcgag ttcttcattc 780

gcattttcag tcattttctc ttcgacgttg tttttaagcc tgggtattac tcctatttag 840

ttgaactctg cagcaatctt agaaaattag ggttttgagg tttcgatttc tctaggtaac 900

cgatctattg cattcatctg aatttctgca tatatgtctt agatttctga taagcttacg 960

atacgttagg tgtaattgaa gtttattttt caagagtgtt attttttgtt tctgaatttt 1020

tcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt gatgcggatc aacaggtggt 1080

tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg aatccgcacc tctggcaacc 1140

gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa agccagacag agtgtgatat 1200

ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag ggcgaacagt tcctgattaa 1260

ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa gatgcggact tgcgtggcaa 1320

aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta atggactgga ttggggccaa 1380

ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg ctcgactggg cagatgaaca 1440

tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt aacctctctt taggcattgg 1500

tttcgaa 1507

<210> 11

<211> 1606

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GUUS-US（GUUS***US部分序列）

<400> 11

gtaccaagct gcgaatcttc gtttttttaa ggaattctcg atctttatgg tgtataggct 60

ctgggttttc tgttttttgt atctcttagg attttgtaaa ttccagatct ttctatggcc 120

acttagtagt atatttcaaa aattctccaa tcgagttctt cattcgcatt ttcagtcatt 180

ttctcttcga cgttgttttt aagcctgggt attactccta tttagttgaa ctctgcagca 240

atcttagaaa attagggttt tgaggtttcg atttctctag gtaaccgatc tattgcattc 300

atctgaattt ctgcatatat gtcttagatt tctgataagc ttacgatacg ttaggtgtaa 360

ttgaagttta tttttcaaga gtgttatttt ttgtttctga atttttcagg tggtggccaa 420

tggtgatgtc agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg 480

cactagcggg actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct 540

ctatgaactg tgcgtcacag ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt 600

cggcatccgg tcagtggcag tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta 660

ctttactggc tttggtcgtc atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt 720

gctgatggtg cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc 780

gcattaccct tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat 840

tgatgaaact gctgctgtcg gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa 900

caagccgaaa gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt 960

acaggcgatt aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag 1020

tattgccaac gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc 1080

ggaagcaacg cgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg 1140

cgacgctcac accgatacca tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta 1200

cggatggtat gtccaaagcg gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact 1260

tctggcctgg caggagaaac tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac 1320

gttagccggg ctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg 1380

gctggatatg tatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg 1440

gaatttcgcc gattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg 1500

gatcttcact cgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac 1560

tggcatgaac ttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caatga 1606

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xOsALS（水稻ALS靶标序列含PAM）

<400> 12

tgcctatgat cccaagtggg gg 22

<210> 13

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cPAT（筛选标记PAT序列）

<400> 13

atgtctccag agagaaggcc agttgagatt agacctgcta ctgcggccga tatggcagct 60

gtttgtgata ttgttaacca ttatattgag acttctactg ttaacttcag aactgagcca 120

caaactcctc aagagtggat tgatgatctt gagagacttc aagatagata cccttggctt 180

gttgctgagg ttgagggagt tgttgctgga attgcttatg ctggaccttg gaaggctaga 240

aacgcttatg attggactgt tgagtctact gtttatgttt ctcatagaca tcaaagactt 300

ggacttggat ctactcttta tactcatctt cttaagtcta tggaggctca aggattcaag 360

tctgttgttg ctgttattgg acttccaaac gatccatctg ttagacttca tgaggctctt 420

ggatatactg ctagaggaac tcttagagct gctggatata agcatggagg atggcatgat 480

gttggattct ggcaaagaga tttcgagctt ccagctccac caagaccagt tagaccagtt 540

actcaaattt ga 552

<210> 14

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> t35s（35s终止子序列）

<400> 14

cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac 60

caaaatccag 70

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物MV5610

<400> 15

cgtgcgcgcc gaagatgctc gataccccag 30

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物MV5621

<400> 16

caaggagagt acttcgtgtg atgac 25

Claims (9)

1.化合物SCR7或RS-1用于增加在水稻基因编辑中的等位基因替换效率的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所采用的化合物SCR7的浓度为1-20μM，优选地2μM、5μM或10μM。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所采用的化合物RS-1的浓度为5-20μM，优选地7.5μM或15μM。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中在水稻细胞，优选地水稻愈伤细胞的转化过程中，优选地在转化的侵染和共培养阶段，使用化合物SCR7或RS-1。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述转化为瞬时转化或稳定转化。

6.用于增加在水稻基因编辑中的等位基因替换效率的方法，其包括将水稻细胞，优选地水稻愈伤细胞，与化合物SCR7或RS-1相接触，优选地在转化过程中，更优选地在转化的侵染和共培养阶段。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所采用的化合物SCR7的浓度为1-20μM，优选地2μM、5μM或10μM。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所采用的化合物RS-1的浓度为5-20μM，优选地7.5μM或15μM。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述转化为瞬时转化或稳定转化。