CN109810938A - 一种人***上皮细胞分离与培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人***上皮细胞分离与培养方法，采集的***样本经多重消化、分散和筛选，可有效去除其他组织、获得高度纯化的样本；原代培养基中加入霍乱毒素和激素，可以有效提高细胞活性、促进细胞生长，从而获得优质的原代细胞；传代培养基中添加的尿囊素、肌酸和荭草苷可以有效提高细胞活力和***能力，从而促进细胞生长和增殖；将3T3细胞作为滋养层，可以为原代***上皮细胞提供良好的生长基底，有效促进***上皮细胞的生长***，从而大大提高培养效果。通过上述方法，可以显著提高***上皮细胞的活性和增值速率，从而为相关研究项目提供优质的实验材料。

Description

一种人***上皮细胞分离与培养方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，特别涉及一种人***上皮细胞分离与培养方法。

背景技术

***是***附属腺中最大的实质性器官。慢性***炎、***增生与***癌均是男性生殖***的常见疾病，发病机制十分复杂，目前临床上尚未出现效果突出的治疗方法。对上述疾病治疗方法的研究均需要深入探索其发病机理。刚离体的原代细胞保留有原有的生物学遗传特性，能反映体内细胞生长的一般特征，因此适用于药物及疗法等研究。建立正常***上皮细胞及病变的***上皮细胞的体外细胞模型，有利于更好地了解***上皮细胞的病理改变，较动物实验而言也更为简便、可靠。但目前对***上皮细胞的体外培养尚不成熟。因此，探索一种能提高***上皮细胞活性和增殖能力的体外培养方法，已成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人***上皮细胞分离与培养方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种人***上皮细胞分离与培养方法，包括如下步骤：

S1：样品采集和分离：采集***叶标本，去除脂肪组织，得到***上皮组织；

S2：向所述***上皮组织中加入添加有双抗的消化液，进行第一阶段消化，同时剪碎成小块；将剪碎的小块转移至培养瓶中，添加消化液，进行第二阶段消化，得到分散的***上皮细胞；

S3：用分散液将细胞溶解分散，依次用253μm、150μm、100μm、41μm的尼龙网过筛，并用分散液收集筛网上的残留物，得到分散的***上皮细胞；

S4：原代培养：用原代培养液将残留物的细胞浓度调整至4×10⁶个/ml，置于二氧化碳培养箱中进行培养，得到原代细胞；

S5：传代培养：将所述原代细胞以每瓶10⁴个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3T3细胞作滋养层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞。

将3T3细胞作为滋养层，可以为原代***上皮细胞提供良好的生长基底；将原代***上皮细胞接种于其上之后，***上皮细胞能明显抑制3T3细胞的生长，且自身生长良好，并将3T3细胞不断推至培养皿边缘。通过上述方法，可以有效促进***上皮细胞的生长***，从而大大提高培养效果。

进一步地，步骤S2的具体方法如下：

S2.1：向所述***上皮组织中加入添加有双抗的消化液，进行第一阶段消化，同时剪碎成小块、使之可通过14号导管；

S2.2：将剪碎的小块转移至培养瓶中，按照每0.1g组织1ml的比例添加消化液，置于37℃震荡水浴箱中培养1h，进行第二阶段消化；

S2.3：消化结束后在100g条件下离心5min，收集得到分散的***上皮细胞。

进一步地，步骤S4的具体方法如下：

S4.1：用WAJC414培养液收集对所述***上皮细胞进行重悬，将细胞浓度调整至4×10⁶个/ml；

S4.2：在24孔培养板的每一孔中分别接种2×10⁵个细胞，并加入20倍体积的原代培养液，置于二氧化碳培养箱中进行培养，培养条件为37℃、5％CO₂+95％空气，培养7～15天后，即得到原代细胞。

进一步地，步骤S5的具体方法如下：

S5.1：用PBS缓冲液对所述原代细胞进行洗涤，并用消化液进行消化，消化结束后，用培养液悬浮细胞并计数；按照每瓶10⁴个的接种量接种到新的培养瓶中；

S5.2：加入5～10倍数量的经过Co60照射的3T3细胞，混合均匀后加入传代培养液，置于37℃下培养15～30天，即得到传代细胞。

Co60照射可以使3T3细胞丧失***能力，同时不影响原有细胞的活性，从而为原代***细胞提供性质优异的滋养层。

进一步地，3T3细胞的处理方法如下：

(1)用含有10％小牛血清的DMEM培养基培养3T3细胞，48h后更换培养液，继续培养15～30天；

(2)通过60Gy Co60照射、对3T3细胞进行灭活；

(3)用所述消化液对灭活的3T3细胞进行消化，用含有10％小牛血清的DMEM培养基清洗两次，并进行混悬。

进一步地，所述消化液为添加有675U/ml胶原酶的0.02％EDTA；所述双抗为100U/ml青霉素和100μg/ml的卡那霉素。

青霉素和卡那霉素两种广谱抗生素作用机理不同，联合使用可以控制绝大部分常见细菌，从而有利于消化过程的顺利进行。

进一步地，所述分散液为含有5％血清的0.02％EDTA。

添加5％的血清可以为***上皮细胞提供充足的养分，从而提高收集的细胞的活性。

进一步地，所述原代培养液为添加有如下成分的WAJC414培养液：

霍乱毒素1ng/ml、***1μM、EGF 10ng/ml、青霉素100U/ml以及卡那霉素100μg/ml。

霍乱毒素可以有效促进细胞贴壁生长和增殖；***是一种肾上腺皮质激素，可以促进细胞代谢、提高细胞活性；青霉素和卡那霉素作为双抗可以控制绝大部分细菌，从而为***上皮细胞提供良好的生长环境。

进一步地，所述传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基：

乳酸钠格林8～12％、尿囊素1.5～2.5％、肌酸0.5～1％、荭草苷0.2～0.5％以及绿原酸0.1～0.2％。

乳酸钠格林为乳酸钠、氯化钠、氯化钾与氯化钙的灭菌水溶液，可用于提供接近人体的渗透压适中的环境，以利于细胞的存活；尿囊素可以促进细胞生长、软化角质蛋白，从而加快组织更新和伤口愈合；肌酸可以为细胞代谢快速提供能量、促进细胞生长和更新；荭草苷可有效提高细胞活力、抑制细胞凋亡；绿原酸具有优异的抗菌、抗病毒效果，并且能有效抗氧化、提升细胞活性。使用上述配比的传代培养液，可以有效提高细胞活力、促进细胞***，从而快速获得优质的传代细胞。

本发明的有益效果如下：本发明提供了一种人***上皮细胞分离与培养方法，采集的***样本经多重消化、分散和筛选，可有效去除其他组织、获得高度纯化的样本；原代培养基中加入霍乱毒素和激素，可以有效提高细胞活性、促进细胞生长，从而获得优质的原代细胞；传代培养基中添加的尿囊素、肌酸和荭草苷可以有效提高细胞活力和***能力，从而促进细胞生长和增殖；将3T3细胞作为滋养层，可以为原代***上皮细胞提供良好的生长基底，有效促进***上皮细胞的生长***，从而大大提高培养效果。通过上述方法，可以显著提高***上皮细胞的活性和增值速率，从而为相关研究项目提供优质的实验材料。

附图说明

图1为***上皮细胞的电镜照片；

图2为各组细胞培养物中PSA的检测水平；

图3为各组细胞培养物中PAP的检测水平；

图4为各组细胞培养物中AR的检测水平；

图5为采用不同方法对***上皮细胞进行培养的生长曲线。

具体实施方式

主要试剂及培养基的配制

A.WAJC414培养基：具体成分如下：

50g/mL胎牛血清、0.5mg/L胰岛素、20g/L霍乱毒素、0.392g/L***、10g/LEGF、100000IU/L青霉素以及100000IU/L链霉素。

B.PBS缓冲液：

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄,溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌(至少20min)，保存于室温或4℃冰箱中。

下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种人***上皮细胞分离与培养方法，包括如下步骤：

S1：样品采集和分离：采集***叶标本，去除脂肪组织，得到***上皮组织；

S2：向***上皮组织中加入添加有双抗的消化液，进行第一阶段消化，同时剪碎成小块；将剪碎的小块转移至培养瓶中，添加消化液，进行第二阶段消化，得到分散的***上皮细胞；

S3：用分散液将细胞溶解分散，依次用253μm、150μm、100μm、41μm的尼龙网过筛，并用分散液收集筛网上的残留物，得到分散的***上皮细胞；

S4：原代培养：用原代培养液将***上皮细胞的细胞浓度调整至4×10₆个/ml，置于二氧化碳培养箱中进行培养，得到原代细胞；

S5：传代培养：将原代细胞以每瓶10₄个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3T3细胞作滋养层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞。

实施例2

一种人***上皮细胞分离与培养方法，包括实施例1提供的各步骤，其中步骤S2的具体方法如下：

S2.1：向***上皮组织中加入添加有双抗的消化液，进行第一阶段消化，同时剪碎成小块、使之可通过14号导管；

S2.2：用注射器和14号导管将剪碎的小块转移至25cm²培养瓶中，按照每0.1g组织1ml的比例添加消化液，置于37℃震荡水浴箱中培养1h，进行第二阶段消化；

S2.3：100g离心5min，收集得到分散的***上皮细胞。

步骤S3的具体方法如下：

用分散液将细胞重新分散，依次用253、150、100、41μm的尼龙网过筛，每次过滤后都用5ml分散液冲洗筛网，收集冲洗筛网的分散液并进行离心，得到分散的***上皮细胞；其中采用的分散液为含有5％血清的0.02％EDTA。

步骤S4的具体方法如下：

S4.1：用WAJC414培养液收集对***上皮细胞进行重悬，将细胞浓度调整至4×10⁶个/ml；

S4.2：在24孔培养板的每一孔中分别接种50μl(2×10⁵个细胞)，并加入20倍体积(1ml)的原代培养液，置于二氧化碳培养箱中进行培养，培养条件为37℃、5％CO₂+95％空气，培养7～15天后，即得到原代细胞。

步骤S5的具体方法如下：

S5.1：用PBS缓冲液对原代细胞进行洗涤，并用消化液进行消化；消化结束后，用培养液悬浮细胞并计数；按照每瓶10⁴个的接种量接种到新的培养瓶中；

S4.2：加入5～10倍数量的经过Co60照射的3T3细胞，混合均匀后加入培养液，置于37℃下培养15～30天，即得到传代细胞。

其中，3T3细胞的处理方法如下：

(1)用含有10％小牛血清的DMEM培养基培养3T3细胞，48h后更换培养液，继续培养15～30天；

(2)通过60Gy Co60照射、对3T3细胞进行灭活；

(3)用消化液对灭活的3T3细胞进行消化，用含有10％小牛血清的DMEM培养基清洗两次，并进行混悬。

实施例3

一种人***上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2提供的各步骤，其中采用的消化液为添加有675U/ml胶原酶的0.02％EDTA；所述双抗为100U/ml青霉素和100μg/ml的卡那霉素。

实施例4

一种人***上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的原代培养液为添加有如下成分的WAJC414培养液：

霍乱毒素1ng/ml、***1μM、EGF 10ng/ml、青霉素100U/ml以及卡那霉素100μg/ml。

实施例5

一种***上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基：

乳酸钠格林8％、尿囊素2.5％、肌酸0.5％、荭草苷0.2％以及绿原酸0.2％。

实施例6

一种***上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的消化液为添加有675U/ml胶原酶的0.02％EDTA；所述双抗为100U/ml青霉素和100μg/ml的卡那霉素；

采用的原代培养液为添加有如下成分的WAJC414培养液：

霍乱毒素1ng/ml、***1μM、EGF 10ng/ml、青霉素100U/ml以及卡那霉素100μg/ml；

采用的传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基：

乳酸钠格林12％、尿囊素1.5％、肌酸1％、荭草苷0.5％以及绿原酸0.1％。

对照例1

一种***上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基：

乳酸钠格林8％、尿囊素2.5％、肌酸0.5％以及绿原酸0.2％

对照例2

一种***上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基：

乳酸钠格林12％、胎牛血清3％、荭草苷0.5％以及绿原酸0.1％。

对照例3

一种***上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的传代培养液为添加有10％胎牛血清的DMEM培养基。

实验例

染色鉴定

分别采用实施例2、4、5、6提供的方法为实验组1～4，以对照例1～3提供的方法分别作为对照组1～3，并以石晓宇等(3D悬滴培养法对***上皮细胞中一些活性因子表达的影响.南开大学学报(自然科学版),2017,50(4):35-40)提供的培养方法作为对照组4，分别对同一来源的***上皮组织标本进行培养，培养结束后对泛细胞角蛋白抗体进行染色，并在电镜下进行观察，结果如图1所示。

电镜结果显示，各组细胞的角蛋白阳性率达到90％以上，证明各组细胞均为上皮源性，即***上皮细胞。

指标检测

根据石晓宇等提供的方法，从各组细胞的培养基中进行取样，分别测定***特异性抗原(PSA)、***酸性磷酸酶(PAP)以及雄激素核受体(AR)的表达情况，结果如图2～4所示，实验组各组的各项指标整体高于对照组各组，其中与实验组4最高，表明本申请提供的方法可以有效提高***上皮细胞的活性。

生长曲线

用96孔板对各组细胞进行传代培养，采用CCK-8法分别为各组细胞绘制生长曲线，取样时间分别为传代培养的第1、2、3、5、7、10、15d，结果如图5所示。

由曲线可知，实验组各组的细胞数量和增速均高于对照组各组，其中以实验组4的增殖活性最高，表明本申请提供的方法可以显著提高***上皮细胞的生殖活性，特别以实验组4(即实施例6)提供的方法最佳。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：样品采集和分离：采集***叶标本，去除脂肪组织，得到***上皮组织；

S2：向所述***上皮组织中加入添加有双抗的消化液，进行第一阶段消化，同时剪碎成小块；将剪碎的小块转移至培养瓶中，添加消化液，进行第二阶段消化，得到分散的***上皮细胞；

S3：用分散液将细胞溶解分散，依次用253μm、150μm、100μm、41μm的尼龙网过筛，并用分散液收集筛网上的残留物，得到分散的***上皮细胞；

S4：原代培养：用原代培养液将***上皮细胞的细胞浓度调整至4×10⁶个/ml，置于二氧化碳培养箱中进行培养，得到原代细胞；

S5：传代培养：将所述原代细胞以每瓶10⁴个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3T3细胞作滋养层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞。

2.如权利要求1所述的人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S2的具体方法如下：

S2.1：向所述***上皮组织中加入添加有双抗的消化液，进行第一阶段消化，同时剪碎成小块；

S2.2：将剪碎的小块转移至培养瓶中，按照每0.1g组织1ml的比例添加消化液，置于37℃震荡水浴箱中培养1h，进行第二阶段消化；

S2.3：消化结束后在100g条件下离心5min，收集得到分散的***上皮细胞。

3.如权利要求1所述的人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S4的具体方法如下：

S4.1：用WAJC414培养液对所述***上皮细胞进行重悬，将细胞浓度调整至4×10⁶个/ml；

S4.2：在24孔培养板的每一孔中分别接种2×10⁵个细胞，并加入20倍体积的原代培养液，置于二氧化碳培养箱中进行培养，培养条件为37℃、5％CO₂+95％空气，培养7～15天后，即得到原代细胞。

4.如权利要求1所述的人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S5的具体方法如下：

S5.1：用PBS缓冲液对所述原代细胞进行洗涤，并用消化液进行消化，消化结束后，用培养液悬浮细胞并计数；按照每瓶10⁴个的接种量接种到新的培养瓶中；

S5.2：加入5～10倍数量的经过Co60照射的3T3细胞，混合均匀后加入传代培养液，置于37℃下培养15～30天，即得到传代细胞。

5.如权利要求4所述的人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，3T3细胞的处理方法如下：

(1)用含有10％小牛血清的DMEM培养基培养3T3细胞，48h后更换培养液，继续培养15～30天；

(2)通过60Gy Co60照射、对3T3细胞进行灭活；

(3)用所述消化液对灭活的3T3细胞进行消化，用含有10％小牛血清的DMEM培养基清洗两次，并进行混悬。

6.如权利要求1～5中任一项所述的人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，所述消化液为添加有675U/ml胶原酶的0.02％EDTA；所述双抗为100U/ml青霉素和100μg/ml的卡那霉素。

7.如权利要求1～5中任一项所述的人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，所述分散液为含有5％血清的0.02％EDTA。

8.如权利要求1～5中任一项所述的人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，所述原代培养液为添加有如下成分的WAJC414培养液：

霍乱毒素1ng/ml、***1μM、EGF 10ng/ml、青霉素100U/ml以及卡那霉素100μg/ml。

9.如权利要求1～5中任一项所述的人***上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，所述传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基：

乳酸钠格林8～12％、尿囊素1.5～2.5％、肌酸0.5～1％、荭草苷0.2～0.5％以及绿原酸0.1～0.2％。