CN109810938A - 一种人***上皮细胞分离与培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人***上皮细胞分离与培养方法,采集的***样本经多重消化、分散和筛选,可有效去除其他组织、获得高度纯化的样本;原代培养基中加入霍乱毒素和激素,可以有效提高细胞活性、促进细胞生长,从而获得优质的原代细胞;传代培养基中添加的尿囊素、肌酸和荭草苷可以有效提高细胞活力和***能力,从而促进细胞生长和增殖;将3T3细胞作为滋养层,可以为原代***上皮细胞提供良好的生长基底,有效促进***上皮细胞的生长***,从而大大提高培养效果。通过上述方法,可以显著提高***上皮细胞的活性和增值速率,从而为相关研究项目提供优质的实验材料。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域,特别涉及一种人***上皮细胞分离与培养方法。
背景技术
***是***附属腺中最大的实质性器官。慢性***炎、***增生与***癌均是男性生殖***的常见疾病,发病机制十分复杂,目前临床上尚未出现效果突出的治疗方法。对上述疾病治疗方法的研究均需要深入探索其发病机理。刚离体的原代细胞保留有原有的生物学遗传特性,能反映体内细胞生长的一般特征,因此适用于药物及疗法等研究。建立正常***上皮细胞及病变的***上皮细胞的体外细胞模型,有利于更好地了解***上皮细胞的病理改变,较动物实验而言也更为简便、可靠。但目前对***上皮细胞的体外培养尚不成熟。因此,探索一种能提高***上皮细胞活性和增殖能力的体外培养方法,已成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种人***上皮细胞分离与培养方法。
本发明具体技术方案如下:
本发明提供了一种人***上皮细胞分离与培养方法,包括如下步骤:
S1:样品采集和分离:采集***叶标本,去除脂肪组织,得到***上皮组织;
S2:向所述***上皮组织中加入添加有双抗的消化液,进行第一阶段消化,同时剪碎成小块;将剪碎的小块转移至培养瓶中,添加消化液,进行第二阶段消化,得到分散的***上皮细胞;
S3:用分散液将细胞溶解分散,依次用253μm、150μm、100μm、41μm的尼龙网过筛,并用分散液收集筛网上的残留物,得到分散的***上皮细胞;
S4:原代培养:用原代培养液将残留物的细胞浓度调整至4×106个/ml,置于二氧化碳培养箱中进行培养,得到原代细胞;
S5:传代培养:将所述原代细胞以每瓶104个细胞的浓度进行接种,采用经过照射的3T3细胞作滋养层,加入传代培养液进行悬浮培养,得到传代细胞。
将3T3细胞作为滋养层,可以为原代***上皮细胞提供良好的生长基底;将原代***上皮细胞接种于其上之后,***上皮细胞能明显抑制3T3细胞的生长,且自身生长良好,并将3T3细胞不断推至培养皿边缘。通过上述方法,可以有效促进***上皮细胞的生长***,从而大大提高培养效果。
进一步地,步骤S2的具体方法如下:
S2.1:向所述***上皮组织中加入添加有双抗的消化液,进行第一阶段消化,同时剪碎成小块、使之可通过14号导管;
S2.2:将剪碎的小块转移至培养瓶中,按照每0.1g组织1ml的比例添加消化液,置于37℃震荡水浴箱中培养1h,进行第二阶段消化;
S2.3:消化结束后在100g条件下离心5min,收集得到分散的***上皮细胞。
进一步地,步骤S4的具体方法如下:
S4.1:用WAJC414培养液收集对所述***上皮细胞进行重悬,将细胞浓度调整至4×106个/ml;
S4.2:在24孔培养板的每一孔中分别接种2×105个细胞,并加入20倍体积的原代培养液,置于二氧化碳培养箱中进行培养,培养条件为37℃、5%CO2+95%空气,培养7~15天后,即得到原代细胞。
进一步地,步骤S5的具体方法如下:
S5.1:用PBS缓冲液对所述原代细胞进行洗涤,并用消化液进行消化,消化结束后,用培养液悬浮细胞并计数;按照每瓶104个的接种量接种到新的培养瓶中;
S5.2:加入5~10倍数量的经过Co60照射的3T3细胞,混合均匀后加入传代培养液,置于37℃下培养15~30天,即得到传代细胞。
Co60照射可以使3T3细胞丧失***能力,同时不影响原有细胞的活性,从而为原代***细胞提供性质优异的滋养层。
进一步地,3T3细胞的处理方法如下:
(1)用含有10%小牛血清的DMEM培养基培养3T3细胞,48h后更换培养液,继续培养15~30天;
(2)通过60Gy Co60照射、对3T3细胞进行灭活;
(3)用所述消化液对灭活的3T3细胞进行消化,用含有10%小牛血清的DMEM培养基清洗两次,并进行混悬。
进一步地,所述消化液为添加有675U/ml胶原酶的0.02%EDTA;所述双抗为100U/ml青霉素和100μg/ml的卡那霉素。
青霉素和卡那霉素两种广谱抗生素作用机理不同,联合使用可以控制绝大部分常见细菌,从而有利于消化过程的顺利进行。
进一步地,所述分散液为含有5%血清的0.02%EDTA。
添加5%的血清可以为***上皮细胞提供充足的养分,从而提高收集的细胞的活性。
进一步地,所述原代培养液为添加有如下成分的WAJC414培养液:
霍乱毒素1ng/ml、***1μM、EGF 10ng/ml、青霉素100U/ml以及卡那霉素100μg/ml。
霍乱毒素可以有效促进细胞贴壁生长和增殖;***是一种肾上腺皮质激素,可以促进细胞代谢、提高细胞活性;青霉素和卡那霉素作为双抗可以控制绝大部分细菌,从而为***上皮细胞提供良好的生长环境。
进一步地,所述传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基:
乳酸钠格林8~12%、尿囊素1.5~2.5%、肌酸0.5~1%、荭草苷0.2~0.5%以及绿原酸0.1~0.2%。
乳酸钠格林为乳酸钠、氯化钠、氯化钾与氯化钙的灭菌水溶液,可用于提供接近人体的渗透压适中的环境,以利于细胞的存活;尿囊素可以促进细胞生长、软化角质蛋白,从而加快组织更新和伤口愈合;肌酸可以为细胞代谢快速提供能量、促进细胞生长和更新;荭草苷可有效提高细胞活力、抑制细胞凋亡;绿原酸具有优异的抗菌、抗病毒效果,并且能有效抗氧化、提升细胞活性。使用上述配比的传代培养液,可以有效提高细胞活力、促进细胞***,从而快速获得优质的传代细胞。
本发明的有益效果如下:本发明提供了一种人***上皮细胞分离与培养方法,采集的***样本经多重消化、分散和筛选,可有效去除其他组织、获得高度纯化的样本;原代培养基中加入霍乱毒素和激素,可以有效提高细胞活性、促进细胞生长,从而获得优质的原代细胞;传代培养基中添加的尿囊素、肌酸和荭草苷可以有效提高细胞活力和***能力,从而促进细胞生长和增殖;将3T3细胞作为滋养层,可以为原代***上皮细胞提供良好的生长基底,有效促进***上皮细胞的生长***,从而大大提高培养效果。通过上述方法,可以显著提高***上皮细胞的活性和增值速率,从而为相关研究项目提供优质的实验材料。
附图说明
图1为***上皮细胞的电镜照片;
图2为各组细胞培养物中PSA的检测水平;
图3为各组细胞培养物中PAP的检测水平;
图4为各组细胞培养物中AR的检测水平;
图5为采用不同方法对***上皮细胞进行培养的生长曲线。
具体实施方式
主要试剂及培养基的配制
A.WAJC414培养基:具体成分如下:
50g/mL胎牛血清、0.5mg/L胰岛素、20g/L霍乱毒素、0.392g/L***、10g/LEGF、100000IU/L青霉素以及100000IU/L链霉素。
B.PBS缓冲液:
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800mL蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌(至少20min),保存于室温或4℃冰箱中。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种人***上皮细胞分离与培养方法,包括如下步骤:
S1:样品采集和分离:采集***叶标本,去除脂肪组织,得到***上皮组织;
S2:向***上皮组织中加入添加有双抗的消化液,进行第一阶段消化,同时剪碎成小块;将剪碎的小块转移至培养瓶中,添加消化液,进行第二阶段消化,得到分散的***上皮细胞;
S3:用分散液将细胞溶解分散,依次用253μm、150μm、100μm、41μm的尼龙网过筛,并用分散液收集筛网上的残留物,得到分散的***上皮细胞;
S4:原代培养:用原代培养液将***上皮细胞的细胞浓度调整至4×106个/ml,置于二氧化碳培养箱中进行培养,得到原代细胞;
S5:传代培养:将原代细胞以每瓶104个细胞的浓度进行接种,采用经过照射的3T3细胞作滋养层,加入传代培养液进行悬浮培养,得到传代细胞。
实施例2
一种人***上皮细胞分离与培养方法,包括实施例1提供的各步骤,其中步骤S2的具体方法如下:
S2.1:向***上皮组织中加入添加有双抗的消化液,进行第一阶段消化,同时剪碎成小块、使之可通过14号导管;
S2.2:用注射器和14号导管将剪碎的小块转移至25cm2培养瓶中,按照每0.1g组织1ml的比例添加消化液,置于37℃震荡水浴箱中培养1h,进行第二阶段消化;
S2.3:100g离心5min,收集得到分散的***上皮细胞。
步骤S3的具体方法如下:
用分散液将细胞重新分散,依次用253、150、100、41μm的尼龙网过筛,每次过滤后都用5ml分散液冲洗筛网,收集冲洗筛网的分散液并进行离心,得到分散的***上皮细胞;其中采用的分散液为含有5%血清的0.02%EDTA。
步骤S4的具体方法如下:
S4.1:用WAJC414培养液收集对***上皮细胞进行重悬,将细胞浓度调整至4×106个/ml;
S4.2:在24孔培养板的每一孔中分别接种50μl(2×105个细胞),并加入20倍体积(1ml)的原代培养液,置于二氧化碳培养箱中进行培养,培养条件为37℃、5%CO2+95%空气,培养7~15天后,即得到原代细胞。
步骤S5的具体方法如下:
S5.1:用PBS缓冲液对原代细胞进行洗涤,并用消化液进行消化;消化结束后,用培养液悬浮细胞并计数;按照每瓶104个的接种量接种到新的培养瓶中;
S4.2:加入5~10倍数量的经过Co60照射的3T3细胞,混合均匀后加入培养液,置于37℃下培养15~30天,即得到传代细胞。
其中,3T3细胞的处理方法如下:
(1)用含有10%小牛血清的DMEM培养基培养3T3细胞,48h后更换培养液,继续培养15~30天;
(2)通过60Gy Co60照射、对3T3细胞进行灭活;
(3)用消化液对灭活的3T3细胞进行消化,用含有10%小牛血清的DMEM培养基清洗两次,并进行混悬。
实施例3
一种人***上皮细胞分离与培养方法,包括实施例2提供的各步骤,其中采用的消化液为添加有675U/ml胶原酶的0.02%EDTA;所述双抗为100U/ml青霉素和100μg/ml的卡那霉素。
实施例4
一种人***上皮细胞分离与培养方法,包括实施例2所述各步骤,其中采用的原代培养液为添加有如下成分的WAJC414培养液:
霍乱毒素1ng/ml、***1μM、EGF 10ng/ml、青霉素100U/ml以及卡那霉素100μg/ml。
实施例5
一种***上皮细胞分离与培养方法,包括实施例2所述各步骤,其中采用的传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基:
乳酸钠格林8%、尿囊素2.5%、肌酸0.5%、荭草苷0.2%以及绿原酸0.2%。
实施例6
一种***上皮细胞分离与培养方法,包括实施例2所述各步骤,其中采用的消化液为添加有675U/ml胶原酶的0.02%EDTA;所述双抗为100U/ml青霉素和100μg/ml的卡那霉素;
采用的原代培养液为添加有如下成分的WAJC414培养液:
霍乱毒素1ng/ml、***1μM、EGF 10ng/ml、青霉素100U/ml以及卡那霉素100μg/ml;
采用的传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基:
乳酸钠格林12%、尿囊素1.5%、肌酸1%、荭草苷0.5%以及绿原酸0.1%。
对照例1
一种***上皮细胞分离与培养方法,包括实施例2所述各步骤,其中采用的传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基:
乳酸钠格林8%、尿囊素2.5%、肌酸0.5%以及绿原酸0.2%
对照例2
一种***上皮细胞分离与培养方法,包括实施例2所述各步骤,其中采用的传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基:
乳酸钠格林12%、胎牛血清3%、荭草苷0.5%以及绿原酸0.1%。
对照例3
一种***上皮细胞分离与培养方法,包括实施例2所述各步骤,其中采用的传代培养液为添加有10%胎牛血清的DMEM培养基。
实验例
染色鉴定
分别采用实施例2、4、5、6提供的方法为实验组1~4,以对照例1~3提供的方法分别作为对照组1~3,并以石晓宇等(3D悬滴培养法对***上皮细胞中一些活性因子表达的影响.南开大学学报(自然科学版),2017,50(4):35-40)提供的培养方法作为对照组4,分别对同一来源的***上皮组织标本进行培养,培养结束后对泛细胞角蛋白抗体进行染色,并在电镜下进行观察,结果如图1所示。
电镜结果显示,各组细胞的角蛋白阳性率达到90%以上,证明各组细胞均为上皮源性,即***上皮细胞。
指标检测
根据石晓宇等提供的方法,从各组细胞的培养基中进行取样,分别测定***特异性抗原(PSA)、***酸性磷酸酶(PAP)以及雄激素核受体(AR)的表达情况,结果如图2~4所示,实验组各组的各项指标整体高于对照组各组,其中与实验组4最高,表明本申请提供的方法可以有效提高***上皮细胞的活性。
生长曲线
用96孔板对各组细胞进行传代培养,采用CCK-8法分别为各组细胞绘制生长曲线,取样时间分别为传代培养的第1、2、3、5、7、10、15d,结果如图5所示。
由曲线可知,实验组各组的细胞数量和增速均高于对照组各组,其中以实验组4的增殖活性最高,表明本申请提供的方法可以显著提高***上皮细胞的生殖活性,特别以实验组4(即实施例6)提供的方法最佳。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:样品采集和分离:采集***叶标本,去除脂肪组织,得到***上皮组织;
S2:向所述***上皮组织中加入添加有双抗的消化液,进行第一阶段消化,同时剪碎成小块;将剪碎的小块转移至培养瓶中,添加消化液,进行第二阶段消化,得到分散的***上皮细胞;
S3:用分散液将细胞溶解分散,依次用253μm、150μm、100μm、41μm的尼龙网过筛,并用分散液收集筛网上的残留物,得到分散的***上皮细胞;
S4:原代培养:用原代培养液将***上皮细胞的细胞浓度调整至4×106个/ml,置于二氧化碳培养箱中进行培养,得到原代细胞;
S5:传代培养:将所述原代细胞以每瓶104个细胞的浓度进行接种,采用经过照射的3T3细胞作滋养层,加入传代培养液进行悬浮培养,得到传代细胞。
2.如权利要求1所述的人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,步骤S2的具体方法如下:
S2.1:向所述***上皮组织中加入添加有双抗的消化液,进行第一阶段消化,同时剪碎成小块;
S2.2:将剪碎的小块转移至培养瓶中,按照每0.1g组织1ml的比例添加消化液,置于37℃震荡水浴箱中培养1h,进行第二阶段消化;
S2.3:消化结束后在100g条件下离心5min,收集得到分散的***上皮细胞。
3.如权利要求1所述的人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,步骤S4的具体方法如下:
S4.1:用WAJC414培养液对所述***上皮细胞进行重悬,将细胞浓度调整至4×106个/ml;
S4.2:在24孔培养板的每一孔中分别接种2×105个细胞,并加入20倍体积的原代培养液,置于二氧化碳培养箱中进行培养,培养条件为37℃、5%CO2+95%空气,培养7~15天后,即得到原代细胞。
4.如权利要求1所述的人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,步骤S5的具体方法如下:
S5.1:用PBS缓冲液对所述原代细胞进行洗涤,并用消化液进行消化,消化结束后,用培养液悬浮细胞并计数;按照每瓶104个的接种量接种到新的培养瓶中;
S5.2:加入5~10倍数量的经过Co60照射的3T3细胞,混合均匀后加入传代培养液,置于37℃下培养15~30天,即得到传代细胞。
5.如权利要求4所述的人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,3T3细胞的处理方法如下:
(1)用含有10%小牛血清的DMEM培养基培养3T3细胞,48h后更换培养液,继续培养15~30天;
(2)通过60Gy Co60照射、对3T3细胞进行灭活;
(3)用所述消化液对灭活的3T3细胞进行消化,用含有10%小牛血清的DMEM培养基清洗两次,并进行混悬。
6.如权利要求1~5中任一项所述的人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,所述消化液为添加有675U/ml胶原酶的0.02%EDTA;所述双抗为100U/ml青霉素和100μg/ml的卡那霉素。
7.如权利要求1~5中任一项所述的人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,所述分散液为含有5%血清的0.02%EDTA。
8.如权利要求1~5中任一项所述的人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,所述原代培养液为添加有如下成分的WAJC414培养液:
霍乱毒素1ng/ml、***1μM、EGF 10ng/ml、青霉素100U/ml以及卡那霉素100μg/ml。
9.如权利要求1~5中任一项所述的人***上皮细胞分离与培养方法,其特征在于,所述传代培养液为添加有如下成分的Leibovitz L-15培养基:
乳酸钠格林8~12%、尿囊素1.5~2.5%、肌酸0.5~1%、荭草苷0.2~0.5%以及绿原酸0.1~0.2%。
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