CN109810177A - 一种具有ace抑制活性的核桃粕多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽及其制备方法和应用,该多肽是氨基酸序列为Val‑Glu‑Arg‑Gly‑Arg‑Arg‑Ile‑Thr‑Ser‑Val和Phe‑Val‑Ile‑Glu‑Pro‑Asn‑Ile‑Thr‑Pro‑Ala的混合物。本发明首先对榨油后的废弃物核桃粕进行脱脂处理,然后采用连续提取法,依次利用纯水、稀盐溶液、乙醇溶液和稀酸溶液从脱脂核桃蛋白中提取核桃谷蛋白‑1,再以核桃谷蛋白‑1为原料,采用限制性酶解技术、凝胶色谱分离、反向高效液相色谱纯化等技术制备出对ACE活性抑制率达92%以上的核桃粕多肽。本发明可以变废为宝,提高核桃精深加工和综合利用水平,推动核桃产业发展,产生良好的经济效益,所得多肽可作为ACE抑制剂和制备降血压药物。
Description
技术领域
本发明属农产品加工技术领域,具体涉及一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽,以及以核桃粕为原料制备该多肽的方法。
背景技术
核桃(Juglans regia L.)别名胡桃、羌桃,是我国重要的经济栽培树木。目前我国主栽品种有27个,栽培区域涉及26个省份,主产区为新疆、陕西、甘肃、云南、山西等省。据中国林业统计年鉴统计,2017年我国核桃年产量高达415.25万吨,按16元/千克价格计,2017年中国核桃产值达到664亿元,未来我国核桃市场前景广阔。
研究表明,核桃仁中蛋白质含量约为14%~18%,可吸收率为85%,与其它植物蛋白资源相比,核桃仁蛋白质18种氨基酸齐全,8种必需氨基酸比例适宜,同时精氨酸与谷氨酸比重也相对较大,这些成分皆是人体组织细胞代谢不可缺少的重要物质,长期食用可对人体产生良好的保健效果,还可以间接降低冠心病患病风险。
核桃粕是核桃仁榨油后的副产物,年产量很大,榨油后的核桃粕中营养成分含量很高,其中蛋白质高达40%~50%,是丰富的植物蛋白质资源,但目前核桃粕主要用作肥料或饲料,造成了优质蛋白资源的极大浪费。
随着人们生活水平的提高,各种富贵病如高血压、高血脂、肥胖病、糖尿病等日显突出。高血压是威胁人类健康的主要疾病之一,是世界性健康问题。血管紧张素转化酶(AntiotensinI Converting Enzyme,ACE)能催化血管紧张素I转变为具有强效升高血压作用的血管紧张素II,同时将具有降压作用的舒缓激肽降解,使之失去降压作用,通过作用于肾素-血管紧张素***、激肽释放酶-激肽***、血管内皮细胞***、肾脏和体液平衡***,最终导致血压升高。通过抑制体内ACE的活性可以起到降血压的作用,目前临床上使用的降血压药物的降压原理主要是抑制ACE的活性。但目前使用的降压药物多为化学合成,如卡托普利、雷米普利等,这些药物的降血压效果较好,但药效时间短,患者需长期服用,且副作用较大。食源性ACE抑制肽是指从食物蛋白中分离出来的、具有抑制ACE活性的多肽,其优点是降血压效果良好、无毒副作用、可添加到饮食中降低血压等,是功能性食品、医药等行业的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽,以及以核桃粕为原料制备该多肽的方法,并为该多肽提供新的应用。
针对上述目的,本发明所采用的核桃粕多肽是氨基酸序列为Val-Glu-Arg-Gly-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Val和Phe-Val-Ile-Glu-Pro-Asn-Ile-Thr-Pro-Ala的混合物。
上述具有ACE抑制活性的核桃粕多肽的制备方法由下述步骤组成:
1、制备核桃粕脱脂粉
将榨油后的核桃粕在40~50℃鼓风干燥箱中干燥,粉碎过60~80目筛,然后按料液比为1g﹕10~20mL加入沸程为30~60℃的分析纯石油醚,除去剩余的核桃油,得到核桃粕脱脂粉。
2、提取核桃谷蛋白-1
(1)按料液比为1g﹕10~30mL,向核桃粕脱脂粉中加入去离子水,室温搅拌提取2~3h,过滤,收集滤液,将滤渣再反复提取3次,合并收集的滤液。
(2)将步骤(1)合并后的滤液在4~10℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,按料液比为1g﹕10~30mL向所得沉淀中加入0.4~0.5mol/L的氯化钠水溶液,室温下震荡提取2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(3)将步骤(2)合并后的滤液在4~10℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,按料液比为1g﹕10~30mL向所得沉淀中加入体积浓度为50%~70%的乙醇水溶液,室温搅拌2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(4)将步骤(3)合并后的滤液在4~10℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,所得沉淀用去离子水清洗后,按料液比为1g﹕10~30mL向沉淀中加入体积浓度为40%~60%的冰乙酸水溶液,室温搅拌2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(5)将步骤(4)合并后的滤液在4~10℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,上清液装入截留分子量为3000~6000透析袋中,在4~6℃的蒸馏水中透析12~24小时,透析结束后,将透析液在4~10℃、8000~12000rpm的条件下离心15~20min,收集沉淀,真空冷冻干燥,得核桃谷蛋白-1。
3、限制性酶水解
按料液比为1~4g﹕100mL,将核桃谷蛋白-1溶解于0.1~0.3mol/L磷酸缓冲液中,用0.1mol/L的盐酸调节pH至1.0~3.0,加入核桃谷蛋白-1质量2%~5%的胃蛋白酶,在30~50℃下震荡酶解2~6h,将酶解液在90~100℃下灭酶5~10min;将灭酶后的酶解液在4~6℃、10000~15000rpm的条件下离心20~30min,收集上清液,冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物。
4、凝胶色谱分离
将核桃谷蛋白-1多肽初提物溶解于去离子水中,配制成50~150mg/mL的溶液,然后对所得溶液进行柱层析分离,柱长0.6~1.2m,直径16~26mm,固定相为Sephadex G-15,纯水洗脱,洗脱流速为0.4~0.8mL/min,洗脱液在220nm处用分光光度计比色,收集分离的第2个多肽组分,冷冻干燥。
5、反相高效液相色谱纯化
将上述凝胶色谱分离所得到的第2个多肽组分溶解于去离子水中配成10~20mg/mL的溶液,过0.22μm滤膜,收集滤液;将滤液进行反相高效液相色谱分离,所用分离柱为碳18半制备柱,流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水,进行梯度洗脱,流动相梯度选择0到20分钟A:B为5%:95%,20~50分钟A:B为25%:75%,流速2.0~2.5mL/min,柱温30~40℃,检测波长220nm;收集分离的第5个和第8个多肽组分,冷冻干燥,得到具有ACE抑制活性的核桃粕多肽。
上述步骤2中,优选提取核桃谷蛋白-1的方法如下:
(1)按料液比为1g﹕15~20mL,向核桃粕脱脂粉中加入去离子水,室温搅拌提取2~3h,过滤,收集滤液,将滤渣再反复提取3次,合并收集的滤液。
(2)将步骤(1)合并后的滤液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,按料液比为1g﹕15~20mL向所得沉淀中加入0.4~0.5mol/L的氯化钠水溶液,室温下震荡提取2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(3)将步骤(2)合并后的滤液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,按料液比为1g﹕15~20mL向所得沉淀中加入体积浓度为70%的乙醇水溶液,室温搅拌2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(4)将步骤(3)合并后的滤液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,所得沉淀用去离子水清洗后,按料液比为1g﹕15~20mL向沉淀中加入体积浓度为60%的冰乙酸水溶液,室温搅拌2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(5)将步骤(4)合并后的滤液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,上清液装入截留分子量为5000透析袋中,在4~6℃的蒸馏水中透析24小时,透析结束后,将透析液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,收集沉淀,真空冷冻干燥,得核桃谷蛋白-1。
上述步骤3中,优选按料液比为2~3g﹕100mL,将核桃谷蛋白-1溶解于0.1~0.2mol/L磷酸缓冲液中,用0.1mol/L的盐酸调节pH至1.5~2.0,加入核桃谷蛋白-1质量3%~4%的胃蛋白酶,在45~50℃下震荡酶解4~6h,将酶解液在95~100℃下灭酶10min;将灭酶后的酶解液在4~6℃、10000~15000rpm的条件下离心20~30min,收集上清液,冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物。
本发明具有ACE抑制活性的核桃粕多肽在制备ACE抑制剂中的应用。
本发明具有ACE抑制活性的核桃粕多肽在制备降血压药物中的应用。
本发明的有益效果如下:
本发明首先对榨油后的废弃物核桃粕进行脱脂处理,然后采用连续提取法,依次利用纯水、稀盐溶液、乙醇溶液和稀酸溶液从脱脂核桃蛋白中提取核桃谷蛋白-1,再以核桃谷蛋白-1为原料,采用限制性酶解技术、凝胶色谱分离、反向高效液相色谱纯化等技术制备出对ACE活性抑制率高达92%以上的核桃粕多肽。本发明可以变废为宝,提高核桃精深加工和综合利用水平,推动核桃产业发展,产生良好的经济效益,所得多肽可作为ACE抑制剂和制备降血压药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、制备核桃粕脱脂粉
将榨油后的核桃粕在45℃鼓风干燥箱中干燥后粉碎,过60目筛,然后按料液比为1g﹕10mL加入沸程为30~60℃的分析纯石油醚,除去剩余的核桃油,得到核桃粕脱脂粉。
2、提取核桃谷蛋白-1
(1)按料液比为1g﹕15mL,向核桃粕脱脂粉中加入去离子水,室温搅拌提取2.5h,过滤,收集滤液。在滤渣中加入去离子水(料液比为1g﹕15mL)按照上述方法反复提取3次,合并收集的滤液。
(2)将步骤(1)合并后的滤液在4℃、10000rpm的条件下离心20min,然后按料液比为1g﹕15mL向所得沉淀中加入0.4mol/L的氯化钠水溶液,室温下震荡提取2.5h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(3)将步骤(2)合并后的滤液在4℃、10000rpm的条件下离心20min,然后按料液比为1g﹕15mL向所得沉淀中加入体积浓度为70%的乙醇水溶液,室温搅拌2.5h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(4)将步骤(3)合并后的滤液在4℃、10000rpm的条件下离心20min,所得沉淀用去离子水清洗后,按料液比为1g﹕15mL向沉淀中加入体积浓度为60%的冰乙酸水溶液,室温搅拌2.5h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(5)将步骤(4)合并后的滤液在4℃、10000rpm的条件下离心20min,上清液装入截留分子量为5000透析袋中,在4~6℃的蒸馏水中透析24小时,去除盐离子、可溶性糖、小分子蛋白等杂质;透析结束后,将透析液在4℃、12000rpm的条件下离心15min,收集沉淀,真空冷冻干燥,得到核桃谷蛋白-1。
3、限制性酶水解
将4g核桃谷蛋白-1溶解于200mL0.1mol/L磷酸缓冲液中,用0.1mol/L的盐酸调节pH至1.5,加入0.12g胃蛋白酶,在50℃下震荡酶解6h,将酶解液在100℃下灭酶10min;将灭酶后的酶解液在4℃、15000rpm的条件下离心20min,收集上清液,冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物。
4、凝胶色谱分离
将核桃谷蛋白-1多肽初提物溶解于去离子水中,配制成100mg/mL的溶液,然后对该溶液进行柱层析分离,柱长0.6m,直径16mm,固定相为Sephadex G-15,纯水洗脱,洗脱流速为0.6mL/min,每5min收集一次,洗脱液在220nm处用分光光度计比色。分离出4个多肽组分,收集分离的第2个多肽组分,冷冻干燥。
5、反相高效液相色谱纯化
将上述凝胶色谱分离所得到的第2个多肽组分溶解于去离子水中配成15mg/mL的溶液,过0.22μm滤膜,收集滤液;将滤液进行反相高效液相色谱分离,所用分离柱为碳18半制备柱(9.4mm×250mm),流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水,进行梯度洗脱,流动相梯度选择0到20分钟A:B为5%:95%,20~50分钟A:B为25%:75%,流速2.0mL/min,柱温35℃,检测波长220nm;收集分离的第5个和第8个多肽组分,冷冻干燥,得到具有ACE抑制活性的核桃粕多肽。
发明人采用碳18分析柱-反相高效液相色谱(4.6mm×250mm)对上述得到的核桃粕多肽进行分离,流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水,进行梯度洗脱,流动相梯度选择0到20分钟A:B由5%:95%到25%:75%,20~50分钟A:B为25%:75%,流速1.0mL/min,柱温35℃,检测波长220nm,得到2个纯多肽,将2个多肽分别收集,冷冻干燥。经N端测序分析鉴定,这2个纯多肽的氨基酸序列和分子量分别为:Val Glu Arg Gly Arg Arglle Thr Ser Val(分子量为1172.35Da,第5个多肽组分)和Phe Val Ile Glu Pro Asn IleThr Pro Ala(分子量为1100.28Da,第8个多肽组分)。
实施例2
1、制备核桃粕脱脂粉
将榨油后的核桃粕在40℃鼓风干燥箱中干燥后粉碎,过80目筛,然后按料液比为1g﹕15mL加入沸程为30~60℃的分析纯石油醚,除去剩余的核桃油,得到核桃粕脱脂粉。
2、提取核桃谷蛋白-1
(1)按料液比为1g﹕10mL,向核桃粕脱脂粉中加入去离子水,室温搅拌提取3h,过滤,收集滤液。在滤渣中加入去离子水(料液比为1g﹕10mL)按照上述方法反复提取3次,合并收集的滤液。
(2)将步骤(1)合并后的滤液在5℃、12000rpm的条件下离心15min,然后按料液比为1g﹕10mL向所得沉淀中加入0.5mol/L的氯化钠水溶液,室温下震荡提取3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(3)将步骤(2)合并后的滤液在5℃、12000rpm的条件下离心15min,然后按料液比为1g﹕10mL向所得沉淀中加入体积浓度为50%的乙醇水溶液,室温搅拌3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(4)将步骤(3)合并后的滤液在5℃、12000rpm的条件下离心15min,所得沉淀用去离子水清洗后,按料液比为1g﹕10mL向沉淀中加入体积浓度为50%的冰乙酸水溶液,室温搅拌3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液。
(5)将步骤(4)合并后的滤液在5℃、12000rpm的条件下离心15min,上清液装入截留分子量为3500透析袋中,在4~6℃的蒸馏水中透析24小时,去除盐离子、可溶性糖、小分子蛋白等杂质;透析结束后,将透析液在4℃、10000rpm的条件下离心20min,收集沉淀,真空冷冻干燥,得到核桃谷蛋白-1。
3、限制性酶水解
将2g核桃谷蛋白-1溶解于200mL0.2mol/L磷酸缓冲液中,用0.1mol/L的盐酸调节pH至2.0,加入0.08g胃蛋白酶,在45℃下震荡酶解4h,将酶解液在95℃下灭酶10min;将灭酶后的酶解液在4℃、15000rpm的条件下离心20min,收集上清液,冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物。
4、凝胶色谱分离
将核桃谷蛋白-1多肽初提物溶解于去离子水中,配制成150mg/mL的溶液,然后对该溶液进行柱层析分离,柱长1.0m,直径16mm,固定相为Sephadex G-15,纯水洗脱,洗脱流速为0.5mL/min,每5min收集一次,洗脱液在220nm处用分光光度计比色。分离出4个多肽组分,收集分离的第2个多肽组分,冷冻干燥。
5、反相高效液相色谱纯化
将上述凝胶色谱分离所得的第2个多肽组分溶解于去离子水中配成20mg/mL的溶液,过0.22μm滤膜,收集滤液;将滤液进行反相高效液相色谱分离,所用分离柱为碳18半制备柱(9.4mm×250mm),流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水,进行梯度洗脱,流动相梯度选择0到20分钟A:B由5%:95%到25%:75%,20~50分钟A:B为25%:75%,流速2.0~2.5mL/min,柱温30~40℃,检测波长220nm;收集分离的第5个和第8个多肽组分,冷冻干燥,得到具有ACE抑制活性的核桃粕多肽。
实施例3
本发明核桃粕多肽的ACE抑制活性
按照文献(Jimsheena,V.K.and Gowda,L.R.(2009))中方法分别对实施例1和实施例2得到的核桃粕多肽以及分离后的2个纯多肽进行体外血管紧张素转化酶(ACE)测定,具体测定方法如下:
取50μL浓度为1.0mg/mL的多肽样品水溶液和50μL ACE溶液(酶活力单位为25mU/mL,溶解于浓度为50mmol/L、pH 8.3的硼酸缓冲液中)混合均匀,在37℃下水浴10min,冷却至室温后加入150μL已经预热至37℃的HHL溶液,在37℃下反应60min,冷却至室温后加入250μL 1mol/L HCl水溶液以终止反应,之后加入1.4mL乙酸乙酯,在旋涡振荡器上剧烈振荡5s,在14100rpm下离心5min,离心后溶液体系分层,小心量取1mL上层溶液至玻璃试管中,在鼓风干燥箱中于120℃下放置30min。取出试管,待其冷却至室温,加入2mL去离子水,摇晃均匀后在228nm处比色。
抑制率按照如下公式计算:
ACE抑制率(%)=(1-AS/AC)×100
式中,As表示加入多肽的吸光度值,Ac表示未加多肽的吸光度值。
实验结果显示,氨基酸序列为Val Glu Arg Gly Arg Arg lle Thr Ser Val的多肽对ACE的体外抑制率达到98.26%,氨基酸序列为Phe Val Ile Glu Pro AsnIle Thr ProAla的多肽对ACE的体外抑制率为92.15%,实施例1得到的核桃粕多肽对ACE的体外抑制率为93.25%,实施例2得到的核桃粕多肽对ACE的体外抑制率为92.50%。因此,本发明核桃粕多肽可作为ACE抑制剂和制备降血压药物。
Claims (6)
1.一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽,其特征在于:所述核桃粕多肽是氨基酸序列为Val-Glu-Arg-Gly-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Val和Phe-Val-Ile-Glu-Pro-Asn-Ile-Thr-Pro-Ala的混合物。
2.一种权利要求1所述的具有ACE抑制活性的核桃粕多肽的制备方法,其特征在于该方法由下述步骤组成:
(1)制备核桃粕脱脂粉
将榨油后的核桃粕在40~50℃鼓风干燥箱中干燥,粉碎过60~80目筛,然后按料液比为1g﹕10~20mL加入沸程为30~60℃的分析纯石油醚,除去剩余的核桃油,得到核桃粕脱脂粉;
(2)提取核桃谷蛋白-1
①按料液比为1g﹕10~30mL,向核桃粕脱脂粉中加入去离子水,室温搅拌提取2~3h,过滤,收集滤液,将滤渣再反复提取3次,合并收集的滤液;
②将步骤①合并后的滤液在4~10℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,按料液比为1g﹕10~30mL向所得沉淀中加入0.4~0.5mol/L的氯化钠水溶液,室温下震荡提取2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液;
③将步骤②合并后的滤液在4~10℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,按料液比为1g﹕10~30mL向所得沉淀中加入体积浓度为50%~70%的乙醇水溶液,室温搅拌2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液;
④将步骤③合并后的滤液在4~10℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,所得沉淀用去离子水清洗后,按料液比为1g﹕10~30mL向沉淀中加入体积浓度为40%~60%的冰乙酸水溶液,室温搅拌2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液;
⑤将步骤④合并后的滤液在4~10℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,上清液装入截留分子量为3000~6000透析袋中,在4~6℃的蒸馏水中透析12~24小时,透析结束后,将透析液在4~10℃、8000~12000rpm的条件下离心15~20min,收集沉淀,真空冷冻干燥,得核桃谷蛋白-1;
(3)限制性酶水解
按料液比为1~4g﹕100mL,将核桃谷蛋白-1溶解于0.1~0.3mol/L磷酸缓冲液中,用0.1mol/L的盐酸调节pH至1.0~3.0,加入核桃谷蛋白-1质量2%~5%的胃蛋白酶,在30~50℃下震荡酶解2~6h,将酶解液在90~100℃下灭酶5~10min;将灭酶后的酶解液在4~6℃、10000~15000rpm的条件下离心20~30min,收集上清液,冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物;
(4)凝胶色谱分离
将核桃谷蛋白-1多肽初提物溶解于去离子水中,配制成50~150mg/mL的溶液,然后对所得溶液进行柱层析分离,柱长0.6~1.2m,直径16~26mm,固定相为Sephadex G-15,纯水洗脱,洗脱流速为0.4~0.8mL/min,洗脱液在220nm处用分光光度计比色,收集分离的第2个多肽组分,冷冻干燥;
(5)反相高效液相色谱纯化
将上述凝胶色谱分离所得到的第2个多肽组分溶解于去离子水中配成10~20mg/mL的溶液,过0.22μm滤膜,收集滤液;将滤液进行反相高效液相色谱分离,所用分离柱为碳18半制备柱,流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水,进行梯度洗脱,流动相梯度选择0到20分钟A:B为5%:95%,20~50分钟A:B为25%:75%,流速2.0~2.5mL/min,柱温30~40℃,检测波长220nm;收集分离的第5个和第8个多肽组分,冷冻干燥,得到具有ACE抑制活性的核桃粕多肽。
3.根据权利要求2所述的具有ACE抑制活性的核桃粕多肽的制备方法,其特征在于:步骤(2)提取核桃谷蛋白-1的方法如下:
①按料液比为1g﹕15~20mL,向核桃粕脱脂粉中加入去离子水,室温搅拌提取2~3h,过滤,收集滤液,将滤渣再反复提取3次,合并收集的滤液;
②将步骤①合并后的滤液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,按料液比为1g﹕15~20mL向所得沉淀中加入0.4~0.5mol/L的氯化钠水溶液,室温下震荡提取2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液;
③将步骤②合并后的滤液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,按料液比为1g﹕15~20mL向所得沉淀中加入体积浓度为70%的乙醇水溶液,室温搅拌2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液;
④将步骤③合并后的滤液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,所得沉淀用去离子水清洗后,按料液比为1g﹕15~20mL向沉淀中加入体积浓度为60%的冰乙酸水溶液,室温搅拌2~3h,过滤,收集滤液,滤渣再反复震荡提取3次,合并收集的滤液;
⑤将步骤④合并后的滤液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,上清液装入截留分子量为5000透析袋中,在4~6℃的蒸馏水中透析24小时,透析结束后,将透析液在4~5℃、10000~12000rpm的条件下离心15~20min,收集沉淀,真空冷冻干燥,得核桃谷蛋白-1。
4.根据权利要求3所述的具有ACE抑制活性的核桃粕多肽的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,按料液比为2~3g﹕100mL,将核桃谷蛋白-1溶解于0.1~0.2mol/L磷酸缓冲液中,用0.1mol/L的盐酸调节pH至1.5~2.0,加入核桃谷蛋白-1质量3%~4%的胃蛋白酶,在45~50℃下震荡酶解4~6h,将酶解液在95~100℃下灭酶10min;将灭酶后的酶解液在4~6℃、10000~15000rpm的条件下离心20~30min,收集上清液,冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物。
5.权利要求1所述的具有ACE抑制活性的核桃粕多肽在制备ACE抑制剂中的应用。
6.权利要求1所述的具有ACE抑制活性的核桃粕多肽在制备降血压药物中的应用。
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