CN109804086B - 制备双标签dna库用于亚硫酸盐转化定序的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开多种使用亚硫酸氢盐转化定序制备双标签核酸库用于甲基化图谱的方法。在各种实施例中，所述方法使用两步骤标签程序来标记具有独特分子标识物(UMIs)的亚硫酸氢盐处理的DNA。

Description

制备双标签DNA库用于亚硫酸盐转化定序的方法
相关申请的交叉引用
本申请主张于2016年8月10日提交的美国专利临时申请案申请号为62/373,261的优先权以及于2016年9月21日提交的国专利临时申请案申请号为62/397,650的优先权，两者公开内容均通过引用并入本文作为参考。
背景技术
DNA甲基化在调节基因表达中起重要作用。异常的DNA甲基化与许多疾病过程有关，包括癌症。使用亚硫酸氢盐转化定序的DNA甲基化图谱分析逐渐被认为是用于检测和诊断癌症的有价值的诊断工具。例如，甲基化差异区域及/或等位基因特异性甲基化的特定模式可以用作使用循环游离DNA的非侵入性诊断的分子标记。然而，在定序库制备及/或测序期间引入的扩增及/或定序假象(错误)可能使DNA甲基化分析的结果产生偏差。需要制备用于甲基化分析的亚硫酸氢盐转化定序的DNA库的新方法。
发明内容
本文公开了使用亚硫酸氢盐或酶促转化定序制备用于甲基化图谱的双标签核酸库的方法。在各种实施例中，所述方法使用两步骤标签程序来标记亚硫酸氢盐处理的或酶促转化的具有独特分子识别物(UMIs)的DNA(其中未甲基化的胞嘧啶在转化的DNA中转化为尿嘧啶)，其中附加第一独特分子识别物至使用一单股DNA(ssDNA)接合反应转化的DNA，并在随后的程序步骤(例如双股接合步骤)中加入第二独特分子识别物。独特分子识别物用于鉴定个别DNA分子并减少或基本上消除定序及/或扩增诱导的假象(基于多个序列片段间的共同性使用相同的独特分子识别物)，从而提高DNA甲基化分析的准确性。
在本发明的一些实施例中，提供一种测定一个体的一甲基化图谱的方法，所述方法包括步骤：从所述个体获得一生物样品；在所述生物样品的核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生亚硫酸氢盐转化的核酸分子；确定所述转化的核酸分子的核酸序列；以及将所述转化的核酸分子的所述核酸序列与一参考核酸序列进行比较，以确定所述个体的所述甲基化图谱。在某些实施例中，所述个体是人。在某些实施例中，所述生物样品包括血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或淋巴液。在某些实施例中，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤更包括：与亚硫酸氢盐离子一起培养。在某些实施例中，所述核酸分子为DNA。在某些实施例中，所述DNA为游离DNA。在某些实施例中，所述游离DNA来自线性染色体。在某些实施例中，所述线性染色体是体染色体。在某些实施例中，所述方法还包括：将一核酸连接物接合到所述转化的核酸上。在某些实施例中，所述核酸连接物包含一独特分子识别物。在某些实施例中，所述核酸连接物包含一通用引发位点。在某些实施例中，所述核酸连接物为单股。在某些实施例中，所述核酸连接物是部分单股和部分双股的。在某些实施例中，接合所述核酸连接物是在单股核酸上进行的。在某些实施例中，所述核酸连接物附着于一固体支撑物。在某些实施例中，所述固体支撑物为一颗粒。在某些实施例中，所述颗粒是不耐热性的。在某些实施例中，所述方法还包括：对所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者进行引子延伸。在某些实施例中，所述方法还包括：将一核酸连接物连接到所述转化的核酸分子的一第二末端。在某些实施例中，将所述核酸连接物连接到所述转化的核酸分子的第二末端的步骤是在所述转化的核酸分子的5'端和最接近所述转化的核酸分子的5'端的第三连接物的3'端之间产生一间隙。在某些实施例中，所述方法还包括：在确定所述核酸序列之前扩增所述转化的核酸分子。在某些实施例中，所述扩增包括聚合酶连锁反应。在某些实施例中，所述扩增使得所述转化的核酸分子、所述未转化的核酸分子或两者增加了定序连接物。在某些实施例中，所述确定核酸序列的步骤包括次世代定序。在某些实施例中，确定核酸序列的步骤包括通过合成、焦磷酸定序或离子半导体定序进行定序。在某些实施例中，确定所述核酸序列的步骤包括定序到至少10,000x的定序深度。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛选或诊断自身免疫疾病。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛选或诊断癌症。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛查或诊断器官损伤、器官疾病或器官衰竭。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于移植排斥。在某些实施例中，所述方法还包括将甲基化图谱与任何家族史、临床数据、基因组定序数据、蛋白质组学数据或微生物组数据组合使用以筛选或诊断自身免疫疾病、癌症、器官衰竭或器官移植排斥。
在某些实施例中，提供一种测定一个体的一甲基化图谱的方法，所述方法包括步骤：a)从所述个体获得一生物样品；b)在所述生物样品的核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生转化的核酸分子；c)将包含一独特分子识别物的一核酸连接物接合到所述转化的核酸上；d)确定所述转化的核酸分子的核酸序列；以及e)将所述转化的核酸分子的所述核酸序列与一参考核酸序列进行比较，以确定所述个体的所述甲基化图谱。在某些实施例中，所述生物样品包括血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或淋巴液。在某些实施例中，所述方法还包括：增量所述转化的核酸分子，其中与非目标分子相比，所述增量增加了更多目标分子的量。在某些实施例中，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤更包括：与亚硫酸氢盐离子一起培养。在某些实施例中，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤更包括：与胞苷脱氨酶一起培养。在某些实施例中，所述核酸分子是DNA。在某些实施例中，所述DNA是游离DNA(cfDNA)。在某些实施例中，所述核酸连接物包含一通用引发位点。在某些实施例中，所述核酸连接物是部分单股和部分双股的。在某些实施例中，接合所述核酸连接物是在单股核酸上进行的。在某些实施例中，所述核酸连接物附着于一固体支撑物。在某些实施例中，所述固体支撑物为一颗粒。在某些实施例中，所述方法还包括：对所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者进行引子延伸。在某些实施例中，所述方法还包括：将一核酸连接物连接到所述转化的核酸分子的一第二末端。在某些实施例中，将所述核酸连接物连接到所述转化的核酸分子的第二末端的步骤是在所述转化的核酸分子的5'端和最接近所述转化的核酸分子的5'端的第三连接物的3'端之间产生一间隙。在某些实施例中，所述方法还包括：在确定所述核酸序列之前扩增所述转化的核酸分子。在某些实施例中，所述扩增包括聚合酶连锁反应。在某些实施例中，所述扩增使得所述转化的核酸分子、所述未转化的核酸分子或两者增加了定序连接物。在某些实施例中，述确定核酸序列的步骤包括次世代定序。在某些实施例中，确定所述核酸序列的步骤包括定序到至少10,000x的定序深度。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛选或诊断癌症。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于确定一游离DNA的组织或来源。
在某些实施例中，提供一种测定一个体的一甲基化图谱的方法，所述方法包括步骤：从所述个体获得一生物样品，并将其分成至少两个等分试样；在一第一等分试样的核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶以产生包含亚硫酸氢盐转化的核酸分子的第一等分试样；确定转化的核酸分子的核酸序列和包含未转化的核酸分子的第二等分试样的核酸分子的核酸序列，其中未甲基化的胞嘧啶不转化为尿嘧啶；以及比较转化的核酸分子和未转化的核酸分子的核酸序列，以确定所述个体的甲基化图谱。在某些实施例中，所述个体是人。在某些实施例中，所述生物样品包括血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或淋巴液。在某些实施例中，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤更包括：与亚硫酸氢盐离子一起培养。在某些实施例中，所述至少两个等分试样至少大约相等。在某些实施例中，所述核酸分子是DNA。在某些实施例中，所述DNA为游离DNA。在某些实施例中，所述游离DNA来自线性染色体。在某些实施例中，所述线性染色体是体染色体。在某些实施例中，所述方法还包括：将一核酸连接物接合到所述转化的核酸上、未转化的核酸上或两者上。在某些实施例中，所述核酸连接物包含一独特分子识别物。在某些实施例中，所述核酸连接物包含一通用引发位点。在某些实施例中，所述核酸连接物为单股。在某些实施例中，所述核酸连接物是部分单股和部分双股的。在某些实施例中，接合所述核酸连接物是在单股核酸上进行的。在某些实施例中，所述核酸连接物附着于一固体支撑物。在某些实施例中，所述固体支撑物为一颗粒。在某些实施例中，所述颗粒是不耐热性的。在某些实施例中，所述方法还包括在确定核酸序列之前结合所述至少两个等分试样。在某些实施例中，所述方法还包括：对所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者进行引子延伸。在某些实施例中，所述方法还包括：将一核酸连接物连接到所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者的一第二末端。在某些实施例中，将所述核酸连接物连接到所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者的第二末端的步骤是在所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者的5'端和最接近所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者的5'端的第三连接物的3'端之间产生一间隙。在某些实施例中，所述方法还包括：在确定所述核酸序列之前扩增所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者。在某些实施例中，所述扩增包括聚合酶连锁反应。在某些实施例中，所述扩增使得所述转化的核酸分子、所述未转化的核酸分子或两者增加了定序连接物。在某些实施例中，所述确定核酸序列的步骤包括次世代定序。在某些实施例中，确定核酸序列的步骤包括通过合成、焦磷酸定序或离子半导体定序进行定序。在某些实施例中，确定所述核酸序列的步骤包括定序到至少10,000x的定序深度。在某些实施例中，比较所述转化的核酸分子和所述未转化的核酸分子的核酸序列，以确定来自第一等分试样的核酸分子的胞嘧啶，其基于核酸连接物的一序列转化为尿嘧啶。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛选或诊断自身免疫疾病。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛选或诊断癌症。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛查或诊断器官损伤、器官疾病或器官衰竭。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于移植排斥。在某些实施例中，所述方法还包括将甲基化图谱与任何家族史、临床数据、基因组定序数据、蛋白质组学数据或微生物组数据组合使用以筛选或诊断自身免疫疾病、癌症、器官衰竭或器官移植排斥。
在某些实施例中，本文所述的制备用于亚硫酸氢盐转化定序的一核酸库的方法包括：在一样品的核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生转化的核酸分子；将包含一第一独特分子识别物的一第一核酸连接物以及一第一通用引发位点接合到所述转化的核酸分子的第一末端上，以产生标记的转化的核酸分子。在某些实施例中，所述样品的核酸分子包含DNA。在某些实施例中，所述样品的核酸分子包含游离DNA。在某些实施例中，所述游离DNA来源于人类线性染色体。在某些实施例中，所述人类线性染色体是体染色体。在某些实施例中，所述游离DNA来自血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或淋巴液。在某些实施例中，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤更包括：与亚硫酸氢盐一起培养。在某些实施例中，在所述样品的核酸分子中将所述转化的核酸分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶产生标记的单股转化的核酸分子。在某些实施例中，所述第一核酸连接物为单股。在某些实施例中，所述第一核酸连接物是部分单股和部分双股的。在某些实施例中，所述方法还包括对标记的转化的核酸分子进行引子延伸，所述标记的转化的核酸分子具有一与通用引发位点结合的引子，以产生双股单标记的转化的核酸分子。在某些实施例中，所述方法还包括将一第二核酸连接物连合到所述双股单标记的转化的核酸分子的一第二末端，其中所述第二连接物包括一第二独特分子识别物，以产生双股双标记的转化的核酸分子。在某些实施例中，所述第二独特分子标识物的序列不同于第一独特分子标识物的序列。在某些实施例中，将所述第二核酸连接物连接到所述双股单标记的转化的核酸分子的一第二末端的步骤是在所述双股双标记的转化的核酸分子的5'端和最接近所述双股双标记的转化的核酸分子的5'端的所述连接物的3'端之间产生一间隙。在某些实施例中，所述方法还包括：扩增所述双股双标记的转化的核酸分子。在某些实施例中，所述扩增包括聚合酶连锁反应。在某些实施例中，扩增所述双股双标记的转化的核酸分子使得多个所述核酸分子的第一末端、第二末端或两者增加了定序连接物。在某些实施例中，所述方法还包括：确定所述双股双标记的转化的核酸分子的核酸序列。在某些实施例中，确定所述核酸序列还包括：使用次世代定序对所述双股双标记的转化的核酸制备物进行定序。在某些实施例中，确定所述次世代定序的方法还包括：通过合成、焦磷酸定序或离子半导体定序进行定序。在某些实施例中，所述双股双标记的转化的核酸分子被定序到至少10,000x的定序深度。在某些实施例中，将包含相同的独特分子识别物的多个序列组合在一起用于分析。在某些实施例中，将序列与参考序列或衍生自未用离子处理的核酸分子的序列进行比较。在某些实施例中，第一核酸连接物固定在一固体支撑物上。在某些实施例中，所述固体支撑物为一颗粒。在某些实施例中，所述颗粒是不耐热性的。在某些实施例中，所述颗粒在液滴中被分隔。在某些实施例中，所述方法用于诊断或筛选人类个体的疾病或病症。在某些实施例中，所述疾病或病症是筛查癌症。在某些实施例中，所述疾病或病症是器官损伤、器官疾病或器官衰竭。在某些实施例中，所述疾病或病症是移植排斥。
在某些实施例中，提供一种测定一个体的一甲基化图谱的方法，所述方法包括步骤：a)在核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生单股转化的核酸分子；b)将包含一第一共同标签序列的单股第一核酸连接物接合到所述转化的核酸分子的一第一末端，以产生标记的转化的核酸股；c)进行引子延伸以形成与标记的转化的核酸股双股结合的一第二DNA股；d)将包含一第二共同标签序列和一引子区的一双股第二核酸连接物连接到步骤(c)的所述双股结合的DNA上，以产生标记的双股结合DNA分子；e)扩增所述标记的双股结合DNA分子的第二股，以形成扩增的核酸分子；f)确定所述扩增的核酸分子的序列；以及g)通过将所述扩增的核酸分子的所述序列与一参考基因组进行比较来鉴定甲基化位点。在某些实施例中，第一核酸连接物、第二核酸连接物或两者还包含独特分子识别物。在某些实施例中，确定所述扩增的核酸分子的序列的步骤包括：对所述扩增的核酸分子进行定序以产生多个序列片段，并基于所述独特分子识别物折迭所述多个序列片段以形成一共有序列。在某些实施例中，连接所述第二核酸连接物的步骤是在所述被标记的转化的核酸股的5'端和最接近所述被标记的双股DNA分子中的所述被标记的转化的核酸股的5'端的连接物的3'端之间产生一间隙。在某些实施例中，所述第二核酸连接物在一股上包含3'-双脱氧核苷酸。
在某些实施例中，提供一种测定一个体的一甲基化图谱的方法，所述方法包括步骤：a)在核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生单股转化的核酸分子；b)使用一第一共同标签序列来标记所述转化的核酸分子的一第一末端，以产生被标记的转化的核酸股；c)产生一第二DNA股，所述第二DNA股与所述被标记的转化的核酸股形成双股结合；d)将包含一第二共同标签序列和一引子区的一至少部分为双股的核酸连接物连接到步骤(c)的所述双股结合的DNA上，以产生标记的双股结合DNA分子；e)扩增所述标记的双股DNA分子的第二股，以形成扩增的核酸分子；f)确定所述扩增的核酸分子的序列；以及g)通过将所述扩增的核酸分子的所述序列与一参考基因组进行比较来鉴定甲基化位点。在某些实施例中，标记所述转化的核酸分子的第一末端的步骤包括：接合包含所述第一共同标签序列的一单股的核酸连结物。在某些实施例中，产生所述第二DNA股的步骤包括引子延伸。在某些实施例中，所述单股的核酸连接物、所述双股的核酸连接物或两者的核酸连接物还包括一独特分子识别物。在某些实施例中，确定所述扩增的核酸分子的序列的步骤包括：对所述扩增的核酸分子进行定序以产生多个序列片段，并基于所述独特分子识别物折迭所述多个序列片段以形成一共有序列。在某些实施例中，连接所述第二核酸连接物的步骤是在所述被标记的转化的核酸分子的5'端和最接近所述被标记的双股DNA分子中的所述被标记的转化的核酸分子的5'端的连接物的3'端之间产生一间隙。在某些实施例中，所述第二核酸连接物在一股上包含3'-双脱氧核苷酸。在某些实施例中，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤更包括：与亚硫酸氢盐离子一起培养。在某些实施例中，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤更包括：与胞苷脱氨酶一起培养。在某些实施例中，所述方法还包括：增量所述转化的核酸分子以用于一种或多种目标分子。
在本文描述的某些实施例中，包括筛选一个体癌症或增加患癌症风险的方法，所述方法包括：将样品中含有核酸的核酸分子中的未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生单股转化的核酸分子；将包含一第一共同标签序列的单股第一核酸连接物接合到所述转化的核酸分子的一第一末端，以产生标记的转化的核酸股；进行引子延伸以形成与标记的转化的核酸股双股结合的第二DNA股；将包含一第二共同标签序列和一引子区的一双股的核酸连接物连接到步骤(c)的所述双股结合的DNA上，以产生标记的双股DNA分子；扩增所述标记的双股DNA分子的第二股，以形成扩增的核酸分子；确定所述扩增的核酸分子的序列；以及通过将所述扩增的核酸分子的所述序列与一参考基因组进行比较来鉴定甲基化位点以确定甲基化图谱；并将甲基化图谱与癌症相关的甲基化图谱进行比较，以确定所述个体是否患有癌症或是否有患癌症的风险。
在本文描述的某些实施例中，提供一试剂盒，包含：一亚硫酸氢盐试剂；包含样品ID序列和通用引子结合位点的一核酸连接物；以及一通用引子。在某些实施例中，核酸连接物还包含独特分子识别物序列。在某些实施例中，所述试剂盒包含多个核酸连接物，每个核酸连接物包含不同的独特分子识别物序列。在某些实施例中，所述试剂盒还包含一核酸连接物，其包含一第二种不同的样品ID序列。
附图说明
图1示出了制备用于亚硫酸氢盐转化定序的cfDNA库的方法的一实施例的流程示意图。
图2示出了图1的方法的步骤示意图。
图3是以一独特分子识别物序列标记ssDNA的示意图。
具体实施方式
本文公开了使用亚硫酸氢盐转化定序(其中未甲基化的胞嘧啶在转化的DNA中转化为尿嘧啶)制备用于甲基化图谱的双标签核酸库的方法。在各种实施例中，所述方法使用两步骤标签程序来标记亚硫酸氢盐处理的或酶促转化的具有独特分子识别物(UMIs)的DNA，其中附加第一独特分子识别物至使用一单股DNA(ssDNA)接合反应转化的DNA，并在随后的程序步骤(例如双股接合步骤)中加入第二独特分子识别物。独特分子识别物用于鉴定个别DNA分子并减少或基本上消除定序及/或扩增诱导的假象(基于多个序列片段间的共同性使用相同的独特分子识别物)，从而提高DNA甲基化分析的准确性。
本揭示的独特分子识别物可以提供许多功能。独特分子识别物可用于鉴定源自共同来源的DNA序列，例如样品类型、组织、患者或个体。独特分子识别物可用于区分用亚硫酸氢盐处理的样品和未用亚硫酸氢盐处理的样品。独特分子识别物可以包括通用引发位点，其允许扩增已经由独特分子识别物标记的核酸。独特分子识别物可包含独特的(例如随机的或简并的)核酸序列，其可用于区分一样品中的多个核酸片段。独特分子识别物可用于减少扩增偏差，其是由于核酸组成(例如高GC含量)的差异而导致的不同目标物的不对称扩增。独特分子识别物可用于区分扩增过程中产生的核酸突变和由亚硫酸氢盐或未甲基化胞嘧啶酶促转化为尿嘧啶的突变。
独特分子识别物可以存在于多功能核酸独特分子识别物连接物中，所述连接物可以包含样品ID和通用引发位点两者；样品ID、通用引发位点以及独特的核酸序列(例如随机核酸序列)；或样品ID和独特的核酸序列。样品ID部分可以是4至18、5至18、6至18或7至18个核苷酸的任何合适长度。样品ID标签的长度足以识别至少64个、至少256个、至少1024个、至少4096个、至少16,384个或更多个样品。独特分子识别物连接物的独特核酸序列部分可以大于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸。独特分子识别物连接物可包含一组所定义的多个独特核酸序列。
本揭示的独特分子识别物以核酸连接物的形式提供，其允许使用接合反应将独特分子识别物附加到核酸分子上。所述接合反应可以是平末端接合。连接物可以是单股的，用于接合至单股核酸分子。连接物可以是双股的，用于接合至双股核酸分子。在某个实施例中，一双股连接物可以具有突出端，其允许连接物的3'端和核酸分子的5'端之间的间隙。或者，双股连接物在接物的3'端包含双脱氧核苷酸，如图2的240所示。在一个实施例中，本发明的方法用于分离自生物样品用于检测、诊断或筛选疾病或病症的游离DNA(cfDNA)的甲基化分析。所述生物样品可以是血液、血浆、血清、脑脊液、来自活组织切片检查的间质液、尿液、粪便、***、粘液(例如口腔或***)、汗液或快速冷冻石蜡包埋(FFPE)组织样本中的任何一种。在某些实施例中，生物样品是血液、血浆或血清。cfDNA的细胞来源可以是核(染色体)、粒线体或两者。在某些实施例中，cfDNA的细胞来源可以来自组织，例如肝、肾、胰腺、结肠、胃、食道、皮肤、肺、卵巢、***、子宫、***、睾丸、外周血单核细胞、淋巴细胞、T细胞，B细胞或血浆细胞。
图1示出了使用含有独特分子识别物的连接物制备用于亚硫酸氢盐转化定序的cfDNA库的方法100的实施例流程示意图。所述方法100包括但不限于以下步骤。在步骤110中，获得一血液样品并从血浆萃取物中分离循环的cfDNA。在步骤115中，对纯化的cfDNA进行亚硫酸氢盐转化反应。例如，通过亚硫酸氢钠处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，其在PCR扩增后被胸腺嘧啶取代，而甲基化胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)的转化以更慢的速率发生，因此大多数甲基化的胞嘧啶维持不变。
可以使用标准实验流程或市售试剂盒进行转化反应。示例性流程涉及从分离的DNA开始，并用一最终浓度为约0.3的NaOH使DNA变性。在DNA变性后，可以用亚硫酸氢钠或偏亚硫酸氢钠以约2M的最终浓度(pH在约5和6之间)在55℃处理4-16小时。所述步骤用亚硫酸盐共价修饰未甲基化的胞嘧啶。转化后，将DNA脱盐，然后通过在碱性pH和室温下培养DNA进行脱磺酸作用，其导致脱氨基-并转化为尿嘧啶。在一个实施例中，市售试剂盒如EZ DNAMethylation-Gold、EZ DNA Methylation-Direct或EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research Corp(尔湾，加州))用于亚硫酸氢盐转化。
本揭示还考虑通过不使用亚硫酸氢根离子的方法将甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。胞苷脱氨酶分别催化胞苷和脱氧胞苷为尿苷和脱氧尿苷的不可逆水解脱氨作用。在一些实施例中，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶是通过酶促反应完成。在一些实施例中，核酸分子与胞苷脱氨酶一起培育。在一些实施例中，胞苷脱氨酶包括活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)和载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化多肽样蛋白(APOBEC)。在一些实施例中，APOBEC酶选自人类APOBEC家族，其由以下群组所组成：APOBEC-1(Apo1)、APOBEC-2(Apo2)、AID、APOBEC-3A、-3B、-3C、-3DE、-3F、-3G、-3H及APOBEC-4(Apo4)。在一些实施例中，酶是APOBEC的变体(US20130244237)。在一些实施例中，转化使用市售试剂盒。在一个实例中，使用诸如APOBEC-Seq(NEBiolabs；US 20130244237)的试剂盒。
转化的核苷酸可以增量特定感兴趣的目标物。在某些实施例中，与未增量的目标物相比，转化的目标核酸增量至少5倍、10倍、50倍或100倍。增量可用于一个或多个目标物。在某些实施例中，可以同时增量至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个目标物。增量可以通过扩增反应或与特定诱饵核酸结合来进行，其中所述特定诱饵核酸结合特定增量目标物。诱饵核酸可以固定在固体支撑物上，例如柱体或基本上平坦的表面。诱饵核酸也可以固定在珠子上或由磁性材料、洋菜胶糖、琼脂糖或一些其他块状材料制成，这些材料允许通过磁铁、离心或沉淀进行回收。
仍参考图1，在步骤120中，将第一独特分子识别物连接物附加到亚硫酸氢盐转化的ssDNA的3'-OH末端。例如，使用ssDNA接合反应将第一独特分子识别物连接物附加到亚硫酸氢盐转化的ssDNA分子的3'-OH末端。第一独特分子识别物连接物包括例如独特分子识别物序列和通用引子序列(例如SBS引子序列)。在一实施例中，Swift Biosciences的AdaptaseTM技术用于ssDNA接合反应，其中将3'端G尾接合至ssDNA模板，然后使用“适应酶”附加部分双股连接物，其在模板分子上包含3'末端突出端。然后使用修饰步骤填入多个碱基并修复切口以接合连接物。在另一个实例中，ssDNA接合反应使用CircLigase II(Epicentre)将第一独特分子识别物连接物连接到亚硫酸氢盐转化的ssDNA分子的3'-OH末端，其中独特分子识别物连接物的5'-末端被磷酸化并且被亚硫酸氢盐转化的ssDNA已被去磷酸化(即3'末端具有羟基)。在另一个实施例中，ssDNA的接合反应使用Thermostable 5'AppDNA/RNA连接酶(可从New England BioLabs(Ipswich，MA)获得)将第一独特分子识别物连接物连接到亚硫酸氢盐转化的ssDNA分子的3'-OH末端。在所述实施例中，第一个独特分子识别物连接物在5'末端腺苷酸化并在3'末端被阻断。在又一个实例中，ssDNA的接合反应使用T4RNA连接酶(可从New England BioLabs获得)将第一独特分子识别物连接物连接到亚硫酸氢盐转化的ssDNA分子的3'-OH末端。在步骤125中，在延伸反应中合成第二股DNA。例如，包括一在第一独特分子识别物连接物中互补于通用引子序列的引子序列的一延伸引子被用在引子延伸反应中，以形成双股复合物。所述延伸反应使用例如能够读取亚硫酸氢盐转化的模板股中的尿嘧啶残基的酶。在步骤130中，将一第二独特分子识别物连接物附加到双股亚硫酸氢盐转化的DNA复合物中。例如第二独特分子识别物连接物是双股连接物，其包括分子识别物序列和通用引子序列(例如SBS引子序列)，其中一股包含5'-磷酸，另一股包含3'-双脱氧核苷酸(即3'端被阻断)。使用例如T4DNA连接酶在平端接合反应中将第二独特分子识别物连接物连接到双股亚硫酸氢盐转化的DNA复合物上。
在步骤135中，扩增双股亚硫酸氢盐转化的DNA以附加定序连接物。例如，使用包含P5序列的正向引子和包含P7序列的反向引子的PCR扩增用于将P5和P7序列附加到亚硫酸氢盐转化的DNA中。在步骤140中，对亚硫酸氢盐转化的基因库进行定序。在步骤145中，分析定序数据以确定甲基化位点和模式。在一实施例中，通过将序列数据与参考基因组进行比较来确定甲基化位点。参考基因组和亚硫酸氢盐处理的DNA之间的序列信息的比较可以提供关于可以使用的甲基化模式(例如细胞/组织特异性甲基化、差异低甲基化及/或高甲基化、等位基因特异性甲基化等)的信息，例如推断cfDNA的起源组织或鉴定源自肿瘤细胞的DNA分子。
图2显示了图1所述方法100的步骤示意图。即，在步骤110(图2中未显示)中，获得血液样品并从血浆萃取物中分离循环的游离DNA。在步骤115中，对双股DNA分子210进行一亚硫酸氢盐转化反应，形成亚硫酸氢盐转化的单股DNA分子215。亚硫酸氢钠处理将DNA分子210中的未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶(用星号表示)。在一实施例中，EZ DNA甲基化-金色或EZ DNA甲基化-快速试剂盒(可从Zymo Research Corp获得)用于亚硫酸氢盐转化。在另一个步骤115中，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的是通过酶促反应完成的，例如通过与胞苷脱氨酶一起培育。在步骤120中，将在5'末端腺苷酸化并在3'末端阻断的一第一独特分子识别物连接物220连接到亚硫酸氢盐转化的或酶促转化的ssDNA分子215的3'-OH末端。在这个实施例中，ssDNA的接合反应使用热稳定的5'DNA/RNA连接酶(未显示)将第一独特分子识别物连接物220连接到亚硫酸氢盐转化的ssDNA分子215的3'-OH末端。在步骤125中，在一延伸反应中合成第二股DNA。例如，与第一独特分子识别物连接物220中的SBS引子区域230互补的延伸引子230a用于一引子延伸反应以形成一双股复合物235，所述延伸反应使用例如能够读取亚硫酸氢盐转化的模板股中的尿嘧啶残基(由白色星星表示)，将尿嘧啶转化为腺嘌呤(用灰色星号表示)的酶。在步骤130中，一第二独特分子识别物连接物240接合到亚硫酸氢盐转化的DNA复合物235。所述第二独特分子识别物连接物240是双股分子，其包括一第二独特分子识别物区域(例如特定卷标序列)以及一SBS引子区域250，其中第二独特分子识别物240的一股(3'至5'股，即“底部”股)包含5'-磷酸，而另一股(5'至3'股，即“顶部”股)包括3'-双脱氧核苷酸(即3'端被阻断)。使用例如T4DNA连接酶在平端连接反应中将第二独特分子识别物240连接到亚硫酸氢盐转化的DNA复合物235上。因为第二独特分子识别物连接物240在3'端被阻断，所以产生间隙255。在步骤135中，扩增亚硫酸氢盐转化的DNA复合物235以附加定序连接物。例如，使用正向引子260和反向引子265进行扩增反应。正向引子260包括与SBS引子区域250及P5区域270互补的一SBS引子区域250a。反向引子265包括一SBS区域230a，其与SBS引子区域230及P7区域275互补。由于亚硫酸氢盐转化的DNA复合物235中的间隙255，“顶部”股在PCR扩增步骤中不会被扩增。现在一定序库扩增子280包括P5区域270、SBS引子区域250、第二独特分子识别物245、第一独特分子识别物225、SBS引子区域230及P7区域275。在步骤140(图2中未显示)中，亚硫酸氢盐转化的扩增子定序库被定序。在步骤145(图2中未显示)中，分析定序数据以确定甲基化位点。在一实施例中，通过将序列数据与参考基因组进行比较来确定甲基化位点。参考基因组和亚硫酸氢盐处理的DNA之间的序列信息的比较可以提供关于可以使用的甲基化模式(例如细胞/组织特异性甲基化、差异低甲基化及/或高甲基化、等位基因特异性甲基化等)的信息，例如推断cfDNA的来源组织或确定哪些分子来自肿瘤细胞。
在另一实施例(未示出)中，第二独特分子识别物连接物240是Y连接物，其中独特分子识别物序列包括在Y连接物的单股部分中。在所述实施例中，亚硫酸氢盐转化的DNA复合物235的每一股用不同的独特分子识别物序列标记，并且可以随后区分。
在另一个实施例中，可以使用从单一样品的等分试样平行制备的(+)亚硫酸氢盐转化的定序库和(-)亚硫酸氢盐的定序库来鉴定甲基化位点和模式。所述样品可以分成一个或多个等分试样。在某些实施例中，所述样品可以分成1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个等分试样。在某些情况下，这些等分试样也可以重复分成一式三份或一式四份。例如，使用根据图1方法100的cfDNA样品的第一等分试样制备的(+)亚硫酸氢盐转化的定序库，其中所述方法包括多个第一独特分子识别物连接物，其包括一独特分子识别物序列、一通用(即共同)第一标签序列以及一第一通用引子序列(例如SBS引子序列)。第一通用标签序列用于将所述定序库鉴定为(+)亚硫酸氢盐转化的定序库，并且独特分子识别物序列用于鉴定个体的DNA分子。被变性为(-)亚硫酸氢盐定序库的cfDNA的第二等分试样根据图1方法100的步骤120至130使用多个第二独特分子识别物连接物来制备，所述第二独特分子识别物连接物包括独特分子识别物序列，第二通用(即共同)标签序列以及通用引子序列(例如第二SBS引子序列)。第二个通用标签序列用于将定序库鉴定为(-)亚硫酸氢盐的定序库，第二个独特分子识别物连接物中的独特分子识别物序列用于鉴定个体的DNA分子。合并(+)亚硫酸氢盐转化的定序库和(-)亚硫酸氢盐的定序库并扩增以附加定序连接物。比较来自由单一样品平行制备的(+)亚硫酸氢盐转化的定序库和(-)亚硫酸氢盐的定序库的定序数据用于鉴定甲基化位点和模式。
在本揭示的另一个实施例中，所述方法解决了困扰亚硫酸氢盐处理的定序库的定序的现有问题。ssDNA库制备的挑战之一是失去双股结合体信息，这意味着在融合dsDNA后，顶部和底部股片段将具有不同的独特分子识别物序列。因此，在某个实施例中，反应以液滴或其他形式(例如颗粒)分隔，并且每个液滴包含相同的独特分子识别物连接物。因此，所有片段都可以接收相同的独特分子识别物连接物。如图3所示。此外，独特分子识别物ssDNA库的方法适用于各种定序库类型，如甲基化、全基因组定序和靶向深度定序。在某个实施例中，独特分子识别物连接物与包含在液滴中的颗粒结合。所述颗粒可以由热不稳定物质制成，使得它们可以熔化以释放与连接物接合的核酸，允许在液滴中进行其他步骤。上述材料在60℃至95℃的温度下是不稳定的。
在某些实施例中，已进行亚硫酸氢盐转化化或未甲基化的胞嘧啶酶促转化成尿嘧啶的核酸具有它们的核酸序列来确定。所述序列测定用于确定在生物样品的核酸中甲基化的一种或多种胞嘧啶。在某些实施例中，甲基化图谱被确定。甲基化图谱是所述样品的核酸中多个胞嘧啶的甲基化状态。例如，确定2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000或更多种不同胞嘧啶的甲基化状态。甲基化图谱可以包括与以下相关的胞嘧啶的甲基化状态：包含一个或多个基因的整个基因组区域、启动子或增强子组件、通常是母系或父系印记的基因、CpG岛或CpG位点。
序列测定可以包括定序长度为10、20、30、40、50、100、150或300个碱基或更长的连续核酸的序列。序列测定还可以包括确定不同的多态性标记物，例如单核苷酸多态性(SNP)、***/缺失突变(indel)、可变数目串联重复(VNTR)、微卫星体或小卫星体。也可以测量其他疾病相关的遗传变化，例如复制数变异。可以使用任何定序方法如Sanger定序确定序列。序列也可以使用多重测定法确定，例如基于数组或颗粒的杂交、位点特异性或等位基因特异性PCR。这些方法可以确定100、1000或同时10,000个不同的标记物。
在某些目的中，使用次世代定序技术确定序列。次世代定序技术可以是焦磷酸定序、合成定序或离子半导体定序。这些方法能够对至少250兆碱基/每次运行进行排序。导致每次运行至少1000万个长度为25个核苷酸或更长的离散片段。定序读数可以是配对末端读数。结合本发明的方法，这允许在至少10,000x、20,000x、30,000x或40,000x或更多的定序深度进行测序。在某些实施例中，定序深度在10,000x和100,000x之间、20,000x和80,000x之间、30,000x和70,000x、或40,000x和60,000x之间。
可以以多种方式分析定序数据。附加独特分子识别物连接物有利地降低了甲基化分析期间的错误概率。通过使用独特分子识别物连接物，可以区分由天然多态性、扩增错误或亚硫酸氢盐转化引起的碱基组成差异。具有C>T的序列可以通过许多机制产生，例如，这种C至T的变化可能是个体遗传的天然多态性的结果、这可能是扩增过程中引入突变的结果、或者这可能表示胞嘧啶在原始起始材料中被甲基化的结果。例如，如果每个序列包含两个不同的独特分子识别物序列，则表示所述序列是否来自已经进行亚硫酸氢盐转化的核酸，以及表示是否为亲本核酸的序列(扩增前)，则可能分析由扩增或转化反应引起的碱基组成变化的序列。如果C>T主要存在于已用亚硫酸氢盐处理的核酸序列中但未存在于未经亚硫酸氢盐处理的核酸序列中，则这样的取代可能是未甲基化胞嘧啶脱氨基的结果。序列也可以与参考基因组或参考样品对照。
某些组织具有组织特异性甲基化模式。因此，甲基化分析可用于将cfDNA追踪到起源组织。所述组织可以是组织或特定细胞类型，例如心脏、肝脏、肾脏、胰腺、结肠、胃、食道、皮肤、肺、卵巢、***、子宫、***、睾丸、外周血单核细胞、淋巴细胞、T细胞，B细胞或血浆细胞。
本揭示的方法可用于诊断或筛选器官移植或器官衰竭。它们可用于在从一捐赠者移植后筛选心脏、肺、肾、肝或胰腺的排斥。移植后来自特定器官的DNA含量增加表示器官衰竭或排斥。这些方法可以在接受器官移植之前和之后采集的样品上进行。在某些实施例中，所述方法可用于移植后的监测。例如，这些方法可以对在定义的时间间隔中从一个单一的移植接受者采取纵向取出的样品进行。无论捐赠者与接受者的性别或遗传关系如何，这些方法都是有用的。
或者，本揭示的方法可用于诊断或筛查癌症。在某些实施例中，所述癌症是肝癌、肝细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子***、睾丸癌、***癌、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、扩散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、被套区细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、结外边缘区粘膜相关淋巴组织B细胞淋巴瘤，***边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/伯基特细胞白血病、T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(原发性皮肤型)、间变性大细胞淋巴瘤、(全身型)、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病(人类T细胞淋巴细胞病毒I型阳性)、结外NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)，肠病相关T细胞淋巴瘤、ga mma/delta肝脾T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、蕈状肉芽肿。本揭示的方法还可用于诊断或筛选与器官损伤相关的疾病，例如器官衰竭或自身免疫疾病，例如多发性硬化、I型糖尿病、狼疮或类风湿性关节炎。
除了诊断和筛查癌症之外，多个所述方法可用于衡量对治疗的反应。例如，这些方法可以对从接受化学疗法、放射疗法或免疫疗法的单个患者纵向取出的样品进行。在某些实施例中，这些方法可用于确定特定治疗的失败或成功治疗后的复发。本揭示的方法可与其他分析法组合使用。甲基化分析可与cfDNA的其他分析相结合。例如，甲基化图谱可以与特定cfDNA的定量组合使用，例如SNP或基因启动子，以确定相对于阈值或相对于在先前时间取得的样品的增加。甲基化分析可与家族史、基因组分析、代谢分析和其他临床有用的测试(例如活组织检查、PET扫描或MRI)相结合使用。
虽然本文已经揭示和描述了本发明的优选实施例，但本领域技术人员将可以理解的是，这些实施例仅以例示性的方式提供。在不脱离本发明的情况下，许多替代、修改及变化对于那些本领域的技术人员将是显而易见的。应该理解的是，本文所述的本发明实施例的各种替代方案可用于实施本发明。

Claims (28)

1.一种测定一生物样品的一甲基化图谱的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：
a)获得所述生物样品；
b)在所述生物样品的核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生转化的核酸分子，其中，所述转化的核酸分子为单链的；
c)将包含独特分子识别物序列的单链的核酸连接物通过所述独特分子识别物序列连接到所述转化的核酸分子上，以创建标记的转化的核酸分子；
d)确定所述转化的核酸分子的核酸序列；以及
e)将所述转化的核酸分子的所述核酸序列与参考核酸序列进行比较，以确定所述生物样品的所述甲基化图谱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物样品包括血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或淋巴液。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：扩增所述转化的核酸分子，其中与非目标分子相比，所述扩增增加一个或多个目标分子的量。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于：将所述未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤进一步包括：与亚硫酸氢盐离子一起培养。
5.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于：将所述未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤进一步包括：与胞苷脱氨酶一起培养。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于：所述核酸分子是DNA。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述DNA是游离DNA(cfDNA)。
8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述核酸连接物包含一通用引发位点。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于：所述核酸连接物附着于一固体支撑物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述固体支撑物为一颗粒。
11.如权利要求1至10任一项所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：对所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者进行引物延伸。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：将第二核酸连接物连接到所述转化的核酸分子的第二末端。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：将所述第二核酸连接物连接到所述转化的核酸分子的第二末端的步骤是在所述转化的核酸分子的5'端和最接近所述转化的核酸分子的5'端的一第三连接物的3'端之间产生一缺口。
14.如权利要求1至13任一项所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：在确定所述核酸序列之前扩增所述转化的核酸分子。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述扩增包括聚合酶连锁反应。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于：所述扩增使得所述转化的核酸分子、所述未转化的核酸分子或两者增加了测序接头。
17.如权利要求1至16任一项所述的方法，其特征在于：所述确定核酸序列的步骤包括二代测序。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于：确定所述核酸序列的步骤包括测序到至少10,000x的测序深度。
19.如权利要求1至18任一项所述的方法，其特征在于：所述甲基化图谱用于确定游离DNA的组织或来源。
20.一种测定一生物样品的一甲基化图谱的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：
a)在核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生单链的转化的核酸分子；
b)连结物通过连接，将所述单链的转化的核酸分子的第一末端与包含第一共同标签序列和独特分子识别物序列的单链的第一核酸连接物进行标记，以产生被标记的转化的核酸股，其中，所述单链的第一核酸连接物通过所述独特分子识别物序列连接到所述单链的转化的核酸分子的第一末端；
c)产生第二核酸链，所述第二核酸链与所述被标记的转化的核酸股形成双链结合；
d)将包含第二共同标签序列和一引物区的一部分为双链的第二核酸连接物连接到步骤(c)的所述双链结合的核酸上，以产生标记的双链核酸分子；
e)扩增所述标记的双链核酸分子的第二链，以形成扩增的核酸分子；
f)确定所述扩增的核酸分子的序列；以及
g)通过将所述扩增的核酸分子的所述序列与参考基因组进行比较来鉴定甲基化位点。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于：产生所述第二核酸链的步骤包括引物延伸。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述双链的第二核酸连接物进一步包括独特分子识别物序列。
23.如权利要求20至22任一项所述的方法，其特征在于：确定所述扩增的核酸分子的序列的步骤包括：对所述扩增的核酸分子进行测序以产生多个序列片段，并基于所述独特分子识别物序列拼接所述多个序列片段以形成共有序列。
24.如权利要求20至23任一项所述的方法，其特征在于：连接所述第二核酸连接物的步骤是在所述被标记的转化的核酸股的5'端和最接近所述标记的双链核酸分子中的所述被标记的转化的核酸股的5'端的连接物的3'端之间产生一缺口。
25.如权利要求20至24任一项所述的方法，其特征在于：所述第二核酸连接物在一股上包含3'-双脱氧核苷酸。
26.如权利要求20至25任一项所述的方法，其特征在于：将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤进一步包括：与亚硫酸氢盐离子一起培养。
27.如权利要求20至25任一项所述的方法，其特征在于：将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤进一步包括：与胞苷脱氨酶一起培养。
28.如权利要求20至27任一项所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：扩增所述转化的核酸分子以用于增加一种或多种目标分子的量。
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