CN109799298B - 一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法，属于药物分析技术领域。本发明的检测方法，采用高效液相色谱和/或气相色谱法对吡仑帕奈及有关物质进行定性或定量检测。本发明的检测方法，吡仑帕奈及有关物质线性关系良好，准确度和精密度均良好，专属性强，稳定性高。本检测方法的重现性好，能满足吡仑帕奈原料药有关物质的检测要求，可用于吡仑帕奈原料药的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法。该检测方法采用高效液相色谱法(HPLC)和/或气相色谱法(GC)对吡仑帕奈及有关杂质进行定性或定量分析。
背景技术
吡仑帕奈是日本卫材公司研发的药物，通过非竞争性抑制AMPA型谷氨酸受体的组作用，用于治疗12岁以上癫痫患者的局部发作。该药为FDA批准的首个具有该作用机制的抗癫痫药物。
有关物质是在药物合成生产过程中带入的起始物料、中间体、副反应产物和降解杂质等，对有关物质进行检测可以对药物的质量和安全性进行控制。目前的国内外药典尚未收录吡仑帕奈有关物质的检测方法，对于原料药中有关物质的检测方法并未有完整表述。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱和/或气相色谱法对吡仑帕奈及有关物质进行定性或定量检测，其高效液相色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，流动相A为磷酸二氢钾水溶液，流动相B为乙腈；其气相色谱条件包括：采用Agilent DB-624毛细管色谱柱。
本发明在梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为15～25:85～75或80:20；在0-25分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；在25-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持40:60不变。例如，当流动相A和流动相B的初始比例为80:20时，具体的梯度洗脱过程如下：
本发明采用高效液相色谱法检测时，色谱柱选择岛津Wondasil C18-WR或Dikmadiamonsil C18，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。在不影响检测效果的情况下，优选色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。例如：岛津Wondasil C18-WR柱(250x4.6mm,5μm)或Dikma diamonsil C18柱(250x4.6mm,5μm)。
在一种方案中，流动相A为9～11mmol/L磷酸二氢钾水溶液，以磷酸或三乙胺调节pH至3.05～6.25，以磷酸调节pH值至3.05，以三乙胺调节pH值至6.25。
在一种优选方案中，流动相A为9～11mmol/L磷酸二氢钾水溶液，pH值为4.6-5.2，以磷酸调节pH值至4.6，以三乙胺调节pH值至5.2。
在一种更优选方案中，配制10mmol/L磷酸二氢钾水溶液，不需调节，pH值为4.61。
进一步的，高效液相色谱条件包括：检测波长为200～250nm，优选220nm；柱温为25℃～35℃，优选为30℃。
本发明可以根据需要，选择合适的进样量进样，例如：进样量为10μl、20μl或50μl。
本发明采用气相色谱法对杂质溴代异丙烷进行定量检测；采用以6％氰丙基苯-94％二甲基硅氧烷为固定液的Agilent DB-624毛细管色谱柱。在不影响本发明效果的情况下，优选，色谱柱的长度为30mm，内径为0.32mm，膜厚为1.8μm，即色谱柱：Agilent DB-624(30m×0.32mm×1.8μm)。
在一种优选方案中，气相色谱法对杂质溴代异丙烷进行检测时顶空进样，顶空平衡温度为85～105℃，优选为95℃。
进一步地，顶空平衡时间为20～40min，优选为30min。
进一步地，初始柱温为35～45℃，优选为40℃。
进一步地，气化室温度为220～240℃，优选为230℃。
进一步地，检测器温度为240～260℃，优选为250℃。
一种更详细的气相色谱法对杂质溴代异丙烷进行定量检测，气相色谱条件包括：色谱柱：Agilent DB-624；柱温：初始40℃，维持5min，以10℃/min升至180℃，维持3min；气化室温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：高纯氮气；分流比：1:5；恒压模式：压力10psi；顶空瓶温度：95℃；定量环温度：200℃；传输线温度：210℃；顶空平衡时间：30min；进样时间：1.0min；进样体积：1ml。
本发明提及的吡仑帕奈原料药中有关物质，包括以下物质：杂质1：5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮(SMA)；杂质2：苯硼酸(SMB)；杂质3：2-氰基苯硼酸-1,3-丙二醇环酯(SMC)；杂质4：1-苯基-5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮(中间体1)；杂质5：1-苯基-3-溴-5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮(中间体2)；杂质6：1,5-二苯基-[2,3'-联吡啶]-6'(1'H)-酮；杂质7：3-(6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-5-基)苄腈；杂质8：4-(6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-5-基)苄腈；杂质9：2-(6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-5-基)苯甲酸；杂质10：5-(2-氰基苯基)-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-1-氧；杂质11：溴代异丙烷。
本发明采用高效液相色谱法，分别从色谱条件等方面进行筛选、优化，拟定有关物质方法，进行方法学验证，并对杂质1(SMA)进行定性研究、对杂质2(SMB)、杂质3(SMC)、杂质4(中间体1)、杂质5(中间体2)、杂质6～10(工艺杂质及降解杂质)进行了定量研究。采用气相色谱法，对本品合成工艺中可能产生的工艺杂质11(溴代异丙烷)进行定量研究，其中，杂质2的校正因子为1.06，杂质3的校正因子为2.45，杂质4的校正因子为1.24，杂质5的校正因子为1.89，杂质6的校正因子为1.29，杂质7的校正因子为0.85，杂质8的校正因子为1.26，杂质9的校正因子为1.13，杂质10的校正因子为0.65。
本发明提供了吡仑帕奈有关物质的HPLC检测方法和GC检测方法。其中，HPLC检测方法，包括如下操作步骤：
(1)溶液配制：
取吡仑帕奈，加70％乙腈溶解并制成每1ml约含吡仑帕奈0.5mg的溶液，作为供试品溶液。分别取杂质1加二甲基亚砜溶解并稀释至约5μg/ml，分别取杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10加70％乙腈溶解并稀释至约5μg/ml。取上述溶液适量分别用70％乙腈及DMSO作溶剂混合得混合对照溶液。
(2)将供试品溶液和杂质对照品分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，色谱条件如下：
色谱柱：岛津Wondasil C18-WR柱(250x4.6mm,5μm)或Dikma diamonsil C18柱(250x4.6mm,5μm)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：检测波长为200～250nm，优选220nm；
流动相A：10mmol/L磷酸二氢钾水溶液，pH为3.05～6.25，优选pH值为4.6-5.2；更优选pH值为4.61；流动相B：乙腈；混合流动相流速为1mL/min；梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为15～25:85～75或80:20；在0-25分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；在25-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持40:60不变；
柱温为25℃～35℃，优选为30℃。
(3)测定方法：精密量取供试品和杂质对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
其中，GC检测方法，包括如下操作步骤：
(1)溶液配制：
取吡仑帕奈样品适量(约1.0g)，精密称定，置10ml量瓶中，用N，N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
溴代异丙烷母液配制：溴代异丙烷(约123mg)置10ml容量瓶中，加N，N-二甲基乙酰胺溶解并定容至刻度。
标准贮备液的配制：精密吸取溴代异丙烷母液1.0ml置于100ml的量瓶中，加N，N-二甲基乙酰胺溶解并定容至刻度，摇匀，作为标准贮备液。
精密吸取上述标准贮备液10.0ml置于100ml容量瓶中，加N，N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
(2)将供试品溶液和杂质对照品分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，色谱条件如下：色谱柱：6％氰丙基苯-94％二甲基硅氧烷为固定液的AgilentDB-624(30m×0.32mm×1.8μm)毛细管色谱柱；柱温：初始35～45℃，优选40℃，维持5min，以10℃/min升至180℃，维持3min；气化室温度：220～240℃，优选230℃；检测器温度：240～260℃，优选250℃；载气：高纯氮气；分流比：1:5；恒压模式：压力10psi；顶空瓶温度：85～105℃，优选95℃；定量环温度：200℃；传输线温度：210℃；顶空平衡时间：20～40min，优选30min；进样时间：1.0min。
(3)测定方法：精密量取供试品和杂质对照品溶液各1mL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。
采用本发明的技术方案，优势如下:
采用本发明的检测方法，吡仑帕奈及有关物质线性关系良好，准确度和精密度均良好，专属性强，稳定性高。本检测方法的重现性好，能满足吡仑帕奈原料药有关物质的检测要求，可用于吡仑帕奈原料药的质量控制。
附图说明
图1是吡仑帕奈样品色谱图；
图2是吡仑帕奈及有关物质色谱峰定位图；
图3是杂质2线性图；
图4是杂质3线性图；
图5是杂质4线性图；
图6是杂质5线性图；
图7是杂质6线性图；
图8是杂质7线性图；
图9是杂质8线性图；
图10是杂质9线性图；
图11是杂质10线性图；
图12是吡仑帕奈线性图；
图13是顶空平衡温度考察；
图14是顶空平衡时间考察；
图15是溴代异丙烷的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：一种吡仑帕奈有关物质的HPLC检测方法
一、实验材料与仪器
1.药品及试剂：
吡仑帕奈(南京海纳医药科技有限公司)、5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮(杂质1，南京海纳医药科技有限公司)、苯硼酸(杂质2，嘉兴市艾森化工有限公司)、2-氰基苯硼酸-1,3-丙二醇环酯(杂质3，南京海纳医药科技有限公司)、1-苯基-5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮(杂质4，南京海纳医药科技有限公司)、1-苯基-3-溴-5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮(杂质5，南京海纳医药科技有限公司)、1,5-二苯基-[2,3'-联吡啶]-6'(1'H)-酮(杂质6，南京海纳医药科技有限公司)、3-(6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-5-基)苄腈(杂质7，南京海纳医药科技有限公司)、4-(6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-5-基)苄腈(杂质8，南京海纳医药科技有限公司)、2-(6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-5-基)苯甲酸(杂质9，南京海纳医药科技有限公司)、5-(2-氰基苯基)-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-1-氧(杂质10，南京海纳医药科技有限公司)、溴代异丙烷(杂质11，上海将来实业有限公司)、乙腈(色谱纯，DIKMA)、磷酸二氢钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、三乙胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、醋酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、N，N-二甲基乙酰胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、超纯水(自制，Millipore)。
2.仪器：具体仪器的名称和规格见下表1。
表1具体仪器的名称和规格
| AUW120D分析天平(十万分之一) | 岛津公司 |
| pHS-3C数字酸度计 | 上海精科 |
| LC-20A高效液相色谱仪 | 日本岛津 |
| LC-10A高效液相色谱仪 | 日本岛津 |
| LC-Solution工作站 | 日本岛津 |
| Waters 2695液相色谱仪 | Waters公司 |
| DAD2996检测器 | Waters公司 |
| DAD2487检测器 | Waters公司 |
| Agilent7890A气相色谱仪(μECD检测器) | 安捷伦 |
| Agilent OpenLAB色谱工作站 | 安捷伦 |
| Agilent7694E顶空进样器 | 安捷伦 |
二、液相色谱条件
取吡仑帕奈样品，加70％乙腈溶解并制成每1ml约含吡仑帕奈0.5mg的溶液，作为供试品溶液。色谱柱采用岛津Wondasil C18-WR柱(250x4.6mm,5μm)；以10mmol/L磷酸二氢钾水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min。柱温30℃，检测波长为220nm，精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图1。
二、实验过程
1.吡仑帕奈溶液的配制
取吡仑帕奈，加70％乙腈溶解并制成每1ml约含吡仑帕奈0.5mg的溶液，作为供试品溶液。分别取杂质1加二甲基亚砜溶解并稀释至约5μg/ml，分别取杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10加70％乙腈溶解并稀释至约5μg/ml。取上述溶液适量分别用70％乙腈及DMSO作溶剂混合得混合对照溶液。
2.方法学验证
2.1专属性
分别取杂质1加二甲基亚砜溶解并稀释至约5μg/ml，分别取杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10加70％乙腈溶解并稀释至约5μg/ml。取上述溶液适量分别用70％乙腈及DMSO作溶剂混合得混合对照溶液，取上述溶液及70％乙腈、DMSO分别进样，色谱图如图2所示。
试验结果显示：在该色谱条件下，基线平稳，溶剂对本品测定无干扰，吡仑帕奈主峰理论塔板数105666，混合对照样品中各杂质分离度良好(均在1.5以上)，各杂质均可被检出，专属性较好。杂质7及杂质8均为本品的位置异构体，在该条件下同一时间出峰，保留时间一致，保留时间均在27min左右。
在该有关物质条件下，选择溶剂为DMSO时可将SMA有效检出，由于SMA经四步反应至最终成品，残留的可能性比较小，且在中间体检测中均对SMA进行了控制，因此在成品中不对SMA进行定量分析，选择70％乙腈作为检测溶剂。
2.2破坏试验
为考察在所选择的色谱条件下能否检出吡仑帕奈可能产生的降解产物，分别用高温、酸、碱、氧化、光照等剧烈条件对本品进行破坏，将破坏后的样品用70％乙腈溶解制备成供试品溶液，分别精密量上述各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，具体方法见表2。
表2破坏试验结果
本品在碱，酸，氧化，光照条件下均有不同程度的降解，本品受酸碱、氧化及光照条件的影响较大，各种条件破坏所产生的降解产物均可被检出，各降解产物与主峰的分离度良好，有关物质测定回收量良好，主成分峰纯度良好，因此，该色谱条件可用于本品有关物质测定。
2.3定量限、检测限的确定
分别取各杂质对照及吡仑帕奈对照配制一定浓度的样品，逐步稀释后进样20μl，以信噪比S/N＝3、S/N＝10测定，结果见表3。
表3检测限及定量限结果
| 名称 | 定量限(ng) | 检测限(ng) |
| 吡仑帕奈 | 1.0 | 0.3 |
| 杂质2 | 2.9 | 0.9 |
| 杂质3 | 1.6 | 0.5 |
| 杂质4 | 1.3 | 0.4 |
| 杂质5 | 1.6 | 0.6 |
| 杂质6 | 1.7 | 0.6 |
| 杂质7 | 1.5 | 0.5 |
| 杂质8 | 1.5 | 0.4 |
| 杂质9 | 1.6 | 0.4 |
| 杂质10 | 1.0 | 0.3 |
2.4样品溶液稳定性试验
取吡仑帕奈样品，加70％乙腈溶解制成约0.5mg/ml的样品溶液，分别在配制后0h、2h、4h、6h、8h、12h进样，以考察样品溶液中各杂质及主成分的含量，以面积归一化法计。结果见表4。
表4样品溶液稳定性试验
结果表明：样品溶液在放置12小时内有关物质均在0.055％左右，杂质6在0.009％左右，主峰峰面积RSD为0.68％，样品溶液在12小时内稳定性良好。
2.5线性
2.5.1杂质贮备液配制
分别取杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9适量，加乙腈配制成浓度约5μg/ml的溶液，作为杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9贮备液，取杂质10适量，加乙腈配制成浓度约0.625μg/ml的溶液，作为杂质10贮备液，均在冷处放置。
2.5.2线性
分别精密吸取各杂质对照储备液适量置10ml量瓶中，用70％乙腈定容，摇匀，得到一系列浓度的溶液。精密吸取上述系列梯度浓度溶液各20μl从低浓度到高浓度依次进样分析，记录色谱图，以杂质对照品溶液浓度C(μg/ml)为横坐标，杂质对照品峰面积为纵坐标，进行线性回归并求出回归方程，结果见表5和图3～图12。
表5线性考察结果
2.6进样精密度试验
取线性项下线性4溶液，连续进样测定6次，考察峰面积及保留时间的变化情况。结果见表6。
表6进样精密度试验结果
结果表明，进样精密度良好。
2.7混合对照溶液稳定性
取混合对照溶液，在配制后的0、2、4、6、8、10小时测定。结果见表7。
表7杂质对照溶液稳定性试验结果
| 时间(小时) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | RSD(％) |
| 杂质2峰面积 | 22153 | 22560 | 22542 | 22445 | 22484 | 0.7 |
| 杂质3峰面积 | 40264 | 40332 | 39724 | 39314 | 41294 | 1.9 |
| 杂质4峰面积 | 33932 | 33907 | 33760 | 32982 | 33528 | 1.2 |
| 杂质5峰面积 | 29905 | 29684 | 28552 | 29207 | 29589 | 1.8 |
| 杂质6峰面积 | 31529 | 31486 | 31467 | 31248 | 31868 | 0.7 |
| 杂质7、8峰面积 | 83845 | 84895 | 84330 | 83001 | 85048 | 1.0 |
| 杂质9峰面积 | 38663 | 38933 | 38554 | 37667 | 38296 | 1.2 |
| 杂质10峰面积 | 45065 | 43890 | 45185 | 43275 | 45210 | 2.0 |
| 吡仑帕奈峰面积 | 530837 | 531695 | 520769 | 525269 | 524644 | 0.9 |
结果表明，杂质对照溶液配制后室温放置10小时内比较稳定。
2.8重复性试验
取吡仑帕奈样品适量，精密称取6份，加70％乙腈溶解并分别制成每1ml中含0.5mg的溶液作为供试品溶液。精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算本品中各杂质的含量。测定结果见表8。
表8重复性试验结果
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 杂质6(％) | 0.010 | 0.011 | 0.010 | 0.011 | 0.011 | 0.010 | 0.010 | 6.8 |
| 总杂(％) | 0.042 | 0.042 | 0.042 | 0.042 | 0.043 | 0.041 | 0.042 | 1.5 |
2.9回收率试验
精密称取吡仑帕奈样品样品九份，分别加入杂质限量的80％、100％、120％的杂质对照，加70％乙腈稀释至刻度，分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，进行回收率测定。结果见表9～表17。
表9杂质2回收率试验结果
表10杂质3回收率试验结果
表11杂质4回收率试验结果
表12杂质5回收率试验结果
表13杂质6回收率试验结果
表14杂质7回收率试验结果
表15杂质8回收率试验结果
表16杂质9回收率试验结果
表17杂质10回收率试验结果
2.10中间精密度试验
取吡仑帕奈样品适量，精密称取6份，加70％乙腈溶解并分别制成每1ml中含0.5mg的溶液作为供试品溶液。精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算本品中各杂质的含量，结果见表18。
表18杂质6中间精密度试验结果
仪器1：岛津LC-20A高效液相色谱仪编号：100106
仪器2：岛津LC-10A高效液相色谱仪编号：100107
仪器3：岛津LC-10A高效液相色谱仪编号：100108
试验结果表明：本方法中间精密度良好。
2.11校正因子测定
杂质2、3、4、5、6、8、9在2台液相色谱仪上，使用3根色谱柱，共计6次，在定量限至规定限量浓度的250％内，共制备6份样品，以各成分浓度对各峰面积进行回归，并计算杂质相对吡仑帕奈的校正因子；杂质7、10采用高中低浓度与吡仑帕奈峰面积的比值来计算杂质相对吡仑帕奈的校正因子，结果见表19～表28。
表19杂质2校正因子的测定
表20杂质3校正因子计算结果
表21杂质4校正因子计算结果
表22杂质5校正因子计算结果
表23杂质6校正因子计算结果
表24杂质8校正因子计算结果
表25杂质9校正因子计算结果
表26吡仑帕奈校正因子计算结果
表27杂质7校正因子计算结果
| 杂质7 | 校正因子 |
| 1 | 0.85 |
| 2 | 0.86 |
| 3 | 0.85 |
| 4 | 0.84 |
| 5 | 0.85 |
| 6 | 0.83 |
| 平均值 | 0.85 |
表28杂质10校正因子计算结果
| 杂质10 | 校正因子 |
| 1 | 0.65 |
| 2 | 0.65 |
| 3 | 0.59 |
| 4 | 0.69 |
| 5 | 0.63 |
| 6 | 0.68 |
| 平均值 | 0.65 |
试验结果表明：杂质2的校正因子为1.06，杂质3的校正因子为2.45，杂质4的校正因子为1.24，杂质5的校正因子为1.89，杂质6的校正因子为1.29，杂质7的校正因子为0.85，杂质8的校正因子为1.26，杂质9的校正因子为1.13，杂质10的校正因子为0.65。
2.12耐用性考察
本发明进一步探讨当色谱条件发生微小变化时检测方法的耐受程度，并进行了耐用性试验，以供试品溶液为混合对照溶液及样品溶液，考察项目包括起始流动相比例，柱温，不同流动相pH值及不同色谱柱，以混合对照溶液峰个数、主峰与相邻峰的分离度、主峰拖尾因子、样品溶液中主成分的理论板数、主成分保留时间和归一化纯度为考察指标，对本方法的耐用性进行考察。测定结果见表29～表32。
2.12.1起始水相比例的变化
其他高效液相色谱条件与前述相同，在梯度洗脱过程中起始水相比例为15％，20％，25％的条件下考察混合对照溶液峰个数、主峰与相邻峰的分离度、主峰拖尾因子、样品溶液中主成分的理论板数、主成分保留时间和归一化纯度的变化情况。实验结果表明：初始水相比例在15％～25％范围内变化时，主成分理论板数、分离度及有关物质测定所受影响较小，保留时间相差较大。测定结果见表29。
表29耐用性考察(初始水相比例)
2.12.2流动相pH值的变化
其他高效液相色谱条件与前述相同，在梯度洗脱过程中在水相pH值分别为4.6，4.9和5.2的条件下考察混合对照溶液峰个数、主峰与相邻峰的分离度、主峰拖尾因子、样品溶液中主成分的理论板数、主成分保留时间和归一化纯度的变化情况。实验结果表明：水相pH值在4.6～5.2范围内变化时，对各参数影响不大。测定结果见表30。
表30耐用性考察(水相pH值)
2.12.3柱温的变化
其他高效液相色谱条件与前述相同，在柱温为25℃、30℃和35℃时考察混合对照溶液峰个数、主峰与相邻峰的分离度、主峰拖尾因子、样品溶液中主成分的理论板数、主成分保留时间和归一化纯度的变化情况。实验结果表明：柱温在25℃～35℃范围内变化时，对各参数影响不大。测定结果见表31。
表31耐用性考察(柱温)
2.12.4色谱柱的变化
其他高效液相色谱条件与前述相同，考察不同色谱柱对混合对照溶液峰个数、主峰与相邻峰的分离度、主峰拖尾因子、样品溶液中主成分的理论板数、主成分保留时间和归一化纯度等的变化情况。实验结果表明：使用不同色谱柱，对各参数影响不大。测定结果见表32。
表32耐用性考察(不同色谱柱)
2.13有关物质测定方法的确定
经过上述方法学验证，表明初步拟定的方法适用于本品有关物质检查。
各杂质校正因子(杂质2：1.06，杂质3：2.45，杂质4：1.24，杂质5：1.89，杂质6：1.29，杂质7：0.85，杂质8：1.26，杂质9：1.13，杂质10：0.65)，根据杂质校正因子大小，确定杂质计算方式。因杂质10为基因毒性杂质，限度较低，采用外标法进行计算，其他已知杂质采用自身对照加校正因子法进行计算，其余杂质采用自身对照法进行计算。
暂将有关物质确定如下：
取本品，加溶剂(70％乙腈)溶解并制成每1ml约含吡仑帕奈0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加溶剂稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，作为对照溶液；另取杂质6、杂质10对照品适量，加溶剂(70％乙腈)溶解并定量稀释制成每1ml中约含杂质6为0.5μg、杂质10为0.06μg的混合溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(附录ⅤD)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10mmol/L磷酸二氢钾水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为220nm；柱温30℃。理论板数按吡仑帕奈峰计算不低于3000。取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。对照品溶液中出峰顺序依次为杂质6、杂质10，杂质10采用外标法进行测定，杂质6采用自身对照加校正因子法进行测定，其余杂质采用自身对照法进行测定，其余总杂采用自身对照法进行测定。
按下面公式计算杂质含量：
杂质10计算公式如下：
杂质(％)＝(rU/rS)×(CS/CU)×100
rU＝样品溶液中杂质10的峰面积
rS＝对照品溶液中杂质10的峰面积
CS＝标准溶液中杂质10对照的浓度(mg/ml)
CU＝样品溶液中的吡仑帕奈浓度(mg/ml)
杂质6计算公式如下：
杂质(％)＝(rU/rS)×F
rU＝样品溶液杂质6峰面积
rS＝吡仑帕奈1％自身对照峰面积
F＝杂质6的校正因子
其他单个杂质计算公式如下：
杂质(％)＝rU/rS
rU＝样品溶液各杂质峰面积
rS＝吡仑帕奈1％自身对照峰面积
其他总杂计算公式如下：
其他总杂(％)＝rU/rS
rU＝样品溶液除杂质6、10以外所有杂质总和
rS＝吡仑帕奈1％自身对照峰面积
照上述方法，对三批样品有关物质进行计算，结果见表33。
表33中试有关物质检查结果
实施例2：一种吡仑帕奈有关物质的GC检测方法
一、检测方法初步建立
本品在制备过程中使用的溶剂异丙醇可能会与NBS反应生成溴代异丙烷，该化合物具有基因毒性杂质有类似结构，判断该化合物有基因毒性。根据TTC为1.5μg/天，本品日服用量最大量为12mg计算得溴代异丙烷的限度为125ppm。
由于所要检测的溴代异丙烷沸点较低(59摄氏度)，可采用毛细管柱顶空程序升温法测定其含量。溴代异丙烷属于卤代烃，在FID上检测不明显，在ECD上有较高的响应，且能达到检测的要求，故选择μECD(电子捕获检测器)作为检测器，并采用顶空进样。
二、溶液配制
1标准贮备液配制
根据样品溶解性，样品溶液浓度定为0.1g/ml，所以溴代异丙烷的标准限量溶液浓度应为12.5μg/ml。
溴代异丙烷母液配制：溴代异丙烷124.89mg置10ml容量瓶中，加N，N-二甲基乙酰胺溶解并定容至刻度。
标准贮备液的配制：精密吸取溴代异丙烷母液1.0ml置于100ml的量瓶中，加N，N-二甲基乙酰胺溶解并定容至刻度，摇匀，作为标准贮备液。(C溴代异丙烷＝124.89μg/ml)。
2对照品(标准限量)溶液配制
精密吸取上述标准贮备液10.0ml置于100ml容量瓶中，加N，N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。(C溴代异丙烷＝12.49μg/ml)
3供试品溶液配制
取吡仑帕奈样品适量(约1.0g)，精密称定，置10ml量瓶中，用N，N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
三、气相色谱条件
1色谱柱的选择
以6％氰丙基苯-94％二甲基硅氧烷为固定液的DB-624毛细管色谱柱可以得到较好的分离效果。
2色谱条件拟定
色谱柱：Agilent DB-624(30m×0.32mm×1.8μm)；
柱温：初始40℃，维持5min，以10℃/min升至180℃，维持3min；气化室温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：高纯氮气；分流比：1:5；恒压模式：压力10psi；
顶空瓶温度：95℃；定量环温度：200℃；传输线温度：210℃；顶空平衡时间：30min
进样时间：1.0min；进样体积：1ml。
3顶空温度与平衡时间考察
3.1平衡温度的考察
取对照品溶液5ml置于20ml顶空进样瓶中，加盖密封，自动进样。设定顶空平衡时间为30min，考察平衡温度分别为85℃、95℃、105℃，对灵敏度影响，结果见图13。
结果表明：各溶剂随平衡温度的升高，灵敏度增加。但顶空平衡温度增加，顶空瓶中的压力增加，当压力过高时，会导致进样针进样困难。综合上述情况优选选用95℃作为顶空平衡温度。
3.2平衡时间的选择
取对照品溶液5ml置于20ml顶空进样瓶中，加盖密封，自动进样，顶空平衡温度为95℃时，考察平衡时间分别为20min、30min、40min时，对灵敏度的影响，结果见图14。
结果表明：平衡时间为30min时，溴代异丙烷峰面积最大，气-液两相浓度基本达到平衡，药典中规定残留溶剂顶空平衡时间一般为30～45min，时间过长不利于气密性的保持，故现在优选采用30min作为顶空平衡时间。
4方法学验证
4.1***适用性
按照上述色谱条件下，精密吸取上述已配制的对照品溶液5ml放入20ml顶空进样瓶，顶空进样，记录色谱图。结果表明：理论塔板数：n溴代异丙烷＝17634。
4.2专属性
吸取溴代异丙烷用N，N-二甲基乙酰胺释成一定浓度，进样。结果表明：溴代异丙烷的保留时间为5.114min；另取N，N-二甲基乙酰胺和样品溶液进样分析，结果显示N，N-二甲基乙酰胺对测定无干扰。
4.3检测限及定量限确定
将标准贮备液依次稀释，分别以信噪比S:N＝10:1及3:1时的浓度作为定量限及检测限，结果测得：溴代异丙烷的定量限为：0.0624μg/ml，检测限为：0.0156μg/ml。
4.4线性试验
精密吸取标准贮备液0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml及1.5ml至10ml容量瓶中，用N，N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，从低浓度到高浓度依次进样分析，记录色谱图，以对照品溶液浓度C(μg/ml)为横坐标，样品的峰面积AS为纵坐标，进行线性回归并求出回归方程，试验结果见表34及图15。
表34线性关系考察结果
上述试验结果表明：在6.25～18.74μg/ml浓度范围内，溴代异丙烷的峰面积与浓度间呈现较好的线性关系。
4.5进样精密度试验
取上述***适用性对照溶液，连续进样6针，以样品的峰面积为指标考察该方法的进样精密度，结果表明：该方法的进样精密度良好。结果见表35。
表35进样精密度试验结果
4.6重复性试验
取140101批样品6份，每份约1.0g，精密称定，置10ml量瓶中用N，N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液。平行制备待测溶液6份。精密量取供试品溶液和对照品溶液各5ml，顶空进样，按外标法计算样品中的溴代异丙烷含量。结果表明：样品中未检测出有溴代异丙烷。结果见表36。
表36重复性试验结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 均值 | RSD(％) |
| 溴代异丙烷(％) | - | - | - | - | - | - | / | / |
4.7回收率试验
取140101批样品9份，每份约1.0g，精密称定，分别置于10ml量瓶中，分别精密加入标准贮备液0.8ml、1.0ml、1.2ml，用N，N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，配制成80％、100％、120％的回收溶液各三份。分别精密量取5ml，顶空进样，进行回收率测定，结果见表37。结果表明：该方法的回收率良好。
表37回收率试验结果
4.8耐用性试验
其他气相色谱条件与前述相同，当气相色谱条件发生微小变化时本检测方法的耐受程度，进行了耐用性试验，考察因素包括柱温、气化室温度，检测器温度，考察指标为溴代异丙烷的理论板数、保留时间、对称因子、以及分离度。试验结果见表38～表40。
表38柱温的耐用性考察结果
| 柱温(℃) | 理论板数 | 保留时间(min) | 对称因子 |
| 35 | 21564 | 5.638 | 0.94 |
| 40 | 17040 | 5.116 | 0.93 |
| 45 | 14519 | 4.640 | 0.92 |
表39气化室温度的耐用性考察结果
| 气化室温度(℃) | 理论板数 | 保留时间(min) | 对称因子 |
| 220 | 17256 | 5.116 | 0.96 |
| 230 | 17040 | 5.116 | 0.93 |
| 240 | 17062 | 5.116 | 0.96 |
表40检测器温度的耐用性考察结果
结论：当柱温、气化室温度或检测器温度发生微小变化时，溶剂的色谱行为变化不大，在可接受的范围内；本方法的耐用性良好。
本方法经线性、精密度、重复性、回收率、耐用性等各项试验考察，结果均符合相关规定，可用于本品中溴代异丙烷含量的检测。
5样品测定
照上述方法对样品，进行吡仑帕奈样品中溴代异丙烷检测，结果见表41。
表41吡仑帕奈中杂质溴代异丙烷检测结果
| 批号 | 溴代异丙烷(ppm) |
| 140101 | 未检出 |
| 140201 | 未检出 |
| 140202 | 未检出 |
| 2mg上市品108647 | 未检出 |
| 4mg上市品107299 | 未检出 |
三批样品和上市品中均未检测出有溴代异丙烷。故样品中有关物质检测均符合规定。
本发明分别采用高效液相色谱法和气相色谱法对本品可能存在的杂质进行研究。
采用高效液相色谱(HPLC)，分别从色谱条件等方面进行筛选、优化，拟定有关物质方法，进行方法学验证，并对杂质1(SMA)进行定性研究、对杂质2(SMB)、杂质3(SMC)、杂质4(中间体1)、杂质5(中间体2)、杂质6～10(工艺杂质及降解杂质)进行了定量研究。采用气相色谱法(GC)，对本品合成工艺中可能产生的工艺杂质11(溴代异丙烷)进行定量研究。本发明的检测方法，吡仑帕奈及有关物质线性关系良好，准确度和精密度均良好，专属性强，稳定性高。本检测方法的重现性好，能满足吡仑帕奈原料药中有关物质的检测要求，可用于吡仑帕奈原料药的质量控制。
Claims (2)
1.一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱和/或气相色谱法对吡仑帕奈及有关物质进行定性或定量检测，
其中，采用高效液相色谱检测的有关物质为：杂质1：5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮、杂质2：苯硼酸、杂质3：2-氰基苯硼酸-1,3-丙二醇环酯、杂质4：1-苯基-5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮、杂质5：1-苯基-3-溴-5-(2-吡啶基)-1,2-二氢吡啶-2-酮、杂质6：1,5-二苯基-[2,3'-联吡啶]-6'（1'H）-酮、杂质7：3-（6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-5-基）苄腈、杂质8：4-（6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-5-基）苄腈、杂质9：2-（6-氧代-1-苯基-1,6-二氢 - [2,3-联吡啶]-5-基）苯甲酸和杂质10：5-（2-氰基苯基）-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢-[2,3-联吡啶]-1-氧；采用气相色谱法检测的有关物质为：杂质11：溴代异丙烷；
其高效液相色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为10mmol/L磷酸二氢钾水溶液，所述流动相B为乙腈；色谱柱为岛津Wondasil C18-WR或Dikma diamonsil C18，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5µm；检测波长为220 nm；柱温为30℃；进样量为20µl；
所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为80:20；在0-25分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；在25-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持40:60不变；
采用气相色谱法对杂质溴代异丙烷进行定量检测；检测时采用顶空进样，以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷为固定液的Agilent DB-624毛细管色谱柱，色谱柱的长度为30mm，内径为0.32mm，膜厚为1.8µm；
所述气相色谱条件包括：柱温：初始40℃，维持5min，以10℃/min升至180℃，维持3min；气化室温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：高纯氮气；分流比：1:5；恒压模式：压力10psi；顶空瓶温度：95℃；定量环温度：200℃；传输线温度：210℃；顶空平衡时间：30min；进样时间：1.0min；进样体积：1ml。
2.根据权利要求1所述的吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，杂质2的校正因子为1.06，杂质3的校正因子为2.45，杂质4的校正因子为1.24，杂质5的校正因子为1.89，杂质6的校正因子为1.29，杂质7的校正因子为0.85，杂质8的校正因子为1.26，杂质9的校正因子为1.13，杂质10的校正因子为0.65。
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