CN109796525A

CN109796525A - Csep27蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN109796525A
Application number: CN201711136443.3A
Authority: CN
Inventors: 沈前华; 袁洪波; 裴洪翠; 金聪
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: CN109796525B

Abstract

本发明公开了CSEP27蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的CSEP27蛋白：(a1)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列1第22‑119位氨基酸残基组成的蛋白质；(a3)由序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还保护CSEP27蛋白的应用：(c1)调控大麦白粉菌的致病力；(c2)增加大麦白粉菌的致病力；(c3)促进植物中H₂O₂的积累；(c4)促进植物细胞死亡；(c5)调控植物中HvCAT1蛋白的水平；(c6)降低植物中HvCAT1蛋白的水平。本发明对于研究大麦白粉菌的致病机制以及植物对大麦白粉菌的抗病机制具有重大的理论价值，对于培育适用推广种植的抗大麦白粉菌的植物以及培育适于相关研究的感大麦白粉菌的植物具有重大的应用价值。

Description

CSEP27蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CSEP27蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

白粉菌是一种专化活体营养型病原真菌，其寄主非常广泛，包括小麦和大麦等粮食作物，流行年份给粮食生产造成了严重的损失。大麦白粉菌(Blumeria graminisf.sp.hordei,Bgh)只能侵染野生大麦或栽培大麦，在其表皮细胞繁殖生长。当环境适宜时，大麦白粉菌成熟孢子萌发产生初级萌发管和次级萌发管，在次级萌发管的末端膨大形成附着胞。在附着胞下面能形成侵染钉，该结构能穿透植物细胞壁，在植物表皮细胞内形成吸器结构，负责从寄主体内吸收水分和营养供给病原菌的生长和发育。因此，加快白粉菌毒性机制以及与植物互作的研究成为亟需研究的课题，这将为抗病育种提供重要的理论指导。

植物可以利用自身一系列的抗病代谢反应抵抗病原菌的入侵。过氧化氢(H₂O₂)是一种活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，能够调控包括抗病反应在内的许多生理过程。H₂O₂的生物学功能依赖于其浓度。具体而言，低浓度的H₂O₂作为一种信号分子存在，而高浓度的H₂O₂能够促进细胞死亡。

发明内容

本发明的目的是提供CSEP27蛋白及其编码基因和应用。

本发明首先保护一种蛋白质，获自大麦白粉菌，命名为CSEP27蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由序列表中序列1第22-119位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a3)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a4)含有(a1)或(a2)或(a3)的融合蛋白；

(a5)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；

(a6)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接标签得到的融合蛋白；

(a7)将(a1)或(a2)或(a3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大麦白粉菌致病力相关的由其衍生的蛋白质。

为了使蛋白质便于纯化和检测，可在蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

蛋白质的编码基因可通过将(b1)或(b2)或(b3)中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码CSEP27蛋白的基因(命名为CSEP27基因)也属于本发明的保护范围。

所述CSEP27基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)所述的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表中序列2第64-357位核苷酸所示的DNA分子；

(b3)编码区如序列表中序列6所示的DNA分子；

(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列杂交且编码大麦白粉菌致病力相关蛋白的DNA分子；

(b5)来源于大麦白粉菌的与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有95％以上同源性且编码大麦白粉菌致病力相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有CSEP27基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护CSEP27蛋白的应用，为如下(c1)至(c6)中的至少一种：

(c1)调控大麦白粉菌的致病力；

(c2)增加大麦白粉菌的致病力；

(c3)促进植物中H₂O₂的积累；

(c4)促进植物细胞死亡；

(c5)调控植物中HvCAT1蛋白的水平；

(c6)降低植物中HvCAT1蛋白的水平。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入CSEP27基因，得到转基因植物；所述转基因植物对大麦白粉菌的抗性低于所述出发植物。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在目的植物中导入抑制CSEP27基因表达的物质，得到转基因植物；所述转基因植物对大麦白粉菌的抗性高于所述目的植物。

本发明还保护一种蛋白质，获自大麦，命名为HvCAT1蛋白，是如下(d1)或(d2)：

(d1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d2)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对大麦白粉菌抗性相关的由序列3衍生的蛋白质。

蛋白质的编码基因可通过将序列4中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码HvCAT1蛋白的基因(HvCAT1基因)也属于本发明的保护范围。

HvCAT1基因为如下(e1)或(e2)或(e3)所述的DNA分子：

(e1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

(e2)在严格条件下与(e1)限定的DNA序列杂交且编码植物对大麦白粉菌抗性相关蛋白的DNA分子；

(e3)来源于大麦的与(e1)限定的DNA序列具有95％以上同源性且编码植物对大麦白粉菌抗性相关蛋白的DNA分子。

本发明还保护HvCAT1蛋白的应用，为如下(f1)或(f2)：

(f1)调控植物对大麦白粉菌的抗性；

(f2)增加植物对大麦白粉菌的抗性。

所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为大麦或烟草，更具体可为大麦P01或本氏烟。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为大麦或烟草，更具体可为大麦P01或本氏烟。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为大麦或烟草，更具体可为大麦P01或本氏烟。

大麦白粉菌又称大麦白粉病菌。所述大麦白粉菌具体可为生理小种A6或生理小种K1。

本发明对于研究大麦白粉菌的致病机制以及植物对大麦白粉菌的抗病机制具有重大的理论价值，对于培育适用推广种植的抗大麦白粉菌的植物以及培育适于相关研究的感大麦白粉菌的植物具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例2中台酚蓝染色前后的照片。

图2为实施例2中DAB染色后的照片。

图3为实施例2中Western blot的结果照片。

图4为实施例2中CSEP27基因的表达模式的结果。

图5为实施例2中吸器指数的结果。

图6为实施例4中Western blot的结果。

图7为实施例5中HvCAT1基因的表达模式的结果。

图8为实施例5中进行沉默后HvCAT1基因的相对表达水平的结果。

图9为实施例5中考马斯亮蓝R250染色后的照片。

图10为实施例5中微菌落指数的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

提及载体pGR107(即文献中的“vector pGR107”)的文献：Transcriptionalprogramming and functional interactions within the Phytophthora sojae RXLReffector repertoire.Plant Cell。

提及本氏烟(Nicotiana benthamiana)的文献：Structure-function analysisof barley NLR immune receptor MLA10reveals its cell compartment specificactivity in cell death and disease resistance。

大麦Pallas近等基因系P01，简称大麦P01。提及大麦P01的文献：Nuclearactivity of MLA immune receptors links isolate-specific and basal disease-resistance responses.Science 315,1098–1103。

大麦白粉菌生理小种A6(即文献中的“B.graminis strain A6”)，为亲和生理小种，简称生理小种A6。提及生理小种A6的文献：Nuclear activity of MLA immunereceptors links isolate-specific and basal disease-resistanceresponses.Science 315,1098–1103。

大麦白粉菌生理小种K1(即文献中的“B.graminis isolate K1”)，为非亲和生理小种，简称生理小种K1。提及生理小种K1的文献：Nuclear activity of MLA immunereceptors links isolate-specific and basal disease-resistanceresponses.Science 315,1098–1103。

载体pDONR201：ThermoFisher Scientific,货号：11798-014。

提及载体pUBI-Gate(即文献中的“vector pUbi-GATE”)的文献：Nuclearactivity of MLA immune receptors links isolate-specific and basal disease-resistance responses.Science 315,1098–1103。

GUS载体(即文献中的“Reporter plasmids”)即表达GUS报告基因的载体。提及GUS载体的文献：Nuclear activity of MLA immune receptors links isolate-specificand basal disease-resistance responses.Science 315,1098–1103。

载体pCa-γbLIC：携带大麦条纹花叶病毒γ链的载体。载体pCaBS-α：携带大麦条纹花叶病毒α链的载体。载体pCaBS-β：携带大麦条纹花叶病毒β链的载体。提及上述3个载体的文献：A High Throughput Barley Stripe Mosaic Virus Vector for Virus InducedGene Silencing in Monocots and Dicots,Plos One。

实施例1、CSEP27蛋白及其编码基因的发现

从大麦白粉菌中发掘候选的功能基因，然后克隆多个候选的功能基因并进行功能验证，从中筛选到一个功能基因，编码序列表的序列1所示的功能蛋白。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为CSEP27蛋白。序列表的序列1中，第1-21位氨基酸残基组成信号肽，第22-119位氨基酸残基组成成熟肽。将编码CSEP27蛋白的基因命名为CSEP27基因，其CDS序列如序列表的序列2所示。

实施例2、CSEP27蛋白的功能验证

一、烟草试验

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-gggATCGATatgGGTTCTATGaatgcagaatatcgct-3’；

R1：5’-CGCGTCGACttaaatattcgtgcctctgcaaa-3’。

以上引物中，下划线标注酶切识别序列，方框标注HA标签的编码序列。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶ClaⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收酶切产物。

4、取载体pGR107，用限制性内切酶ClaⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在载体pGR107的ClaⅠ和SalⅠ酶切位点之间***了特异DNA分子。特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：起始密码子(atg)、“TACGGTTCTATG”、CSEP27蛋白成熟肽的编码序列(序列表的序列2第64-357位核苷酸)、终止密码子(taa)。重组质粒表达N端具有HA标签的CSEP27蛋白成熟肽，将该N端具有HA标签的CSEP27蛋白成熟肽命名为HA-CSEP27融合蛋白。

6、将步骤5得到的重组质粒导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。

7、用10mM氯化镁水溶液重悬步骤6得到的重组农杆菌，得到OD_600nm＝0.5的菌悬液，命名为菌悬液甲。

8、将质粒pGR107-GFP-HA导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。

与步骤5得到的重组质粒相比，质粒pGR107-GFP-HA的差异仅在于：用GFP基因取代了CSEP27蛋白成熟肽的编码序列。

9、用10mM氯化镁水溶液重悬步骤8得到的重组农杆菌，得到OD_600nm＝0.5的菌悬液，命名为菌悬液乙。

10、萌发40天左右的本氏烟植株，对中上部两片完全展开的叶片进行注射。每片叶片以主叶脉为界，一边注射100微升菌悬液甲，另一边注射100微升菌悬液乙。

11、完成步骤10后，培养植株5天，然后取下注射菌悬液的叶片，利用台盼蓝染色。20片叶片中，注射菌悬液甲的部分全部出现细胞死亡现象，注射菌悬液乙的部分全部未出现细胞死亡现象。结果表明，CSEP27蛋白能够诱导细胞死亡。台酚蓝染色前的照片见图1A。台酚蓝染色后的照片见图1B。

12、完成步骤10后，培养植株2天，然后取下注射菌悬液的叶片，利用DAB染色并拍照。与注射菌悬液乙的部分相比，注射菌悬液甲的部分呈现褐色(褐色说明H₂O₂的大量积累)。20片叶片结果一致。结果表明，CSEP27蛋白能够诱导植物中H₂O₂的大量积累。DAB染色后的照片见图2。

13、完成步骤10后，培养植株2天，然后取下注射菌悬液的叶片，利用Western blot(采用HA标签的一抗)检测GFP蛋白和CSEP27蛋白的水平。结果表明，GFP基因和CSEP27基因均能够在本氏烟中正常表达。20片叶片结果一致。Western blot的结果照片见图3。

综合步骤一的结果，可以得出如下结论：在本氏烟中瞬时表达CSEP27基因能够促进植物中H₂O₂的大量积累，进而触发细胞死亡。

二、CSEP27基因的表达模式

1、萌发7天的大麦P01植株，剪取旗叶。

2、取步骤1得到的旗叶，叶面朝上，放置于含有培养基的培养皿上，静置培养24小时。

培养基：含1g/100mL琼脂、100mg/L苯丙咪唑，余量为水。

3、将生理小种A6抖落在完成步骤2的旗叶上，静置培养，于0小时、3小时、6小时、12小时、24小时和48小时后分别取表面附着大麦白粉菌菌丝体的叶片，于24小时和48小时后分别取含有大麦白粉菌吸器的叶片。

4、分别对步骤3得到的各个叶片提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA作为模板，采用BghGAPDH基因为内参基因，进行qRT-PCR。

用于鉴定CSEP27基因的引物对如下：

F2：5’-AGCCTATGCCTGGAGAAT-3’；

R2：5’-CAGTCCTAGCCTGATTTG-3’。

用于鉴定内参基因的引物对如下：

F3：5’-ATGAACTACAAGGCATCCTGTCA-3’；

R3：5’-TACCATGCGACTAGCTTAACAAAG-3’。

结果见图4。图4中，E代表表面附着大麦白粉菌菌丝体的叶片，H代表含有大麦白粉菌吸器的叶片。结果显示：在大麦白粉菌侵染早期，CSEP27基因的表达量没有显著的变化；当大麦白粉菌吸器形成后，CSEP27基因的表达量显著上升，且在吸器中表达水平更高。

三、大麦试验

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1得到的DNA分子为模板，采用F4和R4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F4：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGaatgcagaatatcgctgtc-3’；

R4：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCttaaatattcgtgcctctgcaaa-3’。

F4中，下划线标注attB1重组位点序列。R4下划线标注attB2重组位点序列。

3、回收步骤2得到的PCR扩增产物，与载体pDONR201进行BP重组反应，得到中间质粒。根据测序结果，对中间质粒进行结构描述如下：以载体pDONR201为出发载体，在骨架载体的重组位点***了序列表的序列6所示的DNA分子。序列表的序列6所示的DNA分子表达序列表的序列5所示的蛋白质。

4、取步骤3得到的中间质粒，与载体pUBI-Gate进行LR重组反应，得到重组质粒pUBI-CSEP27。根据测序结果，对重组质粒pUBI-CSEP27进行结构描述如下：以载体pUBI-Gate为骨架载体，在骨架载体的重组位点***了序列表的序列6所示DNA分子。

5、萌发7天的大麦P01植株，剪取旗叶。

6、取步骤5得到的旗叶，叶面朝上，放置于含有培养基的培养皿上，静置培养4小时。

培养基：含1g/100mL琼脂、100mg/L苯丙咪唑，余量为水。

7、将重组质粒pUBI-CSEP27与GUS载体等摩尔混合，得到质粒混合物甲。将载体pUBI-Gate与GUS载体等摩尔混合，得到质粒混合物乙。

8、试验组：利用基因枪轰击，将步骤7得到的质粒混合物甲导入完成步骤6的叶片，然后静置培养4小时。阴性对照组：利用基因枪轰击，将步骤7得到的质粒混合物乙导入完成步骤6的叶片，然后静置培养4小时。空白对照组：完成步骤6的叶片，不进行基因枪轰击，静置培养4小时。每组20片叶片。

9、将生理小种A6的成熟孢子抖落在完成步骤8的叶片上，静置培养48小时。

10、完成步骤9后，取叶片，依次进行如下步骤：在GUS染色液中染色，然后脱色，然后用水清洗，然后在考马斯亮蓝溶液中染色，然后用水清洗。

11、完成步骤10后，在显微镜下观察叶片。表达GUS基因的细胞中：不具有附着胞的细胞不统计，具有附着胞但不具有吸器的细胞为抗病细胞，具有附着胞且具有吸器的细胞为感病细胞。吸器指数＝感病细胞数量÷(感病细胞数量+抗病细胞数量)×100％。

结果见图5。阴性对照组和空白对照组的结果无显著差异。与空白对照组相比，试验组吸器指数显著增高。

实施例3、HvCAT1蛋白及其编码基因的发现

为了鉴定CSEP27蛋白在寄主中的作用靶标，以研究其致病的分子机理，利用酵母双杂交方法，以CSEP27蛋白作为诱饵筛选大麦cDNA酵母文库，以鉴定候选的互作蛋白。发现一个新蛋白，如序列表的序列3所示。

将序列表的序列3所示的蛋白质命名为HvCAT1蛋白。将编码HvCAT1蛋白的基因命名为HvCAT1基因，其CDS序列如序列表的序列4所示。

酵母试验结果表明，CSEP27蛋白与HvCAT1蛋白在酵母中相互作用。

实施例4、CSEP27影响HvCAT1蛋白的稳定性

1、取实施例2的步骤一的5得到的重组质粒，将其命名为重组质粒A。

2、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。

3、以步骤2得到的DNA分子为模板，采用F5和R5组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F5：5'-gggATCGATATGGATCCCTACAAGCACCG-3'；

R5：5'-ctaAGAACCCATGTTCGGCTTAATCTTGAG-3'。

以上引物中，下划线标注酶切识别序列，方框标注Flag标签的编码序列。

4、取步骤3得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Cla Ⅰ进行酶切，回收酶切产物。

5、取载体pGR107，用限制性内切酶Cla Ⅰ和Sma Ⅰ进行双酶切，回收载体骨架。

6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒B。根据测序结果，对重组质粒B进行结构描述如下：在载体pGR107的Cla Ⅰ和Sma Ⅰ酶切位点之间***了特异DNA分子。特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列4第1-1476位核苷酸所示的DNA分子、“GGTTCTGATTATAAGGATGACGATGATAAA”、终止密码子(tag)。重组质粒B表达C端具有Flag标签的HvCAT1蛋白，将该C端具有Flag标签的HvCAT1蛋白命名为HvCAT1-Flag融合蛋白。

7、将重组质粒A导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌A。将重组质粒B导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌B。将实施例1的步骤一的8中的质粒pGR107-GFP-HA导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌GFP。

8、用10mM氯化镁水溶液重悬重组农杆菌A，得到OD_600nm＝1.0的菌悬液，命名为菌悬液A。用10mM氯化镁水溶液重悬重组农杆菌B，得到OD_600nm＝1.0的菌悬液，命名为菌悬液B。用10mM氯化镁水溶液重悬重组农杆菌GFP，得到OD_600nm＝1.0的菌悬液，命名为菌悬液GFP。

9、将菌悬液A和菌悬液B等体积混合，得到混合液甲。将菌悬液GFP和菌悬液B等体积混合，得到混合液乙。

10、萌发40天左右的本氏烟植株，对中上部两片完全展开的叶片进行注射。每片叶片以主叶脉为界，一边注射100微升混合液甲，另一边注射100微升混合液乙。

11、完成步骤10后，培养植株3天，然后取下注射混合液的叶片，分别对注射混合液甲的部分和注射混合液乙的部分提取总蛋白并进行Western blot(采用Flag标签的一抗)。结果显示，与注射混合液乙的部分相比，注射混合液甲的部分HvCAT1蛋白水平显著降低，即CSEP27蛋白促进HvCAT1蛋白降解从而降低植物中HvCAT1蛋白的含量。Western blot的结果见图6。

实施例5、沉默HvCAT1基因影响大麦对大麦白粉菌的抗性

一、HvCAT1基因的表达模式

1、萌发7天的大麦P01植株，剪取旗叶。

培养基：含1g/100mL琼脂、100mg/L苯丙咪唑，余量为水。

3、将生理小种A6抖落在完成步骤2的旗叶上，静置培养，于0小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时和72小时后取表面附着大麦白粉菌菌丝体的叶片。

4、将生理小种K1抖落在完成步骤2的旗叶上，静置培养，于0小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时和72小时后取叶片。

5、分别对步骤3和步骤4得到的各个叶片提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA作为模板，采用大麦泛素化基因为内参基因，进行qRT-PCR。

用于鉴定HvCAT1基因的引物对如下：

F6：5'-CCTCCGCGTGTTCTATCTGG-3'；

R6：5'-TCATGGGTGACACGAGCATC-3'。

用于鉴定内参基因的引物对如下：

F7：5’-ACCCTCGCCGACTACAACAT-3’；

R7：5’-CAGTAGTGGCGGTCGAAGTG-3’。

结果见图7。在大麦被白粉菌侵染的早期，HvCAT1基因的转录水平均没有明显差异。在白粉菌吸器形成以后HvCAT1基因的转录水平明显上升。

二、沉默HvCAT1基因影响大麦对大麦白粉菌的抗性

1、制备病毒液

(1)合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。

(2)以步骤(1)得到的DNA分子为模板，采用F8和R8组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F8：5'-CCAAGTCCGAAGACCAACAT-3'；

R8：5'-TCGTGATCAGCATCAATGGTC-3'。

上述引物中，方框标注LIC接头。

(3)取载体pCa-γbLIC，用限制性内切酶ApaI进行酶切，回收载体骨架。

(4)回收步骤(2)得到的PCR扩增产物，与步骤(3)得到的载体骨架进行LIC反应，得到干扰质粒。根据测序结果，对干扰质粒进行结构描述如下：在载体pCa-γbLIC的ApaI酶切位点***了序列表的序列4第478-836位核苷酸所示的DNA分子。

(5)将步骤(4)得到的干扰载体导入农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌γRi。将载体pCa-γbLIC导入农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌γ。将载体pCaBS-α导入农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌α。将载体pCaBS-β导入农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌β。

(6)用10mM氯化镁水溶液重悬重组农杆菌γRi，得到OD_600nm＝0.7的菌悬液，命名为菌悬液γRi。用10mM氯化镁水溶液重悬重组农杆菌γ，得到OD_600nm＝0.7的菌悬液，命名为菌悬液γ。用10mM氯化镁水溶液重悬重组农杆菌α，得到OD_600nm＝0.7的菌悬液，命名为菌悬液α。用10mM氯化镁水溶液重悬重组农杆菌β，得到OD_600nm＝0.7的菌悬液，命名为菌悬液β。

(7)将菌悬液γRi、菌悬液α和菌悬液β等体积混合，得到混合液甲。将菌悬液γ、菌悬液α和菌悬液β等体积混合，得到混合液乙。

(8)萌发4周的本氏烟植株，采用混合液甲或混合液乙对中上部两片完全展开的叶片进行注射(注满整个叶片)，然后培养植株2周，然后剪取与被注射叶片邻近的有病毒表型的叶片，加入磷酸钠缓冲液(pH7.2、20mM)研磨至匀浆，用纱布过滤，收集滤液，即为病毒液。

混合液甲和混合液乙进行平行操作，注射混合液甲得到的病毒液命名为病毒液甲，注射混合液乙得到的病毒液命名为病毒液乙。

2、沉默HvCAT1基因影响大麦对大麦白粉菌的抗性

(1)在病毒液甲中加入少量硅藻土，得到接种液甲。在病毒液乙中加入少量硅藻土，得到接种液乙。

(2)分组处理

试验组：萌发10天的大麦P01植株，采用接种液甲摩擦接种叶片，然后培养植株14天，然后剪取与被接种叶片邻近的有病毒表型的叶片，放置于含有培养基的培养皿上静置培养60小时。

阴性对照组：用接种液乙代替接种液甲，其他同试验组。

空白对照组：萌发10天的大麦P01植株，培养植株14天，然后剪取与试验组平行的叶片，放置于含有培养基的培养皿上静置培养60小时。

每组20片叶片。

培养基：含1g/100mL琼脂、100mg/L苯丙咪唑，余量为水。

(3)完成步骤(2)后，取叶片，用考马斯亮蓝R250染色，拍照并在显微镜下观察统计每片叶片中具有附着胞且具有菌丝体的大麦白粉菌数目和具有附着胞且不具有菌丝体的大麦白粉菌数目。微菌落指数＝具有附着胞且具有菌丝体的大麦白粉菌数目÷(具有附着胞且具有菌丝体的大麦白粉菌数目+具有附着胞且不具有菌丝体的大麦白粉菌数目)×100％。将空白对照组的微菌落指数作为100％，计算试验组微菌落指数的相对值。

完成步骤(2)的叶片中，HvCAT1基因的相对表达水平见图8(方法同步骤一)。

完成步骤(3)后，照片见图9，微菌落指数相对值的结果见图10。

阴性对照组与空白对照组叶片中HvCAT1基因的相对表达水平无显著差异。试验组叶片中HvCAT1基因的相对表达水平显著低于空白对照组。结果表明，试验组HvCAT1基因被有效沉默。

阴性对照组与空白对照组的微菌落指数无显著差异。试验组微菌落指数显著高于空白对照组。结果表明，试验组白粉菌微菌落数量明显增加。

以上结果表明，沉默HvCAT1基因降低了大麦对大麦白粉菌的抗性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> CSEP27蛋白及其编码基因和应用

<130> GNCYX172039

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> Blumeria graminis

<400> 1

Met Lys Leu Phe Thr Val Ala Ser Thr Ile Ala Ala Phe Ser Leu Leu

1 5 10 15

Asn Gln Val Asp Ala Asn Ala Glu Tyr Arg Cys Pro Gly Asn Thr Phe

20 25 30

Thr Ala His Tyr Ile His Thr Val Ala Ala Tyr Ala Trp Arg Ile Glu

35 40 45

Leu Tyr Thr His Gly Glu Tyr Pro His Val Ala Gln Leu Ala Pro Gln

50 55 60

Ser Ser Glu His Gly Pro Ala Arg Gln Phe Pro Leu Leu Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gln Ile Trp Gln Gly Gly Ser Tyr His His Val Val Ile Ser Asn Gln

85 90 95

Ala Arg Thr Val Leu Glu Val Tyr Glu Trp Arg Asn Asn Thr Trp Glu

100 105 110

Phe Cys Arg Gly Thr Asn Ile

115

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> Blumeria graminis

<400> 2

atgaaacttt tcaccgttgc ctctacaatt gcagcattca gccttttgaa ccaagtagat 60

gctaatgcag aatatcgctg tcctggaaat acttttactg cccattatat acataccgta 120

gcagcctatg cctggagaat tgagctttac actcatggcg aatatcccca tgtggcacaa 180

cttgcccctc aatctagtga acatgggcct gccagacagt ttccacttct ccttgcatcc 240

caaatttggc aaggcggaag ttaccatcat gtggttattt caaatcaggc taggactgta 300

ttagaagtat acgaatggag gaataataca tgggaatttt gcagaggcac gaatatttaa 360

<210> 3

<211> 492

<212> PRT

<213> Hordeum

<400> 3

Met Asp Pro Tyr Lys His Arg Pro Thr Ser Gly Ala Asn Ser Ala Tyr

1 5 10 15

Trp Thr Thr Asn Ser Gly Ala Pro Val Trp Asn Asn Asn Asn Ala Leu

20 25 30

Thr Val Gly His Arg Gly Pro Ile Leu Leu Glu Asp Tyr His Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Leu Ala Gln Phe Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val

50 55 60

His Ala Arg Gly Ala Ser Ala Lys Gly Phe Phe Glu Val Thr His Asp

65 70 75 80

Val Ser Gln Leu Thr Cys Ala Asp Phe Leu Arg Ala Pro Gly Val Gln

85 90 95

Thr Pro Val Ile Val Arg Phe Ser Thr Val Val His Glu Arg Gly Ser

100 105 110

Pro Glu Thr Leu Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr

115 120 125

Arg Glu Gly Asn Phe Asp Leu Val Gly Asn Asn Met Pro Val Phe Phe

130 135 140

Ile Arg Asp Gly Met Lys Phe Pro Asp Met Val His Ala Phe Lys Pro

145 150 155 160

Ser Pro Lys Thr Asn Met Gln Glu Asn Trp Arg Val Val Asp Phe Phe

165 170 175

Ser His His Pro Glu Ser Leu His Met Phe Thr Phe Leu Phe Asp Asp

180 185 190

Val Gly Ile Pro Leu Asn Tyr Arg His Met Asp Gly Phe Gly Val Asn

195 200 205

Thr Tyr Thr Leu Ile Ser Arg Asp Gly Lys Ala His Leu Val Lys Phe

210 215 220

His Trp Lys Pro Thr Cys Gly Val Lys Cys Leu Leu Asp Asp Glu Ala

225 230 235 240

Val Thr Val Gly Gly Thr Cys His Thr His Ala Thr Lys Asp Leu Thr

245 250 255

Asp Ser Ile Ala Ala Gly Asn Tyr Pro Glu Trp Lys Leu Phe Ile Gln

260 265 270

Thr Ile Asp Ala Asp His Glu Asp Arg Phe Asp Phe Asp Pro Leu Asp

275 280 285

Val Thr Lys Thr Trp Pro Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gln Pro Val Gly

290 295 300

Arg Met Val Leu Asn Lys Asn Ile Asp Asn Phe Phe Ala Glu Asn Glu

305 310 315 320

Gln Leu Ala Phe Cys Pro Ala Val Thr Val Pro Gly Ile His Tyr Ser

325 330 335

Asp Asp Lys Leu Leu Gln Thr Arg Ile Phe Ser Tyr Ala Asp Thr Gln

340 345 350

Arg His Arg Leu Gly Pro Asn Tyr Leu Met Leu Pro Val Asn Ala Pro

355 360 365

Lys Cys Ala His His Asn Asn His His Asp Gly Leu Met Asn Phe Ile

370 375 380

His Arg Asp Glu Glu Val Asn Tyr Phe Pro Ser Arg Phe Asp Pro Thr

385 390 395 400

Arg His Ala Glu Lys Tyr Pro Met Pro Pro Arg Val Leu Ser Gly Cys

405 410 415

Arg Glu Lys Cys Ile Ile Asp Lys Glu Asn Asn Phe Lys Gln Ala Gly

420 425 430

Glu Arg Tyr Arg Ser Phe Asp Pro Ala Arg Gln Asp Arg Phe Leu Gln

435 440 445

Arg Trp Val Asp Ala Leu Thr Asp Ala Arg Val Thr His Glu Ile Gln

450 455 460

Ser Ile Trp Val Ser Tyr Trp Ser Gln Cys Asp Ala Ser Leu Gly Gln

465 470 475 480

Lys Leu Ala Ser Arg Leu Lys Ile Lys Pro Asn Met

485 490

<210> 4

<211> 1479

<212> DNA

<213> Hordeum

<400> 4

atggatccct acaagcaccg gcccacgagc ggggccaact ccgcctactg gaccaccaac 60

tccggcgccc ccgtctggaa caacaacaac gccctcaccg tcggacaccg aggacctatc 120

ctccttgagg attaccatct gattgaaaag cttgcacaat ttgaccggga acgcatacct 180

gaacgtgttg ttcatgcacg gggagccagt gcaaaggggt tctttgaggt gactcatgat 240

gtttctcagc tcacatgtgc tgactttctc cgggctcctg gggttcagac cccggttatt 300

gtccggttct ctaccgttgt gcatgagcgt ggaagccctg agaccctcag ggatccacgt 360

ggttttgcag tgaagttcta caccagagag ggtaactttg accttgttgg gaacaatatg 420

cctgtgtttt ttatccgaga tgggatgaag ttccctgaca tggtccatgc tttcaagcca 480

agtccgaaga ccaacatgca ggagaactgg agagtagttg acttcttttc gcaccacccg 540

gagagtctgc acatgttcac cttcctattt gacgatgttg gcattccact caactacagg 600

cacatggacg gttttggtgt caacacctac accttaatca gcagggatgg aaaggctcac 660

ctggttaagt tccattggaa acctacatgt ggtgtgaagt gcctcttgga tgatgaagct 720

gttactgttg gaggcacctg ccacacccat gccacaaagg acttgactga ttctattgca 780

gctgggaatt acccagaatg gaagcttttc atccagacca ttgatgctga tcacgaggat 840

agatttgact ttgaccctct tgatgtcacc aagacctggc cagaggacat catcccactg 900

caaccagttg gacggatggt actgaacaag aacattgaca atttcttcgc ggaaaatgaa 960

cagcttgctt tctgcccagc agtcactgtc cctggaatcc actactctga tgataagctg 1020

ctccagacaa ggatcttctc atatgctgat acccaaaggc accgtcttgg tccaaactac 1080

ttgatgctcc ccgtgaatgc cccgaaatgt gctcaccaca acaaccatca tgatggctta 1140

atgaatttca ttcacaggga tgaggaggtg aactacttcc cttcaaggtt tgatcctact 1200

cgtcatgctg aaaagtaccc tatgcctccg cgtgttctat ctggctgccg ggagaagtgc 1260

attatcgaca aggagaacaa tttcaagcag gctggtgaga gatatcggtc cttcgaccct 1320

gccaggcaag accgtttcct ccagcggtgg gttgatgcgc tcacggatgc tcgtgtcacc 1380

catgaaatcc agagcatctg ggtctcatac tggtcacagt gcgatgcgtc cctcgggcag 1440

aagctggcgt cgcggctcaa gattaagccg aacatgtaa 1479

<210> 5

<211> 99

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Asn Ala Glu Tyr Arg Cys Pro Gly Asn Thr Phe Thr Ala His Tyr

1 5 10 15

Ile His Thr Val Ala Ala Tyr Ala Trp Arg Ile Glu Leu Tyr Thr His

20 25 30

Gly Glu Tyr Pro His Val Ala Gln Leu Ala Pro Gln Ser Ser Glu His

35 40 45

Gly Pro Ala Arg Gln Phe Pro Leu Leu Leu Ala Ser Gln Ile Trp Gln

50 55 60

Gly Gly Ser Tyr His His Val Val Ile Ser Asn Gln Ala Arg Thr Val

65 70 75 80

Leu Glu Val Tyr Glu Trp Arg Asn Asn Thr Trp Glu Phe Cys Arg Gly

85 90 95

Thr Asn Ile

<210> 6

<211> 300

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgaatgcag aatatcgctg tcctggaaat acttttactg cccattatat acataccgta 60

gcagcctatg cctggagaat tgagctttac actcatggcg aatatcccca tgtggcacaa 120

cttgcccctc aatctagtga acatgggcct gccagacagt ttccacttct ccttgcatcc 180

caaatttggc aaggcggaag ttaccatcat gtggttattt caaatcaggc taggactgta 240

ttagaagtat acgaatggag gaataataca tgggaatttt gcagaggcac gaatatttaa 300

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由序列表中序列1第22-119位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a3)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a4)含有(a1)或(a2)或(a3)的融合蛋白；

(a6)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接标签得到的融合蛋白；

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)所述的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表中序列2第64-357位核苷酸所示的DNA分子；

(b3)编码区如序列表中序列6所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)至(c6)中的至少一种：

(c1)调控大麦白粉菌的致病力；

(c2)增加大麦白粉菌的致病力；

(c3)促进植物中H₂O₂的积累；

(c4)促进植物细胞死亡；

(c5)调控植物中HvCAT1蛋白的水平；

(c6)降低植物中HvCAT1蛋白的水平。

6.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入权利要求2或3所述基因，得到转基因植物；所述转基因植物对大麦白粉菌的抗性低于所述出发植物。

7.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在目的植物中导入抑制权利要求2或3所述基因表达的物质，得到转基因植物；所述转基因植物对大麦白粉菌的抗性高于所述目的植物。

8.一种蛋白质，是如下(d1)或(d2)：

(d1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

9.编码权利要求8所述蛋白质的基因。

10.权利要求8所述蛋白质的应用，为如下(f1)或(f2)中的至少一种：

(f1)调控植物对大麦白粉菌的抗性；

(f2)增加植物对大麦白粉菌的抗性。