CN109781825B - 水稻清蛋白的提取方法及电泳检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供水稻清蛋白的提取方法及电泳检测方法。稻米经自然风干后，研磨成大米粉，向大米粉中按固液比1g：1mL加入水，搅拌至均匀，浸提1h后离心，取上清液，即为水稻清蛋白提取液。利用本发明提供的水稻清蛋白提取方法，提取的清蛋白更加充分，提高了清蛋白的提取率，且得到的电泳图谱更加清晰。本发明首次将水稻清蛋白电泳技术应用于稻米食味品质评价中，从蛋白质组分结构方面对稻米食味品质进行评价，更加科学。本发明的水稻清蛋白提取方法，适合于不同来源的水稻品种的鉴定，对指导水稻品质育种等具有重要意义。

Description

水稻清蛋白的提取方法及电泳检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及水稻清蛋白的提取方法及电泳检测方法。

背景技术

水稻品种的品质性状已成为育种工作的重要目标，早期品质选择方法的实用性与合理性是育种者关心的重要问题。水稻食味品质是水稻品质育种的终极目标，在水稻早期世代材料筛选上一直是盲区，没有较好的评价技术。蛋白质作为稻米品质的主要性状，是稻米品质改良不可忽视的重要方面。关于蛋白质与稻米品质之间的关系，国内外已有的报道主要集中在表观蛋白质含量与食味品质之间的关系变化上。通常稻米蛋白质含量越高其食味值越低，而对于蛋白质含量接近的稻米其食味值有的相差较大，需从蛋白质组分、结构方面加以阐述。

水稻蛋白质中的贮藏蛋白质是水稻的第二大营养成分，含量占5.5％-12％。稻米中的蛋白质根据其在不同溶剂中的溶解性不同可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。贮藏蛋白在稻米中分布不均，清蛋白主要分布在糊粉层和次糊粉层。研究表明，清蛋白约占水稻总贮藏蛋白的2％-5％，是与食味品质相关的蛋白。目前有关清蛋白的研究报道甚少。仅发现一篇关于清蛋白提取方法的报道(氮素对稻米蛋白质组分含量及蒸煮食味品质的影响，杨静，东北农业大学农学院，2006年)，但得到的清蛋白含量较低，提取不充分。清蛋白电泳技术，尚未见相关报道。因此，开展水稻食味品质蛋白质电泳评价技术，将该技术用于水稻早期世代材料筛选，对于缩短育种年限，加快水稻育种进程，提高水稻育种效率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对目前水稻清蛋白提取方法中存在的问题，提供一种快速且提取率高的水稻清蛋白的提取方法。

本发明的另一目的是针对目前水稻清蛋白电泳技术空白的现状，提供了一种与稻米食味品质评价显著相关的水稻清蛋白的电泳方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供水稻清蛋白的提取方法，稻米经自然风干后，研磨成大米粉，向大米粉中按固液比1g：1mL加入水，搅拌至均匀浸提1h后离心，取上清，即为水稻清蛋白提取液。

前述的方法，浸提后优选于室温下15000r/min离心5min。

第二方面，本发明提供水稻清蛋白的电泳检测方法，将上述获得的水稻清蛋白提取液与蛋白提取液混合，静置一段时间后，离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。

其中，所述蛋白提取液为：0.125mol/L Tris-HCl pH6.8，4％SDS，20％甘油，4mol/L脲素，5％β-巯基乙醇。

前述的电泳检测方法包括以下步骤：

1)取100μL水稻清蛋白提取液于离心管内，加入100μL蛋白提取液，振荡混匀，4℃静置30min；然后10000r/min离心5min，取上清进行SDS-PAGE电泳；

2)电泳结束，取出凝胶，于三氯乙酸溶液中固定；

3)染色与脱色：将固定后的凝胶转移至考马斯亮蓝R-250溶液中，摇床染色，然后脱色。

进一步地，步骤1)进行SDS-PAGE电泳所配制的凝胶为：15％的分离胶和4％的浓缩胶；在分离胶中，电压为100V，至浓缩胶时，电压降至80V，电泳总时长2.5h。

步骤2)将凝胶于10％三氯乙酸溶液中固定2h。

步骤3)中摇床转速70r/min，染色2h。

优选地，SDS-PAGE电泳的进样量为10μL/孔。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)利用本发明提供的水稻清蛋白提取方法，提取的清蛋白更加充分，提高了清蛋白的提取率，且得到的电泳图谱更加清晰。

(二)本发明首次建立了水稻清蛋白的电泳方法，填补了水稻清蛋白电泳检测技术与食味品质评价研究领域的空白。

(三)水稻清蛋白与食味品质紧密相关，本发明结合电泳技术，为水稻食味品质鉴定提供理论依据，同时弥补了水稻清蛋白电泳技术空白的现状。

(四)本发明首次将水稻清蛋白电泳技术应用于稻米食味品质评价中，从蛋白质组分结构方面对稻米食味品质进行评价，更加科学。

(五)本发明的水稻清蛋白提取方法，适合于不同来源的水稻品种的鉴定，对指导水稻育种等具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中两种水稻清蛋白提取方法下的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，A对应于方法一，B对应于方法二。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1水稻清蛋白的提取及电泳检测

1、大米样品的制备：稻米经自然风干后，每个稻米样品称取100g。先用糙米机碾成糙米，再将糙米通过精米机碾成精米。精米经磨粉机碾磨成粉，-20℃冰箱保存备用。

2、大米蛋白含量的测定：利用凯氏定氮仪进行测定。所选样品龙粳香1号和高粱稻粗蛋白质含量见表1。

3、大米食味评分的测定：利用食味计结合感官评分进行测定。食味评分结果见表1。

表1粗蛋白质含量和食味评分

品种名称	粗蛋白质含量	食味评分
			龙粳香1号	7.91％	71
高粱稻	7.70％	90

4、清蛋白提取：

方法一：该方法已报道。称取0.1g精米粉于2mL离心管内，加入1mL蒸馏水，于摇床上振荡提取2h，室温下10000r/min离心10min。将上清液转移到10mL刻度试管中，重复提取3次合并提取液，即为清蛋白溶液，-20℃保存备用。

方法二：本发明方法。称取1g精米粉于2mL离心管内，加入1mL蒸馏水，搅拌至均匀，浸提1h。室温下15000r/min离心5min。取上清液(清蛋白溶液)于2mL离心管内，-20℃保存备用。

5、凝胶的配制：分别选择15％的分离胶和4％的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳试验。

6、蛋白提取液的配制：0.125mol/L Tris-HCl pH6.8，4％SDS，20％甘油，4mol/L脲素，5％β-巯基乙醇。

7、电泳检测：取100μL清蛋白溶液于2mL离心管内，加入100μL蛋白提取液。涡旋振荡1min，混匀。4℃静置30min。然后10000r/min离心5min。取上清进行电泳试验，进样量为10μL/孔。在分离胶中，电压为100V，至浓缩胶时，电压降至80V。电泳时间为2.5h。

8、蛋白固定：电泳结束，取出凝胶。置于10％三氯乙酸溶液中固定2h。

9、染色与脱色：凝胶置于40mL考马斯亮蓝R-250溶液中，摇床染色2h。然后脱色。

清蛋白电泳结果如图1所示，由图1可知，方法一得到的清蛋白电泳图谱，几乎看不见谱带(A)；而方法二得到的清蛋白图谱中谱带清晰可见(B)，且方法二在两个水稻品种中的提取效果基本相同，说明本方法具有广泛适用性，稳定性好。

换不同操作人员按照上述方法进行水稻清蛋白的提取及电泳检测，结果基本一致。

图1B中是两个粗蛋白质含量相近，但食味评分不同的水稻品种。从图中可以看出，龙粳香1号在70-105KDa处出现了谱带的缺失，而高粱稻谱带正常。初步推断，105KDa清蛋白谱带缺失可能与稻米的食味评分有关。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.水稻清蛋白的电泳检测方法，其特征在于，稻米经自然风干后，研磨成大米粉，向大米粉中按固液比1g：1mL加入水，搅拌至均匀，浸提1h后于15000r/min离心5min，取上清液，即为水稻清蛋白提取液；

将水稻清蛋白提取液与蛋白提取液混合，静置一段时间后，离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测；

其中，所述蛋白提取液为：0.125mol/L Tris-HCl pH6.8，4％SDS，20％甘油，4mol/L脲素，5％β-巯基乙醇；

所述稻米来源于水稻品种龙粳香1号、高粱稻；

电泳检测包括以下步骤：

1)取100μL水稻清蛋白提取液于离心管内，加入100μL蛋白提取液，振荡混匀，4℃静置30min；然后10000r/min离心5min，取上清进行SDS-PAGE电泳；

2)电泳结束，取出凝胶，于三氯乙酸溶液中固定；

3)染色与脱色：将固定后的凝胶转移至考马斯亮蓝R-250溶液中，摇床染色，然后脱色；

步骤1)进行SDS-PAGE电泳所配制的凝胶为：15％的分离胶和4％的浓缩胶；在分离胶中，电压为100V，至浓缩胶时，电压降至80V，电泳总时长2.5h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将凝胶于10％三氯乙酸溶液中固定2h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中摇床转速70r/min，染色2h。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)SDS-PAGE电泳的进样量为10μL/孔。

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