CN109777780A - 一种构建rbm17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法 - Google Patents
一种构建rbm17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，包括以下步骤：(1)构建用于表达SEQ ID NO：6所示的CREnhancer 2.0基因的质粒；(2)构建用于表达sgRNA的质粒；(3)将步骤(1)的质粒提前导入到间充质干细胞中，筛选得到阳性细胞后，再转入步骤(2)的质粒。本发明筛选并优化获得了最佳的sgRNA，使用了新的增效蛋白CREnhancer 2.0，在间充质干细胞中，构建了RBM17基因敲除的细胞系，基因编辑效率高，传代稳定。
Description
技术领域
本发明提供一种采用CRISPR-CAS***针对间充质干细胞进行RBM17基因编辑的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞具备的这种免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。
RNA结合基序蛋白17(RBM17)编码一种RNA结合蛋白，该蛋白参与RNA剪接体复合物的构成，并且在mRNA剪接的第二催化步骤中发挥作用。RBM17包含一个非结构化N-末端结构域，一个G-补丁基序，以及一个mRNA剪接必需的C端的RNA识别基序。在人类中，RBM17在正常乳腺、肝、***和胰腺的导管上皮中均有低表达，但是其在很多人类癌症中均有过表达；现有技术中已经发现，通过抑制靶细胞中RBM17基因的表达，可进一步抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，可见，RBM17基因敲除在肿瘤治疗中具有重要意义。
基于间充质干细胞的多能性，为了研究敲除RBM17基因的间充质干细胞在癌症治疗方面的功能，建立敲除RBM17基因的间充质干细胞细胞系变得尤为重要。现有技术中，仍然存在基因编辑效率不够高，不能稳定遗传等问题。
发明内容
鉴以此，本发明提供一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，构建出一种敲除RBM17基因的间充质干细胞，克服了现有技术中基因编辑效率不够高的技术缺陷。
本发明的技术方案是：
一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，包括以下步骤：
(1)构建用于表达SEQ ID NO：6所示的CREnhancer 2.0基因的质粒；
(2)构建用于表达sgRNA的质粒；
(3)将步骤(1)的质粒提前导入到间充质干细胞中，筛选得到阳性细胞后，再转入步骤(2)的质粒。
优选的，所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015。
所述的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明筛选并优化获得了最佳的sgRNA，使用了新的增效蛋白CREnhancer 2.0，在间充质干细胞中，构建了RBM17基因敲除的细胞系，基因编辑效率高，传代稳定。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例1、CRISPR表达载体的构建
1.1sgRNA的设计
设计具体的sgRNA如下(SEQ ID NO:1～5)：
RBM17-sgRNA1:5'-ctcctcctcatgtctgcctc-3'
RBM17-sgRNA2:5'-atctgacaggagaatgtcca-3'
RBM17-sgRNA4:5'-catttcccctccaagacaac-3'
RBM17-sgRNA5:5'-atctccagttgacgatgtca-3'
RBM17-sgRNA3:5'-gacagaccgagatctccaac-3'
根据上述的gRNA，在其5'端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段，如下：
正向：5'-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，
反向：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'，
变性、退火体系为：2μL正向寡核苷酸链(50μM)，2μL反向寡核苷酸链(50μM)，46μLl*NEB buffer；
PCR反应程序为：90℃，4min；70℃，10min；37℃，20min；25℃，20min。
退火后的双链寡核苷酸链含有BbsI的粘性末端，直接与被BbsI酶切过的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(下称PX330)(序列参见CN107760684A)载体进行连接，得PX330-gRNA-Cas9重组质粒。
酶切体系：水39.3μL，10*FD buffer 5μL，BbsI 2μL，PX330 3.7μL(2μg)，37℃水浴2h酶切后的回收质粒。
连接体系：退火产物0.5μL，线性化的PX330质粒2μL，5*ligation buffer 2μL，T4DNALigase(3units/μL)1μL，水4.5μL，16℃水浴2h，将上述步骤得到的连接产物转化至JM109感受态细胞，涂布于Amp+的LB平板，挑取阳性克隆接菌，37℃摇菌过夜，提取质粒并测序鉴定，得到PX330-gRNA质粒。
实施例2克隆增效蛋白CREnhancer2.0基因及构建载体
通过全基因合成的方法，获得SEQ ID NO：6所述的基因序列，以该序列为模板，根据上下游引物序列5'-atgcgaactcgaggagaaccctg-3'和5'-cagtctcggcagcctactctcg-3'，PCR反应扩增CREnhancer2.0基因目的基因片段。PCR反应程序为：95℃、40s，57℃、1min，70℃、1min，70℃、10min，循环35次，PCR产物由上海生工有限公司进行测序鉴定。将PCR扩增的目的基因连接在空载体慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上，构建重组慢病毒载体。随后将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015，得到能表达CREnhancer 2.0基因的人骨髓间质干细胞。通过PCR筛选鉴定，将稳定转染的干细胞用于后续基因编辑。
实施例3 CRISPR/Cas9在人骨髓间质干细胞中的应用
基于含BSD-fsEGFP融合基因pBGN质粒的CRISPR/Cas9编辑载体：
(1)BSD-fsEGFP融合基因：PCR扩增BSD基因，5'-PCR引物带HindIII位点，3'-PCR引物引入I-SceI和EcoRI位点。将PCR产物(BSD)***到EGFP质粒中CMV启动子和EGFP编码区之间的HindIII和EcoRI位点，获得含BSD-fsEGFP融合基因的质粒pBGN。该融合基因由CMV启动子或PGK启动子驱动，但EGFP由于移码而无活性，因此称fsEGFP。
5'-PCR引物为：
ctcaagcttaactaaaccatggccaagcctttgtctcaagaag，
3'-PCR引物为：
agaattccagtagggataacagggtaatgccaggtccgccctcccacacataaccagag。
(2)将测试质粒pBGN、实施例1制备的表达质粒共转染人骨髓间质干细胞。以未转染实施例2的增效基因的干细胞作为阳性对照，同时，将常规用的GFP表达质粒平行转染细胞以测定转染效率，利用转染效率校正获取的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。
(4)转染3天后，利用流式细胞仪测量GFP+细胞的频率。
(5)计算特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。此相对效率由GFP阳性细胞频率与转染效率的比值代表，结果如表3所示。
| 阳性频率 | sgRNA1 | sgRNA2 | sgRNA3 | sgRNA4 | sgRNA5 |
| 导入增效蛋白 | 0.20 | 0.22 | 0.39 | 0.29 | 0.97 |
| 未导入增效蛋白 | 0.02 | 0.04 | 0.11 | 0.05 | 0.61 |
未转染实施例2的增效蛋白的干细胞中GFP阳性细胞频率明显低于转染了实施例2的增效蛋白的细胞。其中在5个sgRNA中，RBM17-sgRNA5具有较好的基因编辑效果。采用空载体制备的阴性对照没有GFP阳性细胞，其中P值均小于0.01，具有统计学意义。
将骨髓间质干细胞RBM17-sgRNA5(即采用RBM17-sgRNA5进行CRISPR编辑后获得的干细胞)进行稳定传代培养，培养45代之后，通过针对RBM17PCR测序，发现该基因仍然是突变失活的，保持了基因被敲除的效果。说明本发明构建的敲除***具有较好的稳定性。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
序列表
<110> 上海拉德钫斯生物科技有限公司
<120> 一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcctcctca tgtctgcctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atctgacagg agaatgtcca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catttcccct ccaagacaac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atctccagtt gacgatgtca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacagaccga gatctccaac 20
<210> 6
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acccaggaga acctggcccc ctggggcgag ctggccaccg acaacatcat cctgaccgtg 60
cccaccacca acctgcaggc cctgaaggac cccgagcccg tgctgaggct gtgggacgag 120
accatgcagg ccgtggccag gctggccgcc gagcccttcc ccttcaggag gcccgagagg 180
atcgtggccg acgtgcagat cagcgccgag tggatgcaga gcggctaccc catcacctgc 240
cagctggaga gcgtgaagga gatcatcaac gagaccgaca tgaggagcag ggaggtgtgg 300
gagcccatcc acgagctggg ccagaaccag cagaggcacg gctgcaagtt ccccccccac 360
accaccgagg ccacctgcaa cctgtggagc gtgtacgtgc acgagaccgt gctgggcatc 420
cccagggccc aggcccagga ggccctgagc ccccccgaga gcaagaggag gatcaaggcc 480
cagctgcaca agggcgcccc cctgtgcgac tggaacgtgt ggaccgccct ggagacctac 540
ctgcaggtgc tgagcaggaa cagcggcagg aggggcgtgg acggcaggct ggtgcagacc 600
tgcatcaagg ccggcgccgt gaggtggctg gccaggggcc agaccggcaa ggtgggcgtg 660
aacaccaacc tgaaggacct gtgccccctg ctgagcgagc acggcctgca gtgcagcctg 720
gagccccacc tgaacagcga cctgtgcgtg tactgctgca aggcctacag cgacaaggag 780
gccaagcagc tgcaggagtt cgtggccgag gagggcggcc tgctgatcgg cggccaggcc 840
tggtggtggg ccagccagaa ccccggccag tgccccctgg ccggcttccc cgagaacatc 900
atcctgaact gcttcggcct gagcatcctg ccccagaccc tgaaggccgg ctgcttcccc 960
gtgcccaccc ccgagaccag gagctaccac ttcaggaagg ccctgagcca gttccaggcc 1020
atcctgaacc acgagaacgg caacctggag aagagctgcc tggccaagct gagggtggac 1080
ggcgccgcct tcctgcagat ccccgccgag ggcgtgcccg cctacatcag cctgcagagg 1140
ctgctgagga agatgctgag gggcagcggc ctgcccgccg tgagcaggga gaaccccgtg 1200
gccagcgaca gctacgaggc cgccgtgctg agcctggcca ccggcctggc ccacagcgag 1260
accgactgca gccagctggc ccagggcctg ggcacctgga cctgcagcag cagcctgtac 1320
cccagcaagc accccatcac cgtggagatc aacggcatca accccggcaa caacgactgc 1380
tgggtgagca ccggcctgta cctgctggag ggccagaacg ccgaggtgag cctgagcgag 1440
gccgccgcca gcgccggcct gagggtgcag atcggctgcc acaccgacga cctgaccaag 1500
gccaggaagc tgagcagggc ccccaccgtg acccaccagt gctggaccga caggaccgag 1560
aggagcgtga gctgcctg 1578
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcgaactc gaggagaacc ctg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtctcggc agcctactct cg 22
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcaagctta actaaaccat ggccaagcct ttgtctcaag aag 43
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agaattccag tagggataac agggtaatgc caggtccgcc ctcccacaca taaccagag 59
Claims (3)
1.一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建用于表达SEQ ID NO：6所示的CREnhancer 2.0基因的质粒；
(2)构建用于表达sgRNA的质粒；
(3)将步骤(1)的质粒提前导入到间充质干细胞中，筛选得到阳性细胞后，再转入步骤(2)的质粒。
2.根据权利要求1所述的构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，其特征在于，所述的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
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