CN109762099B - 一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种如式(Ⅰ)所示的聚合物及其制备方法。本发明制备得到的聚合物具有较窄的多分散指数。本发明还提供了一种聚合物‑抗肿瘤药物偶联物及其制备方法。本发明制备得到的聚合物‑抗肿瘤药物偶联物具有更长的血液循环时间并且可以在肿瘤部位获得更大的药物积累，使得药物具有更好的抗肿瘤作用，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和用途。

背景技术

作为纳米级给药***的聚合物-药物偶联物目前已经成为靶向癌症化疗研究领域的一大热点。将低分子量的抗癌药物与生物相容性良好的水溶性聚合物缀合，已经成为改善小分子药物抗癌功效的一般策略。这是因为基于聚合物-药物偶联物的给药***具有许多独特的结构和性质，从而能够具有提高药物的溶解性和稳定性的潜力，通过增强的通透性和保留(EPR)作用增加药物在肿瘤的积聚，并减少其副作用。例如，拓扑异构酶II抑制剂阿霉素(DOX)可诱导不可逆的单链和双链DNA断裂转录和复制，然而由于其短暂的血浆半衰期和非靶向性，已被证明难以在肿瘤部位有效地积累，并且其可以迅速扩散到心脏中，导致潜在的心脏毒性。为了解决这些问题，将DOX通过肿瘤微环境敏感的连接子缀合到聚合物上而制备的聚合物-DOX缀合物可以有效地提高其治疗效果。然而，尽管聚合物作为药物载体方面的研究取得了很大进展，但是，目前仅有少数几种聚合物被用于体内和临床的研究，这主要是由于聚合物的内在毒性和/或免疫原性。

因此，选择安全有效的聚合物载体对聚合物给药***的构建有重要的作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物。

本发明首先提供了一种如式(Ⅰ)所示的聚合物：

其中，R为

x为43～265；y为1～8。

进一步地，所述聚合物的重均分子量为28～35KDa。

本发明还提供了一种制备上述聚合物的方法，包括以下步骤：

取单体(a)、MA-Ala-NHNHBoc、链转移剂和引发剂，在有机溶剂存在的条件下，于45±3℃反应，即得式(I)所示化合物；

进一步地，单体(a)为N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺或聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯。

进一步地，单体(a)为N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺时，单体(a)、MA-Ala-NHNHBoc、链转移剂及引发剂的摩尔比为1225：65：3～4：1。

进一步地，单体(a)聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯时，单体(a)、MA-Ala-NHNHBoc、链转移剂及引发剂的摩尔比为315～316：69～70：2～3：1。

进一步地，所述有机溶剂为甲醇水溶液；链转移剂为4-氰基戊酸二硫代苯甲酸；引发剂为2,2'-[偶氮双(1-甲基亚乙基)]双[4,5-二氢-1H-咪唑]二盐酸盐。

进一步地，所述甲醇水溶液中，甲醇为80％v/v。

本发明还提供了一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物，所述偶联物是由上述聚合物脱保护后，与盐酸阿霉素反应，即得聚合物-抗肿瘤药物偶联物，结构如下：

进一步地，所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物单位重量的载药量为3～12％；优选4.5～6％。

本发明还提供了一种制备权利要求上述聚合物-抗肿瘤药物偶联物的方法，包括以下步骤：取权利要求1或2所述聚合物脱保护后，与盐酸阿霉素反应，即得聚合物-抗肿瘤药物偶联物。

本发明还提供了上述聚合物-抗肿瘤药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的用途。

进一步地，所述肿瘤包括恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、***癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌。

本发明还提供了一种药物组合物，它是以上述聚合物-抗肿瘤药物偶联物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助成分制备成药学上常用的制剂。

本发明制备得到的聚合物多分散指数窄。由此聚合物制备得到的聚合物-抗肿瘤药物偶联物具有更长的血液循环时间并且可以在肿瘤部位获得更大的药物积累，使得药物具有更好的抗肿瘤作用，具有广阔的市场应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是实施例1制备的pOEGMA-DOX和实施例2制备的pHPMA-DOX的合成步骤和化学结构。

图2是不含药物的OEGMA共聚物和pOEGMA-DOX缀合物(溶于D₂O中)的¹H NMR谱(A)；实施例2制备的无药HPMA共聚物和pHPMA-DOX缀合物(溶于D2O中)的¹H NMR谱(B)。

图3是pOEGMA-DOX的粒径分布，ζ电势和TEM图像(A，9.8nm；B，-2.29mV；C，约10-20nm)和pHPMA-DOX的尺寸分布，ζ电势和TEM图像(D，10.3nm；E，-0.32mV；F，约10nm)。

图4是pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX在PBS和细胞培养基中的粒径大小和PDI随时间的变化情况，数值代表平均值±SD，在E和F所示为pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX在含有10％FBS的PBS中的大小，图G所示为不含材料的加有10％FBS的PBS的DLS测试结果。

图5是pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX在37℃在磷酸盐缓冲液(pH 7.4或5.4)中孵育后60小时后DOX的释放曲线。

图6是pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX的细胞摄取结果，分别用两种材料对4T1细胞孵育2小时，4小时和6小时(A1-C2)(比例尺为10μm)。

图7是在不同时间点与载有DOX的聚合物孵育后，4T1细胞的流式细胞术分析(A)，在4T1细胞中孵育0.5小时后游离DOX的细胞摄取(B)；细胞核用DAPI(蓝色)染色，并且DOX的荧光被设定为红色(比例尺为10μm)。

图8是不含药物的pOEGMA聚合物和不含药物的pHPMA聚合物对4T1细胞的细胞毒性(A)，游离DOX，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX对4T1细胞的细胞毒性(B)。

图9是用膜联蛋白V-FITC标记4T1细胞后通过通过流式分析检测的细胞凋亡。

图10是在Balb/c小鼠(n＝5)中以4mg/kg的剂量静脉内施用DOX，pEOGMA-DOX和pHPMA-DOX之后DOX的平均血浆浓度-时间曲线。

图11是离体荧光成像研究(n＝5)：A1-4分别为在注射生理盐水(上排)，DOX·HCl(第二排)，pOEGMA-DOX(第三排)以及pHPMA-DOX(下排)后6小时，12小时，24小时和36小时的小鼠的荧光成像；B，C，D分别为pOEGMA-DOX，pHPMA-DOX和DOX通过Maestroan体内成像***获得的半定量平均荧光信号；E为pOEGMA-DOX，pHPMA-DOX和DOX的肿瘤部位的平均信号。

图12是各种DOX制剂的体内抗癌功效：(A)在4T1肿瘤模型(n＝7)中静脉注射生理盐水，DOX·HCl(4或8mg/kg)，pHPMA-DOX(4或8mg/kg)以及pOEGMA-DOX(4或8mg/kg)后的肿瘤生长曲线；(B)实验过程中小鼠体重变化；(C)各组小鼠肿瘤称重；(D)各实验组肿瘤抑制率(TGI)。

具体实施方式

材料

聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA，Mw＝500Da)，2,2'-[偶氮双(1-甲基亚乙基)]双[4,5-二氢-1H-咪唑]二盐酸盐(VA044)，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(CTA)，盐酸多柔比星(DOX·HCl)以及所有其他试剂和溶剂购自Sigma-Aldrich。

HPMA参考文献Ulbrich K,

V,Strohalm J,et al.Polymeric drugs basedon conjugates of synthetic and natural macromolecules:I.Synthesis andphysico-chemical characterisation[J].Journal of controlled release,2000,64(1):63-79的方法合成。

MA-Ala-NHNHBoc参考文献Etrych T,Mrkvan T,Chytil P,et al.N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide-based polymer conjugates with pH-controlledactivation of doxorubicin.I.New synthesis,physicochemical characterizationand preliminary biological evaluation[J].Journal of applied polymer science,2008,109(5):3050-3061的方法合成。

4T1乳腺癌细胞从中国科学院典型培养物保藏中心细胞库购买(中国,上海),用RPMI1640培养基(美国生命技术公司)培养，包含10％(v/v)胎儿牛血清(FBS，Hyclone)和1％(v/v)青霉素/链霉素，在恒温恒湿细胞培养箱(5％CO₂；37℃)培养。雌性BALB/c小鼠(体重20±1.2g和6～8周龄)，购于成都达硕生物科技有限公司。所有动物实验均按照中国有关国家和四川大学伦理委员会的规定执行。

使用

/FPLC***(GE Healthcare)的尺寸排阻色谱(SEC)来测量聚合物的平均分子量和多分散指数(PDI)。选择乙酸钠缓冲液(H ₂O:ACN＝70:30，v、v，pH＝6.5)作为流动相。使用GE Healthcare Superose 6HR10/30色谱柱，流速为0.4mL/min。通过¹H NMR表征聚合物结构。通过动态光散射(DLS)表征聚合物的尺寸和zeta电位。使用Varian Cary400Bio紫外可见分光光度计测试UV-vis光谱。使用Student’s t检验来进行统计分析。结果表示为平均值±标准偏差(SD)。p值<0.05的被认为具有统计学显着性差异，p值<0.01被认为具有高度显著性差异。

实施例1、合成pHPMA-DOX聚合物药物偶联物

合成步骤如图1所示。

1、pHPMA-NHNHBoc的制备

将链转移剂CTA(7.0mg,0.025mmol)，单体HPMA(1400.0mg，9.8mmol)，MA-Ala-NHNHBoc(140.0mg，0.52mmol)按比例加入15mL小口圆底瓶内，抽换氩气(重复3次)。冰浴下，将溶有引发剂VA044(2.7mg,0.008mmol)的溶剂(H₂O/CH₃OH＝1:4，7.0mL)用注射器加入圆底瓶中，继续通氩气鼓泡30分钟。然后将圆底瓶转移至45℃条件下避光反应17小时，淬灭反应后，将反应液滴至丙酮和***的混合溶液(300mL，acetone/ether＝1：1)中,收集沉淀，过滤后真空干燥，粗产物经FPLC过柱纯化，收集含产物部分的流动相，以去离子水为介质，将收集流动相置于透析袋(MWCO 2000)中透析1.5天，冷冻干燥即得pHPMA-NHNHBoc(Mw＝34kDa,PDI＝1.08)。

2、pHPMA-NHNH₂的制备

称取pHPMA-NHNHBoc(750.0mg)加入50mL圆底瓶中，冰浴搅拌下，加入10mL二氯甲烷，再缓慢加入10mLTFA。室温反应10h后，减压悬蒸除去溶剂，将剩余物用去离子水溶解，置于透析袋(MWCO 3500)中透析1.5天，冷冻干燥即得脱掉Boc基团的pHPMA-NHNH₂。

3、pHPMA-DOX的制备

将上述产物pHPMA-NHNH₂(545.0mg)溶于pH 5.7的醋酸铵缓冲溶液(20mL，0.1M)中，冰浴下，加入盐酸阿霉素(DOX·HCl，400.0mg)，避光反应两天。以去离子水为介质，将反应液置于透析袋(MWCO 2000)中透析至去离子水变为无色，收集产物，冷冻干燥即得pHPMA-DOX。利用紫外分光光度计检测阿霉素含量，测得所得聚合物偶联物载药量为4.7％。

实施例2、合成pOEGMA-DOX聚合物药物偶联物

合成步骤如图1所示。

1、pPEG-NHNHBoc的制备

将链转移剂CTA(9.2mg,0.033mmol)，单体OEGMA(2.05g，4.1mmol)，MA-Ala-NHNHBoc(243.9mg，0.9mmol)按比例加入小口圆底瓶内，抽换氩气。冰浴下，将溶有引发剂VA044(3.5mg，0.013mmol)的溶剂(H₂O/CH₃OH＝1:4，10.4mL)用注射器加入圆底瓶中，继续通氩气鼓泡半小时。然后将圆底瓶转移至45℃条件下避光反应17小时。淬灭反应后，将反应液置于透析袋(MWCO 3500)中透析1天以除去多余溶剂及未反应完全的小分子，粗产物经FPLC过柱纯化，收集含产物部分的流动相，以去离子水为介质，将收集流动相置于透析袋(MWCO3500)中透析1.5天，冷冻干燥即得pPEG-NHNHBoc(Mw＝32kDa,PDI＝1.10)。

2、pOEGMA-NHNH₂的制备

将pOEGMA-NHNHBoc(800mg)加入50mL圆底瓶中，冰浴搅拌下，加入10mL二氯甲烷，再缓慢加入10mL TFA。室温反应10h后，减压悬蒸除去溶剂，将剩余物用去离子水溶解，置于透析袋(MWCO 3500)中透析1.5天，冷冻干燥即得脱掉Boc基团的pOEGMA-NHNH₂。

3、pOEGMA-DOX的制备

将上述产物pOEGMA-NHNH₂(600mg)溶于pH 5.7的醋酸铵缓冲溶液(20mL,0.1M)中，冰浴下，加入盐酸阿霉素(DOX·HCl，400mg)，避光反应两天。以去离子水为介质，将反应液置于透析袋(MWCO 2000)中透析至去离子水变为无色，收集产物，冷冻干燥即得pOEGMA-DOX。利用紫外分光光度计检测阿霉素含量，测得所得聚合物药物偶联物载药量为5.7％。

试验例1、化学结构及分子量确认

1)实验材料

实施例1制备的pHPMA-NHNH₂和pHPMA-DOX；实施例2制备的pOEGMA-NHNH₂和pOEGMA-DOX。

2)实验方法与结果

通过¹H NMR谱图分析不含药物的共聚物(pHPMA-NHNH₂和pOEGMA-NHNH₂)以及聚合物药物偶联物(pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX)的化学结构。如图2所示，与不含药物的共聚物的¹H NMR谱相比较，聚合物药物偶联物在7.4，7.2，6.8和5.5ppm等位置观察到DOX的信号，表明DOX成功偶联到了聚合物载体上。

使用

/FPLC***(GE Healthcare)的尺寸排阻色谱(SEC)来测量聚合物的平均分子量和多分散指数(PDI)。选择乙酸钠缓冲液(H ₂O:ACN＝70:30，v、v，pH＝6.5)作为流动相。使用GE Healthcare Superose 6HR10/30色谱柱，流速为0.4mL/min。结果表明，制得的两种聚合物药物偶联物(pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX)具有相似的分子量和窄的分子量分布(表1)。

表1：合成的pOEGMA-DOX缀合物和pHPMA-DOX缀合物的表征。

试验例2、粒径分布、zeta电位、形貌及稳定性的评价

1)实验材料

实施例1和2制备的聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX。

2)实验方法与结果

通过动态光散射(DLS)表征聚合物的尺寸和zeta电位。分别将pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX溶于去离子水(浓度均为0.5mg·mL^-1)中，，使用Zetasizer Nano ZS(MalvernInstruments，Worcestershire，UK)仪器，通过动态光散射测定共聚物的尺寸分布和ζ电位，并使用DTS软件版本3.32来处理测定结果。从如图3A和D可知，pOEGMA-DOX缀合物具有大约9.8nm的平均尺寸，而pHPMA-DOX缀合物具有相似的尺寸(约为10.3nm)；从图3B和E可知，pHPMA-DOX和pOEGMA-DOX缀合物均具有轻微负电荷表面(-0.32mV和-2.29mV)，这可以使其在血液循环中与血清蛋白的相互作用最小化，从而延长血液半衰期并增加肿瘤部位的积聚。

通过与上述相同的方法测量37℃下pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX在PBS(pH 7.4)，含有10％胎牛血清(FBS)的PBS和以及细胞培养基中的粒径大小和PDI随时间的变化，由于FBS的尺寸非常接近两种聚合物纳米颗粒的尺寸，因此在含有10％FBS的PBS(图4E，F，G)中很难获得有用的信息。然而，在PBS组和细胞培养基组中，两种聚合物在48小时内显示出良好的稳定性(图4A，B，C，D)。这些结果表明两种缀合物在生理条件下都具有适当的纳米尺度和良好的稳定性，并且有可能通过EPR效应在肿瘤部位有效积聚。

利用透射电子显微镜(TEM)进一步观察两种聚合物药物偶联物的形貌。从图3C和F看出，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX在干燥状态下具有相似的形态和相对均匀的分布，与DLS结果一致。

试验例3、DOX的释放能力评价

1)实验材料

实施例1和2制备的聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX。

2)实验方法与结果

将3mg聚合物偶联物(pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX)一式三份分别溶于1mL PBS(0.1M，pH 7.4或5.4)中，然后将溶液置于透析袋(MWCO 3500Da)内，浸入30mL PBS(0.1M，pH 7.4或5.4)中，在37℃恒温振荡(200rpm)下孵育60小时。在特定的时间点，取出1.2mL溶液并分析。同时，加入等量的具有相同pH值的新鲜培养基。通过紫外可见分光光度法分析不同时间点取出的样品中DOX的浓度。

从图5看出，聚合物药物偶联物pHPMA-DOX的药物释放曲线有明显的pH值依赖特性。在生理条件下(pH 7.4)，60小时后，聚合物药物偶联物pHPMA-DOX和pOEGMA-DOX中阿霉素的释放量均小于17％，意味着这两种聚合物药物偶联物在体内血液循环***中稳定性相对较好。相比较下，当pH值减小为5.4时，类似肿瘤细胞中溶酶体中的酸环境，阿霉素的释放迅速增加，特别是聚合物药物偶联物pHPMA-DOX，在孵育24小时后，阿霉素的释放率超过80％，而pOEGMA-DOX的阿霉素释放率在40％左右。

这些结果表明聚合物药物偶联物pHPMA-DOX含有pH响应链接键，到达肿瘤细胞后，能快速释放通过腙键链接的药物。应该注意的是，和聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX比较,聚合物药物偶联物pHPMA-DOX有更快的阿霉素释放率和更多的阿霉素释放量，可能是具有不同的聚合物载体结构的原因。尽管这两种聚合物药物偶联物有相同的主链和相似的分子量，但它们的侧链使完全不同的。pOEGMA-DOX含有的OEG侧链比HPMA的侧链长度更长，这导致了更复杂的重叠整合，其结构可能更加紧凑。因此，由于不同的空间结构，特别是高度柔性的寡聚乙二醇的缠绕和包裹，聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX中的阿霉素比聚合物药物偶联物pHPMA-DOX的阿霉素有更高的空间位阻。这就解释了聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX比聚合物药物偶联物pHPMA-DOX有相对差的阿霉素释放率。试验例4、细胞摄取性能评价

1)实验材料

实施例1和2制备的聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX。

2)实验方法与结果

将4T1细胞悬液(1×104cells/mL)接种于35×12mm的玻底皿中，孵育24小时后分别加入含有pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX(配制浓度相当于阿霉素浓度为5μg.mL^-1)的RPMI 1640培养基。继续在培养箱中孵育。细胞在培养箱中分别孵育2，4，6小时后。去除培养基，细胞用PBS(pH 7.4)清洗三次，之后用1％多聚甲醛固定。拍照前十分钟用4，6-二脒基-2-苯基吲4'，6-diamidino-2-pHenylindole(DIPA，blue)染料染色。用PBS清洗3次后采用激光共聚焦(CLSM)观察拍照。

从图6A1-C2看出，随着孵育时间的延长，两种缀合物的细胞内荧光强度逐渐增加，表现出时间依赖性的内化和细胞摄取。值得注意的是，在相同的温育时间下，pOEGMA-DOX缀合物具有比pHPMA-DOX更弱的荧光强度，表明pOEGMA-DOX具有较慢的细胞摄取速率。流式细胞仪分析进一步证实了结果：定量研究(图7A)显示pHPMA-DOX在任何选定的时间点都比pOEGMA-DOX更大程度地被细胞吸收。具体而言，pPHPMA-DOX在6小时时比pOEGMA-DOX的摄取高约2倍。此外，如图7B所示，将游离DOX与4T1细胞孵育0.5小时后观察到高荧光强度，这表明由于被动扩散，细胞可以快速吸收小分子DOX。

试验例5、体外细胞毒性评价

1)实验材料

实施例1和2制备的聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX。

2)实验方法与结果

4T1细胞在96孔板中孵育(细胞浓度为5×103cells/well)，用RPMI 1640培养基孵育24小时后，除去培养基，分别加入含有各种浓度(浓度相当于阿霉素浓度0.1～90μg.mL-1)的游离药阿霉素，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX培养基。再次孵育48小时后，去除培养基，用PBS(pH7.4)清洗三次。加入100μL新配置的含有10％的CCK-8(1v/v)培养基避光孵育3小时后，用酶标仪检测每个样品的吸光度，并按说明书计算细胞生存率。

如图8A所示，结果显示两种不含药物的共聚物在不同浓度(50～800μg/mL)对4T1细胞(存活率在90％以上)均没有明显的细胞毒性，这表明聚合物载体具有良好的生物相容性。与之对照，如图8B所示，当用DOX，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX培养4T1细胞48小时时，观察到细胞存活率随着浓度增大显著降低。pHPMA-DOX的IC₅₀值为0.90μg/mL，低于pOEGMA-DOX(2.86μg/mL)。由于小分子DOX能够通过被动扩散透过细胞膜，因此游离的DOX表现出最低的IC₅₀值(0.18μg/mL)。这可能是因为偶联物产生的细胞毒性需要一系列过程，如内吞和刺激响应性的药物释放。

试验例6、体外细胞凋亡分析

1)实验材料

实施例1和2制备的聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX。

2)实验方法与结果

盐酸阿霉素、pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX的细胞凋亡情况用流式细胞仪通过FACSCalibur flow cytometer测定。4T1细胞在6孔板孵育24小时(细胞浓度为1.5×105cells/well)后，清除培养基，分别加入含有浓度相当于阿霉素浓度(0.3μg/mL)的游离药阿霉素、pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX培养基。孵育24小时后清除培养基，PBS(pH7.4)清洗三次后用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，用Annexin V-FITC凋亡测试盒按说明书处理后经细胞流式仪检测，结果通过WinMDI 2.9软件处理。

如图9所示，定量测定显示，DOX，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX分别诱导相似的4T1细胞的凋亡和坏死，其值分别为59.9％，54.2％和60.6％，这与细胞毒性测定吻合。同时，这些结果也表明，药物在从缀合物释放后可以在肿瘤细胞中快速起作用。尽管两种DOX偶联物都呈现浓度依赖性的细胞毒性，但我们注意到，pHPMA-DOX的IC₅₀比pOEGMA-DOX低3.2倍。与pPEGEG-DOX处理的细胞相比，用pHPMA-DOX处理的细胞的细胞毒性较低可能是由于细胞摄取较慢和药物释放速率较慢所致。具体而言，如先前所观察到的，pOEGMA-DOX的侧链是短聚(低聚(乙二醇)(pOEG)链，其比HPMA基聚合物更柔韧，因此，基于OEGMA的聚合物缀合物更容易形成完整的纳米结构，聚氧乙烯侧链的高密度可以屏蔽DOX的正电荷，形成高度的空间位阻，明显抑制高分子载体与细胞间的相互作用，从而导致细胞内化程度降低。此外，高度的空间位阻可能进一步影响DOX的pH响应释放，当偶联物被细胞内化时，这一结果已被以前的体外药物释放研究所证实，所有上述问题最终导致两种药物缀合物。具有不同的细胞毒性。

试验例7、药代动力学评价

1)实验材料

实施例1和2制备的聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX。

2)实验方法与结果

将正常雌性BALB/c小鼠(20-22g)随机分成三组(n＝40，每个时间点5只小鼠)。通过尾静脉分别注射DOX，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX(DOX相当剂量：4mg/kg小鼠)。在预定的时间点，从每只小鼠中取出200μL血样并收集在肝素化管中，随后将其储存于-20℃。接下来，将血液样品在室温下解冻，并加入1mL乙腈与水的混合溶液(ACN/H₂O＝4:1，v/v)，涡旋5分钟后并置于4℃下过夜。然后，取出血液样品涡旋1分钟后以14,000rpm的转速离心5分钟。之后，收集200μL上清液并加入到黑色的96孔板中。使用VarioskanFlash(ThermoScientific，MA，USA)测量荧光强度(Ex/Em：485/590nm)。使用SkanIt软件2.4.3通过非房室模型分析血液药代动力学参数，如T1/2，AUC，MRT和CL等。

如图10所示，注射后1小时内，DOX组的血液水平迅速下降至非常低的水平，这与以前公布的报道中游离DOX可以快速分布到器官中的情况相一致。与DOX相比，观察到两种聚合物缀合物的血液停留时间延长。值得注意的是，pOEGMA-DOX的血液停留时间显着高于pHPMA-DOX，这可能是由于pOEGMA-DOX结构中富含的寡(乙二醇)短链可减少其吸附从而延长其血液循环时间。采用非隔室分析法计算药代动力学参数，结果汇总于表2。pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX的平均半衰期(t_1/2)分别为20.05h和9.56h，高于DOX组(3.88h)。pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX(血药浓度时间曲线下面积(AUC0-∞，185.35μg/mL·h和30.95μg/mL·h)分别为DOX的32倍和5倍(6.14μg/mL·h)。与DOX相比，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX的平均清除率(CL)显着降低(分别为4.45L/h/kg和26.65L/h/kg相对于DOX组的134.28L/h/kg，p<0.05)，而pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX的平均停留时间(MRT，28.68h和12.05h)显着长于DOX(4.65h)。这些结果表明，与游离DOX相比，两种聚合物-药物缀合物都可以延长DOX在血液循环中的停留时间，并且可以通过EPR效应在肿瘤部位具有更好的累积。此外，与pHPMA-DOX相比，pOEGMA-DOX可以增加半衰期(t1/2)，AUC0-∞和MRT，这可能主要归因于它们不同的聚合物载体结构。先前报道，基于HPMA的聚合物药物递送***的血管内半衰期取决于聚合物载体的分子量，因为较高的分子量可以延长体内血液循环时间。对于pHPMA-DOX，为了寻求靶向性与代谢之间的平衡，我们选择分子量相对较低的HPMA共聚物作为载体，在一定程度上降低了体内血液循环时间。相反，尽管pOEGMA-DOX与pHPMA-DOX具有相似的分子量，但是聚氧乙烯侧链的高密度可以有效地防止纳米颗粒被快速从体内清楚。这可能是由于PEG的固有特性降低了巨噬细胞和网状内皮***对材料的识别。此外，侧链越柔软，DOX蒽环之间越可能通过π-π相互作用自组装形成更紧密的纳米结构，从而增强pOEGMA-DOX在体内循环中的稳定性。因此，当聚合物载体具有相似的较低分子量时，基于pOEGMA的聚合物载体比HPMA基聚合物载体能更有效地改善聚合物药物缀合物的血浆稳定性。

表2.通过非隔室模型拟合数据得到的的Balb/c雌性小鼠静脉内施用pHPMA-DOX和pOEGMA-DOX以及游离DOX(4mg/kg DOX)后的药代动力学参数(n＝5)。

试验例8、离体成像评价

1)实验材料

实施例1和2制备的聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX。

2)实验方法与结果

将4T1细胞悬浮于70μLPBS(1.4×10⁵个细胞)中并通过皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右后腿部位。肿瘤体积计算如下：V＝L×W²×0.5，其中L指的是最长的直径，W指的是最短的直径。当肿瘤达到约100mm³时，将小鼠随机分成4组＝5)，并将每组通过尾静脉注射游离DOX，pOEGMA-DOX或pHPMA-DOX(相当于5mg DOX/kg小鼠)。在给药6h，12h，24h，36h后对各组小鼠实施安乐死。然后分别分离心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和肿瘤，在Maestro In-Vivo成像***上进行体外荧光成像。用生理盐水处理的小鼠作为对照组。

如图11所示，用DOX处理的小鼠的肿瘤和主要器官在整个实验期间具有非常弱的荧光强度，表明游离DOX可以从体内快速排出体外。相反，注射pOEGMA-DOX或pHPMA-DOX 6小时后，观察到在主要器官和肿瘤中广泛分布的荧光。随着时间的延长，在肿瘤组织中观察到较强的pOEGMA-DOX或pHPMA-DOX信号，表明通过EPR效应逐渐累积在肿瘤组织中。定量分析结果进一步明确了药物在体内的分布。如图11所示，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX在肿瘤组织中的平均信号比DOX高得多，并且在24小时达到最大值，这表明这些药物在肿瘤部位长时间保持高浓度，导致更好的抗肿瘤效果。

值得注意的是，尽管pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX的荧光强度在24小时内逐渐增加，但pOEGMA-DOX的平均信号高于pHPMA-DOX。可能的主要原因之一是它们的聚合物载体的结构是不同的。与基于HPMA的缀合物相比，由于OEG侧链的灵活性，基于OEGMA的缀合物具有更完整的空间结构。此外，缀合物上的共价结合的DOX由于PEG的保护作用可以减少网状内皮***(RES)的摄取，导致血液循环时间延长。这些观察结果与药代动力学研究的结果非常吻合。所有上述因素最终都改善了pOEGMA-DOX在肿瘤部位的积聚。

试验例9、体内抗肿瘤效果评价

1)实验材料

实施例1和2制备的聚合物药物偶联物pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX。

2)实验方法与结果

如上所述建立4T1肿瘤模型。当雌性BALB/c小鼠的肿瘤达到大约60-80mm³时，将小鼠分成7组(n＝7)，分别为：(1)生理盐水组，(2)游离DOX组(4mg DOX/kg小鼠)，(3)游离DOX(8mg DOX/kg小鼠)，(4)pOEGMA-DOX(4mg DOX/kg小鼠)，(5)pOEGMA-DOX(8mg DOX/kg小鼠)，(6)pHPMA-DOX(4mg DOX/kg小鼠)和(7)pHPMA-DOX(8mg DOX/kg小鼠)。每4天用上述制剂通过尾静脉注射治疗小鼠，一共给药4次。同时，每2天记录每只小鼠的体重和肿瘤体积。在第21天，对所有的小鼠实施安乐死，分别剖离出心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和肿瘤。对每组的肿瘤称重，并使用公式计算抑瘤率(TGI)：TGI＝(1-W₁/W₂)×100％，其中W₁和W₂表示治疗组和对照组的平均肿瘤重量。

如每组的肿瘤生长曲线(图12A)所示，与用生理盐水处理的小鼠中肿瘤的快速生长相比，所有药物制剂在抑制肿瘤生长方面显示出不同程度的功效。随着DOX剂量的增加，pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX都表现出更好的肿瘤治疗效率。其中，pOEGMA-DOX8mg/kg DOX组的小鼠显示出最高的抗肿瘤效力，而pHPMA-DOX组中8mg DOX/kg的小鼠与pOEGMA-DOX 4mgDOX/kg组中的小鼠显示出类似的肿瘤生长的抑制。结合荧光成像研究的结果，pOEGMA-DOX的较好的抗肿瘤效果可能是由于其在肿瘤部位的较高积累。可以注意到，DOX(4mg/kg小鼠)表现出轻微的抗肿瘤效力，可能是因为低剂量的DOX迅速从体内排出，因此在肿瘤部位没有达到足够的浓度。然而，对于游离的DOX，虽然将DOX的剂量增加至8mg/kg时，抗肿瘤活性显着改善，但是小鼠在注射后13天显示出持续的体重减轻(>20％)(图11B)，一些小鼠在第15天后开始死亡，表明高剂量的DOX具有严重的全身毒性。在我们以前的研究中，当游离DOX的剂量为4mg DOX/kg的小鼠，具有明显的心脏毒性。相比之下，对于pOEGMA-DOX或pHPMA-Dox结合物，在治疗的小鼠zhong没有检测到显著的重量降低，表明两种聚合物药物递送***具有良好的生物相容性。

在给药后的第21天，处死所有小鼠，切除各组小鼠的心，肝，脾，肺，肾，肿瘤等主要脏器。称重肿瘤以计算肿瘤生长抑制(TGI)。如图12D所示，在pOEGMA-DOX(8mgDOX/kg小鼠)，pOEGMA-DOX(4mgDOX/kg小鼠)，pHPMA(8mgDOX/kg小鼠)，pHPMA-DOX(相当于4mgDOX/kg小鼠)和DOX(4mgDOX/kg小鼠)组中，TGI分别为80％，62％，60％，44％和22％。这些结果与肿瘤生长曲线一致。其中，用pOEGMA-DOX(8mg/kg)处理的小鼠表现出高得多的抗肿瘤活性。当剂量为4mg DOX/kg小鼠时，用pHPMA-DOX和pOEGMA-DOX处理的小鼠的TGI分别是DOX处理组的2倍和2.7倍。这些数据进一步表明，与游离DOX相比，基于HPMA或OEGMA的聚合物缀合物可以有效地提高抗肿瘤效率并减少副作用。

值得注意的是，尽管在体外结果中，pHPMA-DOX显示出比pOEGMA-DOX更好的药物释放和更快的细胞摄取，但是pOEGMA-DOX在体内研究中观察到较高的抗癌功效。这可以通过以下事实来解释，即与pHPMA-DOX相比，pOEGMA-DOX具有更好的药代动力学行为，能够通过EPR效应在肿瘤部位的积累更多的药物。

综上，本发明通过RAFT聚合合成了基于HPMA和OEGMA的两种聚合物-DOX偶联物，以研究聚合物的侧链对于癌症治疗中药物递送性质的影响。DOX通过pH敏感的腙键与聚合物骨架结合。柔性亲水性聚合物主链为疏水性药物提供了一个稳定内部环境，pH敏感的连接子可以实现药物在血液循环中的细胞外稳定性和肿瘤细胞内的特异性释放。体外抗癌评估表明共聚物-DOX缀合物与游离DOX相比具有与4T1细胞相似的细胞毒性，而在体内抗癌研究表明两者pOEGMA-DOX和pHPMA-DOX加强了DOX的抗肿瘤功效并且无明显的副作用的。值得注意的是，尽管pHPMA-DOX具有比pOEGMA-DOX更好的药物释放特性和更有效的细胞摄取，但是pOEGMA-DOX具有更长的血液循环时间并且可以在肿瘤部位获得更大的药物积累，这最终导致更好的抗肿瘤作用(TGI为80％比60％)。这些结果可能为基于HPMA和OEGMA的聚合物药物递送***的研究提供参考。

Claims (13)

1.一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：所述偶联物是由式（I）所示聚合物脱保护后，与盐酸阿霉素反应得到的聚合物-抗肿瘤药物偶联物，结构如下：

；

式（Ⅰ）所示聚合物的结构如下：

（Ⅰ）

其中，R为

，

；

x为43~265；y为1~8；

式（Ⅰ）所示聚合物的重均分子量为28~35kDa。

2.根据权利要求1所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物单位重量的载药量为3~12%。

3.根据权利要求2所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物单位重量的载药量为4.5~6%。

4.根据权利要求1所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：式（Ⅰ）所示聚合物的制备方法包括以下步骤：

取单体（a）、MA-Ala-NHNHBoc、链转移剂和引发剂，在有机溶剂存在的条件下，于45±3℃反应，即得式 （I）所示化合物。

5.根据权利要求4所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：单体（a）为N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺或聚（乙二醇）甲醚甲基丙烯酸酯。

6.根据权利要求5所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：单体（a）为N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺时，单体（a）、MA-Ala-NHNHBoc、链转移剂及引发剂的摩尔比为1225：65：3~4：1。

7.根据权利要求5所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：单体（a）聚（乙二醇）甲醚甲基丙烯酸酯时，单体（a）、MA-Ala-NHNHBoc、链转移剂及引发剂的摩尔比为315~316：69~70：2~3：1。

8.根据权利要求4-7任一项所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇水溶液；链转移剂为4-氰基戊酸二硫代苯甲酸；引发剂为2,2' -[偶氮双（1-甲基亚乙基）]双[4,5-二氢-1H-咪唑]二盐酸盐。

9.根据权利要求8所述的聚合物-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于：所述甲醇水溶液中，甲醇为80%v/v。

10.一种制备权利要求1~9任一项所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物的方法，其特征在于：包括以下步骤：取式（I）所示聚合物脱保护后，与盐酸阿霉素反应，即得聚合物-抗肿瘤药物偶联物。

11.权利要求1~9任一项所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述肿瘤包括恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、***癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌。

13.一种药物组合物，其特征在于：它是以权利要求1~9任一项所述聚合物-抗肿瘤药物偶联物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助成分制备成药学上常用的制剂。

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