CN109752558A - 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于诊断糖尿病肾病早期阶段的生物标志物，以及诊断糖尿病肾病早期阶段的方法。所述生物标志物为尿液细胞外囊泡(urine extracellularvesicles,尿EVs)内含的CALB1，其在糖尿病肾病早期阶段表达量相对于正常人显著升高。本发明的诊断方法是非侵入式的，有着巨大应用前景。

Description

用于诊断糖尿病肾病早期阶段的生物标志物
技术领域
本发明涉及蛋白检测领域，具体涉及糖尿病肾病早期阶段的生物标志物的检测。
糖尿病已成为全球公共卫生问题。2015年，国际糖尿病联盟(InternationalDiabetes Federation,IDF)宣布，中国有1.096亿糖尿病患者，多数为2型糖尿病，在其血糖达到糖尿病诊断标准之前先出现空腹血糖受损和/或糖耐量异常，称之为糖尿病前期(又被称为前糖尿病)。这些患者尽管没有明显的血糖升高，但是已经开始出现器官损害，因此对其早期诊断有极其重要的意义，能更有效地防止糖尿病并发症的发生。糖尿病肾病和肾衰竭是糖尿病常见的并发症，目前确诊糖尿病肾病依靠肾脏活检穿刺，但这是一种有风险的有创性检查。微量白蛋白尿可以诊断糖尿病肾病第3期，但当糖尿病肾病还处在第1,2期时，尿中还未出现微量白蛋白，这时如何诊断早期糖尿病肾病目前依然是国际上本领域研究的重点和难点。目前国内外还没有公认的能在微量白蛋白尿出现之前早期诊断糖尿病肾病的尿液生物标志物。
尿液细胞外囊泡(extracellularvesicles,EVs)源自整个泌尿生殖道的多种细胞，释放到尿液中，并且可以作为肾功能障碍和结构损伤的生物标志物。
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的主要并发症，显著增加心血管风险和相关死亡率。尿液细胞外囊泡(EVs)被认为不仅仅是肾损害标志物的丰富的非侵入性来源，也是全身器官或者是血管损伤的重要标志物来源。本发明作者试图验证尿EVs中的某些蛋白可能与糖尿病肾病存在关联。
生理状态下尿液中存在大量高丰度蛋白，例如Tamm-Horsfall蛋白，而能够反映疾病早期信息的尿液中的蛋白常常是低丰度的，由于受到其他高丰度蛋白的影响，很难被特异敏感地检测出来。有意义的是，这些反映疾病早期信息的尿液蛋白质很多存在于尿液的EVs中，如果我们能够找到科学有效的富集尿 EVs的方法，然后检测尿EVs中的能够反映疾病早期信息的蛋白质，就能克服尿液中高丰度蛋白的影响。在本发明研究中，我们试图在尿液EVs中寻找并验证一种重要的生物标志物，最终可以对其进行评估或监测，以达到DN早期诊断的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液EVs内含蛋白，用于在尿液出现微量白蛋白之前早期诊断糖尿病肾病早期阶段。
我们假设在患有糖尿病肾病(DN)的患者的尿液EVs中可以发现不同的蛋白质，特别是在微量白蛋白尿出现之前。本项研究中，用于DN患者尿EVs研究的大量尿液样本是在本课题组在南方社区人群开展ISN“KHDC”项目支持的社区分子流行病学研究中获得的。在本研究中，采用双向电泳技术分离来自患有DN 和健康受试者的患者的尿液EVs，并且通过MALDI TOF/MS分析对其蛋白质组分进行分析和定量比较。
通过电泳技术分离出患者尿液EVs中1980个蛋白斑点，其中40个蛋白斑点与NC组相比有至少1.5倍的显著性差异。对上述40个蛋白斑点进行质谱鉴定，发现其中22种蛋白质可能与糖尿病肾病密切相关。
对上述差异蛋白质进行文献检索，充分检索尿液CALB1(Calb1 calbindin 1，NCBI登录号P05937，分子量30291.1，等电点4.7)的文献，占肾脏病绝大数的肾小球疾病(包括肾小球肾炎，糖尿病肾病)没有发现关于尿液CALB1的报道。与尿液CALB1相关的文献，主要集中在特发性高钙尿症。以上检索结果说明，在包括我们研究的糖尿病肾病在内的，占肾脏病绝大多数的肾小球疾病中，全世界没有有关尿液CALB1的报道。
CALB1是一种维生素D依赖性钙结合蛋白(CaBP)，定位于远曲小管和肾小管。LeeCT,Lien YH,Lai LW,Chen JB,et al..Increased renal calcium and magnesiumtransporter abundance in streptozotocin-induced diabetes mellitus.KIDNEY INT2006；69:1786-1791.报导了链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠的研究，显示肾皮质和髓质中CALB1的信使RNA增加。CALB1如何介导钙代谢的机制尚不清楚。胰岛素给药可有效纠正高血糖相关的高钙尿症，并逆转STZ诱导的糖尿病大鼠钙转运蛋白丰度的增加。因此，CALB1的增加可能是抵消DN肾中高钙负荷的补偿机制。我们的研究首次报道了糖尿病和糖尿病肾病患者中尿EVS内含CALB1表达的增加。
有益效果：本发明提供了一种尿液细胞外囊泡内含标志物CALB1，可用于非入侵式的诊断早期糖尿病肾病。
说明书附图
图1五组试验对象尿EVS内含MASP2的表达量变化
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步解释本发明，但不限定本发明权利要求范围，本发明所用试剂如无特别说明皆为市售。
实施例1.尿EVS的透射电子显微镜(TEM)和纳米粒子轨迹分析(NTA)
将参与者分为5组：健康对照组(NC,n＝15)，前糖尿病组(PreDM,n＝15)，蛋白尿水平正常的糖尿病组(DM，n＝15)，微量白蛋白尿糖尿病组(DM-micro,n＝15) 和大量白蛋白尿糖尿病组(DM-macro,n＝15)。第一天早上从所有参与者收集尿液。使用我们先前建立的方法(Musante L,Saraswat M,Ravida A,Byrne B, et al..Recovery of urinarynanovesicles from ultracentrifugation supernatants.Nephrol Dial Transplant2013；28:1425-1433.)，使用流体静力透析方法用于尿液中尿EVS富集。
具体地，收集研究对象的晨尿100ml，无蛋白酶抑制剂，低速离心后，收集上清液，保存于-80℃冰箱。
HETTICH CENTRIFUGE universal 320(UK)离心机，2000g RCF，室温，离心30min，除去T-H蛋白、细胞碎片和其他沉渣。收集上清液。
纳米膜超滤并浓缩样品：采用自制的纳米膜浓缩装置，连接1000kDa纳米膜，SDS清洗，miliQ水清洗，检查无漏液漏气，装置工作完好后，开始处理样品，每次处理八例样品，分若干批次处理所有糖尿病和正常对照者尿液。纳米膜浓缩样品过程中，密切观察装置是否运行完好，如有漏液现象，及时更换新的纳米膜，重新处理样品。我们的纳米膜浓缩装置运行完好，尚无此现象发生。当超滤到 6-8ml时，加入10-20mlmiliQ水，收集滤过液，反复浓缩过滤三次，然后加入 200mlmiliQ纯水，继续浓缩超滤。待尿液浓缩到3-5ml时，收集样品保存待用。
通过透射电子显微镜(TEM)鉴定来自5组的尿液尿EVS。进行纳米粒子轨迹分析，使用配备有sCMOS的NanoSight NS300相机估计尿EVS的数量和大小分布。在Bradford蛋白质测定中使用SDS-PAGE分离5微克尿EVS蛋白质。将凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，与特异性兔抗人抗体TSG101孵育，然后与辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育。最后，用Kodak IS4000R图像站观察样品。
结果表明，尿EVS具有均匀分布，呈现膜封装结构，杯形或圆形，直径为 40-100nm。使用NTA对每个组进行了更全面的尿EVS大小分析。该曲线显示主峰在55和110nm之间。
实施例2.对实施例1得到的尿EVS进行蛋白电泳和质谱鉴定
使用Cy2以等量标记每个样品中的内标蛋白质(TSG101)。分别用cy3和cy5 染料标记来自对照组和患者的蛋白质。使用IPG immobilineTM drystrip(24cm， pH4-7)进行等电聚焦(IEF)，并在IPGphor(GE Healthcare)中进行等电聚焦，在1000V(2小时)梯度下进行；8000V(2小时)；在黑暗中以17W/凝胶进行双向电泳程序(2D-DIGE)5-6小时。用Typhoon9410扫描仪(GE Healthcare) 扫描凝胶。通过Ettan Spot Picker(GE Healthcare)切取在所有这些蛋白质点图中两组(preDM，DM，DM-micro和DM-macro与NC相比)之间一致地改变的差异蛋白质点(|比率|>1.5，p<0.05)，然后在超纯水中进行彻底清洗并进行凝胶内胰蛋白酶消化。蛋白质鉴定通过ABI 4800蛋白质组学分析仪 MALDI-TOF-MS(AppliedBiosystems)进行。使用Global Proteome Server Explorer软件(Applied Biosystems)在Swiss Prot数据库中搜索质谱鉴定用于蛋白质鉴定。
使用ExoCarta数据库(www.exocarta.org)进行比较数据分析。使用基因本体软件(GO)分析这些鉴定的蛋白质的分子功能和生物学过程。通过检索参考文献最终筛选了未发现的作为糖尿病和糖尿病肾病的一些潜在生物标志物。
结果如图1所示，Western blotting显示TSG101存在于5组中，但DM， DM-micro和DM-macro组TSG101强度明显强于NC和PreDM组。也许这可能是由于有和没有肾损伤的糖尿病患者比NC和PreDM患者分泌更多的尿EVS。
而二维DIGE(2D-DIGE)分析表明，在5组中，与NC组相比，1980个蛋白斑点中有近40个蛋白在PreDM，DM，DM-micro和DM-大组之间至少有1.5倍的显着差异，|比率|>1.5，p<0.05。选择上述差异蛋白质点以通过质谱法鉴定。根据我们的分析，选择了22种特定蛋白质进行下一步数据分析，如下表1所示。
表1：差异蛋白质
数据由ExoCarta，Gene Ontology数据库进行分析，以揭示与尿EVS相一致的蛋白质组，尤其是尿液来源并且与糖尿病肾病相关的。根据ExoCarta数据库，先前已在正常尿EVS中报告了所有鉴定的差异蛋白质。如图1所示，发现 CALB1表现出增加的表达，Calb1calbindin 1，NCBI登录号P05937，分子量 30291.1，等电点4.7，进行文献检索，未发现尿EVS内含Calb1与糖尿病/糖尿病肾病的相关性研究。新发现的尿EVS内含Calb1可用于鉴定糖尿病患者的早期肾损伤“前微量白蛋白尿”。

Claims (5)

1.用于诊断糖尿病肾病早期阶段的生物标志物，所述生物标志物为尿EVs内含的CALB1，其NCBI登录号为P05937。
2.尿EVS内含的CALB1在诊断糖尿病肾病早期阶段中的应用，所述CALB1相对于正常人表达量显著升高。
3.根据权利要求2所述的应用，所述CALB1相对于正常人表达量升高30％以上。
4.根据权利要求3所述的应用，所述CALB1相对于正常人表达量升高50％以上。
5.根据权利要求4所述的应用，所述CALB1相对于正常人表达量升高100％以上。
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