CN109752510B

CN109752510B - 一种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物及生物量测算方法

Info

Publication number: CN109752510B
Application number: CN201910202530.7A
Authority: CN
Inventors: 赵杰; 王克林
Original assignee: Institute of Subtropical Agriculture of CAS
Current assignee: Institute of Subtropical Agriculture of CAS
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: CN109752510A

Abstract

本发明公开了一种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物及生物测算方法，其步骤是：1)采集土壤样品提取磷脂脂肪酸；2)气相色谱‑质谱联用仪分析磷脂脂肪酸组成；3)对各磷脂脂肪酸进行归类并找出苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物；4)以此磷脂脂肪酸标记物含量计算苜蓿根瘤菌生物量。方法是经过对苜蓿根瘤菌纯培养菌株的磷脂脂肪酸组成分析，筛选其特异性磷脂脂肪酸并定为其专一性生物标记物，再通过土壤取样分析确证的专一性磷脂脂肪酸生物标记物。本发明是针对苜蓿根瘤菌筛选到的专一性磷脂脂肪酸生物标记物，可以用于测算土壤中苜蓿根瘤菌的生物量。

Description

一种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物及生物量测算方法

技术领域

本发明涉及土壤微生物研究领域，更具体涉及一种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物及生物量测算方法，适用于栽培苜蓿土壤中的苜蓿根瘤菌生物量的测算。

背景技术

磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid,PLFA)是活体微生物细胞结构的重要组成成分,不同种类的微生物的PLFA合成途径和组成状况存在差异，且一旦细胞死亡其PLFA便被快速降解。因此，土壤PLFA的含量和组成状况可以较为准确地指示土壤不同种类的微生物生物量和群落结构状况(Zelles,1999)。PLFA方法具有可以估测土壤微生物生物量、容易将细菌和真菌类群分开、分析费用相对较低等优点。近20年来，土壤PLFA分析成为土壤微生物生物量及群落结构研究领域的重要分析手段(Haack et al.,1994；周丽霞和丁明懋，2007；Wang et al.,2019)。PLFA法常用于区分土壤中细菌和真菌生物量大小，也用于指示革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、原生动物和绿藻等类群(

et al.,1993；Ruess and Chamberlain,2010)。PLFA分析的用途主要有两个：一是分析纯培养的菌株的PLFA组成，通过比较不同类群微生物的PLFA差异用于丰富微生物PLFA数据库，并用于商业PLFA数据库；二是用于分析环境土壤样品或实验室培养样品的PLFA组成，用于比较微生物群落组成的差异及变化等(Zelles,1999)。然而，目前多数研究都集中于PLFA分析的用途二上，PLFA分析方法在纯培养菌株的PLFA分析比较和PLFA数据库开发和扩充上的应用严重不足。因此，有必要对纯培养的各类微生物的PLFA组成进行分析，以提高PLFA在土壤微生物分类鉴定中作用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物筛选和生物量测算方法，方法易行，操作简便，该生物标记物通过对纯培养的苜蓿根瘤菌进行磷脂脂肪酸组成分析和比对后筛选到的，可以用于指示苜蓿根瘤菌并根据该磷脂脂肪酸的量进行苜蓿根瘤菌生物量的估算。该方法是基于PLFA分析提出的，具有对样品采集、储运、保藏要求较低、成本较为低廉、分析快速、结果准确等优点。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

对苜蓿根瘤菌纯培养菌株进行磷脂脂肪酸组成的分析，将获得的磷脂脂肪酸与现有磷脂脂肪酸生物标记物数据库中的磷脂脂肪酸进行对比，共计发现2种未被使用的磷脂脂肪酸生物标记物分别为a17:1ω9和18:1ω5。再进一步对种植苜蓿的土壤进行磷脂脂肪酸组成分析后只检测到18:1ω5这一种磷脂脂肪酸，并且该脂肪酸在种植苜蓿土壤中的含量显著高于未种植苜蓿土壤中的含量。因此，磷脂脂肪酸18:1ω5可以作为苜蓿根瘤菌的生物标记物，并可以用于估算苜蓿根瘤菌的生物量。

一种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物及生物量估算方法，其步骤是：

A、采集栽培苜蓿的土壤样品，提取土壤磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid,PLFA)；

B、气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪(如：安捷伦7890等)分析磷脂脂肪酸组成，利用美国MIDI公司的Sherlock微生物鉴定***(PLFAD2或者RTSBA6)确定各磷脂脂肪酸种类；

C、将磷脂脂肪酸归类为细菌、真菌、放线菌、原生动物、绿藻和根瘤菌等，其中以18:1ω5这一磷脂脂肪酸作为根瘤菌的生物标记物；

D、从Sherlock微生物鉴定***的输出结果中获得各磷脂脂肪酸的Response数据，计算各磷脂脂肪酸的质量，并以18:1ω5的含量作为根瘤菌的生物量。

所述的生物量计算公式B＝(Re_PLFA/Re₁₉)×(C₁₉×A/W)

其中：B为磷脂脂肪酸的生物量(ng/g dry soil)，Re_PLFA为未知磷脂脂肪酸的Response，Re₁₉为19:0(内标磷脂脂肪酸)的Response，C₁₉为19:0溶液的浓度(本方法中为5ng/ul)，A为气质联用仪的进样量(本方法中为200ul)，W为分析用土壤的干重(本方法中为8g)；

E、以栽培和未栽培苜蓿土壤的18:1ω5含量的差值作为苜蓿根瘤菌生物量。

通过上述五个步骤的技术措施可以对苜蓿根瘤菌生物量进行估算(测算)，其中第五步(E)中的磷脂脂肪酸生物标记物18:1ω5是针对苜蓿根瘤菌的专一性标记物，而现有技术中并无针对根瘤菌的磷脂脂肪酸标记物，本方法解决了现有磷脂脂肪酸技术无法对根瘤菌进行定性和定量评价的技术难题。通过本发明，申请人对栽培苜蓿土壤中的各类群微生物的生物量进行了测定，同时测定了苜蓿根瘤菌的生物量，结果显示栽培苜蓿土壤中包含苜蓿根瘤菌0.27ng(每克干土中含量)，其含量高于真菌和原生动物的含量，该方法是在未改变现有磷脂脂肪酸技术的提取和分析过程以及相关成本的情况下，找到的针对苜蓿根瘤菌的生物标记物，可以直接用于分析计算苜蓿根瘤菌生物量，该方法是对现有磷脂脂肪酸技术的补充。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

根据苜蓿根瘤菌纯培养菌株的磷脂脂肪酸组成，经与现有磷脂脂肪酸生物标记物数据库中进行对比，并通过野外土壤样品的验证，筛选到可以指示苜蓿根瘤菌的一种磷脂脂肪酸生物标记物，该标记物是目前唯一的苜蓿根瘤菌磷脂脂肪酸标记物。本发明涉及的利用磷脂脂肪酸方法对苜蓿根瘤菌生物量进行分析的方法与现有常用的DNA图谱技术相比，可以定量化苜蓿根瘤菌生物量，且对土壤样品采集和储存的要求相对较低，分析方法更加简单且成本更加低廉。

使用栽培2年的苜蓿土壤，对比了现有技术方法与本方法在土壤微生物分类和生物量测算上的差异，结果显示现有技术只可以获得土壤中的细菌、真菌、放线菌、原生动物、绿藻的含量，通过本方法以磷脂脂肪酸18:1ω5作为苜蓿根瘤菌的生物标记物，不仅可以获得以上各微生物类群的生物量，还可以获得栽培苜蓿土壤中的苜蓿根瘤菌的含量(图4)，其中两种方法测得的细菌、真菌、放线菌、原生动物、绿藻的含量无差异，土壤中的细菌、真菌、放线菌、原生动物、绿藻和苜蓿根瘤菌的含量分别为6.98、023、3.16、0.11、1.18和0.27ng(每克干土中含量)(图4)。

附图说明

图1为一种苜蓿根瘤菌纯培养菌株的磷脂脂肪酸组成图。

图中共计27种磷脂脂肪酸，y轴为磷脂脂肪酸名称，x轴为磷脂脂肪酸的百分比。

图2为一种苜蓿根瘤菌的潜在生物标记物与苜蓿根瘤菌生物量的关系。

图中共计18种苜蓿根瘤菌磷脂脂肪酸，它们的含量均与苜蓿根瘤菌总磷脂脂肪酸含量(苜蓿根瘤菌生物量)具有显著正相关关系，另外9种苜蓿根瘤菌磷脂脂肪酸的含量与与苜蓿根瘤菌总磷脂脂肪酸含量没有显著正相关关系(图中未标示)。只有当单个磷脂脂肪酸含量与苜蓿根瘤菌总磷脂脂肪酸含量具有相关关系时，才可以作为苜蓿根瘤菌的潜在标记物；若不存在显著正相关关系，则不能反映苜蓿根瘤菌生物量的变化，则不能作为生物标记物。***表示极显著线性相关关系。

图3为一种栽培苜蓿土壤和未栽培苜蓿土壤的磷脂脂肪酸组成对比图。

图中栽培苜蓿土壤是种植紫花苜蓿2年的土壤，未栽培苜蓿土壤(对照)是种植宽叶雀稗2年的土壤，除了种植植物种类不同外，两种土壤的施肥和除草等管理措施均完全一致。*表示磷脂脂肪酸18:1ω5和i18:0在两个土壤间存在显著差异，由于i18:0不在27种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸之列，所以只有18:1ω5可以作为根瘤菌的生物标记物。

图4为一种苜蓿栽培土壤中各类群微生物的生物量图

图中列举了栽培苜蓿土壤的细菌量、真菌量、放线菌量、原生动物量、绿藻量和苜蓿根瘤菌量，其中苜蓿根瘤菌生物量与除真菌生物量外的其他各类群生物量间均有显著差异。图中字母表示各类群微生物生物量间是否存在显著差异，标相同字母的类群间无显著差异。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述：实现本发明的原理的示意图如图1-3所示。

实施例1：

一种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物及生物量测算方法(以苜蓿栽培和非栽培土壤的比较为例)，其步骤是：

1)利用土钻采用随机取样法采集土壤样品500g，挑根和石块后过10目土壤筛，称取相当于8g干土的新鲜土壤，提取磷脂脂肪酸(Bossio and Scow,1998)。

2)气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析PLFA组成，利用美国MIDI公司的Sherlock微生物鉴定***(RTSBA6)确定各磷脂脂肪酸种类；

3)将PLFA归类为细菌、真菌、放线菌、原生动物、绿藻和根瘤菌，其中以i15:0,a15:0,15:0,i16:0,16:1x7,i17:0,a17:0,17:0,cy17:0和cy19:0作为细菌标记物并以它们Response之和计算细菌生物量，以18:2ω6,9作为真菌标记物并以其Response计算真菌生物量，以10Me 16:0,10Me17:0和10Me18:0作为放线菌标记物并以它们Response之和计算放线菌生物量，以20:0and 20:4ω6,9,12,15作为原生动物标记物并以它们Response之和计算原生动物生物量，以18:1ω9作为绿藻标记物并以其Response计算绿藻生物量，以18:1ω5作为根瘤菌标记物并以其Response计算根瘤菌生物量；

D、从Sherlock微生物鉴定***的输出结果中获得各磷脂脂肪酸的Response数据，根据生物量计算公式B＝(Re_PLFA/Re₁₉)×(C₁₉×A/W)计算各磷脂脂肪酸的含量；

其中：B为磷脂脂肪酸的生物量(ng/g dry soil)，Re_PLFA为未知磷脂脂肪酸的Response，Re₁₉为19:0(内标磷脂脂肪酸)的Response，C₁₉为19:0溶液的浓度(本方法中为5ng/ul)，A为气质联用仪的进样量(本方法中为200ul)，W为分析用土壤的干重(本方法中为8g)，确定细菌、真菌、放线菌、原生动物、绿藻和根瘤菌的生物量；

E、以栽培苜蓿土壤中18:1ω5的量与未栽培苜蓿土壤中18:1ω5量的差值作为苜蓿根瘤菌的生物量(图4)，其中18:1ω5是碳链长度为18个碳、含1个双键且双键位于分子末端的第5个碳上的磷脂脂肪酸，分子式为CH₃(CH₂)₃CH＝CH(CH₂)₁₁CO₂CH₃。

该方法可以直接随土壤磷脂脂肪酸组成分析而获得相应数据，不需要再独立进行磷脂脂肪酸的分析，更加方便快捷。

通过上述具体实施过程，可以在现有磷脂脂肪酸技术分析获得细菌、真菌、放线菌、原生动物和绿藻的生物量的同时，再获得苜蓿根瘤菌的定量分析结果；通过现有的磷脂脂肪酸分析技术，获得了栽培苜蓿土壤中的细菌、真菌、放线菌、原生动物、绿藻的含量分别为6.98、023、3.16、0.11和1.18ng(每克干土中含量)(图4)，通过本方法以磷脂脂肪酸18:1ω5作为苜蓿根瘤菌的生物标记物，不仅可以获得以上各微生物类群的生物量，还可以获得栽培苜蓿土壤中的苜蓿根瘤菌的含量为0.27ng(每克干土中含量)(图4)。

Claims

1.一种苜蓿根瘤菌生物量的测算方法，其步骤是：

1)采集栽培苜蓿的土壤样品，提取土壤磷脂脂肪酸；

2)气相色谱-质谱联用仪分析磷脂脂肪酸组成，利用Sherlock微生物鉴定***确定各磷脂脂肪酸种类；

3)以18:1ω5这一磷脂脂肪酸作为苜蓿根瘤菌的生物标记物；

4)提取各磷脂脂肪酸的Response数据，计算各磷脂脂肪酸的摩尔质量，以磷脂脂肪酸18:1ω5的含量计算苜蓿根瘤菌的生物量；

所述的生物量计算公式B＝(Re_PLFA/Re₁₉)×(C₁₉×A/W)；

其中：B为磷脂脂肪酸的生物量，Re_PLFA为未知磷脂脂肪酸的Response，Re₁₉为19:0的Response，C₁₉为19:0溶液的浓度，A为气质联用仪的进样量，W为分析用土壤的干重。