CN109750096A - 抑制agxt基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法，进行生物信息学预测、分析miR‑4660/miR‑6797对基因AGXT 3’UTR的影响，确定靶标位点、利用细胞学水平分析miR‑4660对基因AGXT的表达、miRNAs及基因表达水平的检测:免疫组化检测、RT‑PCR实验检测。本发明从草酸代谢最重要基因AGXT的转录后调控机制入手，首次发现非编码小RNA(microRNA)hsa‑miR‑4660可以通过直接结合AGXT‑3’UTR区域抑制基因的转录和翻译，最终增加草酸结石的发生率。

Description

抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

由于原发性高草酸尿症I型是由AGXT基因的纯合突变导致AGT蛋白功能缺失造成的，因此目前治疗该疾病的主要方法为利用RNA干扰或基因编辑技术靶向干扰乙醇酸氧化酶(GO)的表达。这主要是由于乙醇酸氧化酶(GO)作用于AGT酶的上游，将乙醇酸氧化为乙醛酸，产生GO酶的功能缺失突变会导致尿液中乙醇酸含量升高20倍，并伴随正常的草酸水平和正常的肾脏功能。小鼠实验中GO酶基因缺失伴随AGXT基因突变的共遗传特性完全阻止了PH1的发病。这些人类和小鼠遗传学数据强烈地暗示了通过使HAO1mRNA沉默而敲低的GO酶表达可以阻断破坏性的乙醛酸产生途径并安全地降低了PH1病患的草酸负荷。

肾结石是中国人群的常见病、多发病，中国也是世界三大***高发区之一，有5％-15％的人群一生中会罹患肾结石。虽然近年来微创冲击波碎石和内腔镜技术的广泛使用使该病的治疗效果取得了很大进展，但肾结石的复发率仍然居高不下，复发率一般在5％-10％，如果是感染性结石，结石复发率可能超过50％。结石病反复发作，严重者可最终导致肾功能衰竭，极大影响患者的休息、社交及其它日常生活，增加了患者的经济和心理负担，甚至危及生命。大部分肾结石患者的结石成分是草酸钙结晶(calcium oxalate，CaOx)。因此，草酸钙结石的形成原因及机制一直是肾结石分析的重点内容。

草酸代谢相关酶学功能异常是引起草酸钙结石的重要原因：

Ox主要是由有机酸在肝脏代谢形成，主要由过氧化物酶体丙氨酸乙醛酸转氨酶(AGT1/AGXT,604285)、线粒体内乙醛酸还原酶(GR，260000)或羟基丙酮酸还原酶(HPR，604296)和细胞质内的4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶-1(HOGA-l，613597)催化代谢，这三个蛋白的基因若发生突变，导致酶学功能异常，可造成体内Ox蓄积，临床表现为反复发作的肾结石、肾钙质沉着症伴肾功能损害，被称为原发性高草酸尿症(primary hyperoxaluria，PH)，是一种常染色体隐性遗传病。上述三种酶的突变分别对应PH1、PH2和PH3，其中PH1最多见(80％)，临床危害极大。然而，高草酸尿症存在较高的异质性，基因突变并不能有效地解释所有高草酸尿症患者的病因。因此，本发明推测，除了基因突变之外，还有其他的生物学机制参与高草酸尿症的形成，但关于其他参与高草酸尿症的形成的生物学机制目前尚未见报道。

MicroRNAs可能参与抑制草酸代谢酶的调控：

MiRNAs是基因转录后调控的重要分子，主要是通过直接与靶标基因的下游3’调控区结合(3’UTR)抑制基因的转录和翻译。分析证明，miRNAs在参与发育、肿瘤及遗传性疾病的发生。近年来发现，miRNAs参与包括肾结石在内的多种肾脏***复杂性疾病的调控。HouJ利用miRNA microarray芯片分析技术分析发现，肾结石患者中有多种miRNA表达异常。Gong等分析发现，miR-9和miR-374参与claudin-14蛋白合成调节并导致肾脏内高Ca²⁺，促进了肾脏高钙结石的形成。然而，miRNAs是否参与高草酸尿症的发生，目前尚无分析。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中，miRNAs是否参与高草酸尿症的发生，目前尚无分析；

但关于其他参与高草酸尿症的形成的生物学机制目前尚未见报道。

(2)现有技术如对上游基因乙醇酸氧化酶(GO)的干扰是否会对除降低草酸结石的其他代谢途径造成影响，目前并不明确。

解决上述技术问题的难度：MiRNAs作为一种较广泛的靶向的小分子，一般来说特异性较差。因此，需要找到一种特异性较强的miRNA，能够特异性较高的靶向并作用AGXT基因，这是技术问题的难点。

解决上述技术问题的意义：如果能找到特异性较高的靶向并作用AGXT基因的miRNAs，有望实现AGXT相关疾病的治疗。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法。

本发明是这样实现的，一种MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，所述MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法包括：

第一步，生物信息学预测：利用DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICRAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、TargetScan的miRNAs与靶标基因结合位点预测软件对AGXT-3’UTR的miRNAs靶标序列进行预测，并通过IBIVU server、UCSC检测结合位点保守性，分析miR-4660和miR-6797的结合AGXT 3-’UTR特性；

第二步，分析miR-4660/miR-697对基因AGXT 3’UTR的影响，确定靶标位点：将AGXT-3’UTR亚克隆至pMIR-Report荧光素酶报告基因下游，表达融合AGXT-3’UTR的重组荧光素酶；将报告载体分别与hsa-miR-4660/hsa-miR-6797mimics以及随机miRNA序列共同转染Hela细胞，培养后，分析融合重组荧光素酶报告载体荧光值变化；

第三步，利用细胞学水平分析miR-4660对基因AGXT的表达：进行RT-PCR分析、Western blot分析；

第四步，miRNAs及基因表达水平的检测:进行免疫组化检测、RT-PCR实验检测。

进一步，第二步中，培养48小时后，分析融合重组荧光素酶报告载体荧光值是否有变化；通过连续位点点突变的方法，获取miR-4660/miR-697具体结合的靶标序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

Table 1:The primer information.

进一步，RT-PCR分析的方法包括：

分别将hsa-miR-4660mimics或hsa-miR-4660沉默子antagomir以及随机miRNA序列载体分别转染至L02细胞，转染48小时后，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后，利用设计的AGXT定量引物对cDNA中AGXT的表达水平进行定量测定，检测miRNAs过表达或者干扰miRNAs表达后，AGXT的mRNA水平是否有变化，获得hsa-miR-4660对基因转录水平影响信息。

AGXT定量引物包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。

正向引物：5’-GGCATCCAGTACGTGTTCCA-3’；

反向引物：5’-TGCACTCGGGCTCCTATG-3’。

进一步，Western blot分析方法包括：

分别将hsa-miR-4660mimics或hsa-miR-4660沉默子antagomir以及随机miRNA序列(negative miRNA mimics)载体分别转染至L02细胞，转染48小时后，提取细胞总蛋白，检测miRNAs过表达或者干扰miRNAs表达后，AGXT蛋白水平差异，获得hsa-miR-4660对基因翻译水平影响信息。

进一步，免疫组化实验方法包括：

对需要进行肝脏穿刺活检的肝脏组织，定制AGXT及hsa-miR-4660特异性探针，石蜡包埋组织后切片染色，分析AGXT及hsa-miR-4660表达水平的差异。

进一步，RT-PCR实验方法包括：

提取草酸结石组和正常对照组外周血标本总RNA，利用miR-4660特异性逆转录引物逆转录并检测miR-4660的表达，分析草酸结石组与正常对照组外周血中AGXT及hsa-miR-4660表达水平的差异。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

miR-4660被证实是一种特异性较高的靶向并显著抑制AGXT基因表达的一种非编码RNA，相对于目前治疗该疾病的主要方法，即利用RNA干扰或基因编辑技术靶向干扰乙醇酸氧化酶(GO)的表达的技术来说，乙醇酸氧化酶(GO)的干扰是否会对除降低草酸结石的其他代谢途径造成影响，目前并不明确；而本发明是特异性调控AGXT基因表达，特异性更高，对其他代谢途径可能造成得到影响更少。且本发明是首次报道了可能影响AGXT基因表达的miRNA，填补了国内外相关研究的空白。

本发明从草酸代谢最重要基因AGXT的转录后调控(post-transcriptionregulation)机制入手，首次发现非编码小RNA(microRNA)hsa-miR-4660可以通过直接结合AGXT-3’UTR区域抑制基因的转录和翻译，最终导致草酸结石的发生。本发明提供的影响草酸结石的新的分子机制，为该疾病的早期诊断和靶向治疗提供依据。

附图说明

图1是本发明实施例提供的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法流程图。

图2是本发明实施例提供的人血清和肝脏组织中，miR-4660表达与AGXT的表达显著负相关图。

图3是本发明实施例提供的mRNA和蛋白表达水平证明miR-4660可以特异性显著抑制AGXT基因的转录和表达图。

图4是本发明实施例提供的双荧光素酶报告基因实验证明miR-4660可以特异性结合AGXT基因图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术中，miRNAs是否参与高草酸尿症的发生，目前尚无分析；但关于其他参与高草酸尿症的形成的生物学机制目前尚未见报道。

为解决上述技术问题，下面结合具体分析对本发明作详细描述。

对于miRNAs是否参与草酸代谢的相关酶基因转录调节尚未见明确报道。因此，本发明选择草酸代谢最重要基因AGXT基因为主要分析内容。本发明对AGXT进行了miRNAs结合位点的生物学预测和包括双荧光素酶实验，初步确定miR-4660可以直接结合AGXT-3’UTR影响荧光素酶的表达，在此基础上，本发明拟通过如下实验进一步阐明miR-4660对AGXT调控的分子机制：

正常人肝脏细胞系L02可以特异性表达AGXT，利用L02进行分析，可以减少外源转染相关基因导致的实验误差。因此本发明选择L02细胞系，通过高表达或沉默miR-4660，观察AGXT的mRNA转录和蛋白反应情况，确认miR-4660是否对AGXT的转录和翻译水平具有抑制作用。

本发明通过对AGXT-3’UTR的种属间同源性进行比对，发现人源AGXT-3’UTR与大鼠及小鼠agxt-3’UTR的同源性较低，收集人外周血液标本还肝脏组织穿刺标本，验证人体内miR-4660对AGXT的影响。

本发明旨在从体外细胞水平和体内水平共同探索miR-4660参与草酸代谢紊乱引起的肾结石/肾衰竭的分子机制，确认miRNAs作为一种新型标志物在草酸结石早期诊断和预警中的临床意义，也为今后以miRNAs为靶点设计药物对草酸代谢紊乱引起肾结石/肾衰竭的靶向治疗提供依据。

下面结合具体方案对本发明作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例提供的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法包括：

1)生物信息学预测：

生物信息学预测miRNAs结合位点，本分析首先利用DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICRAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、TargetScan等miRNAs与靶标基因结合位点预测软件对AGXT-3’UTR的miRNAs靶标序列进行预测，并通过IBIVU server、UCSC检测结合位点保守性，确认了包括miR-4660和miR-6797这2个miRNAs可能结合AGXT 3-’UTR。

2)分析miR-4660/miR-697对基因AGXT 3’UTR的影响，确定靶标位点：

将AGXT-3’UTR亚克隆至pMIR-Report荧光素酶报告基因下游，使之能够表达融合AGXT-3’UTR的重组荧光素酶；将报告载体分别与hsa-miR-4660/hsa-miR-6797 mimics以及随机miRNA序列(negative miRNA mimics)共同转染Hela细胞，培养48小时后，观察融合重组荧光素酶报告载体荧光值是否有显著变化，进一步通过连续位点点突变的方法，进一步明确miR-4660/miR-697具体结合的靶标序列。通过荧光素酶报告基因实验，本发明最终确定miR-4660可以直接结合AGXT-3’UTR影响荧光素酶的表达。

miR-4660/miR-697具体结合的靶标序列为：

Table 1:The primer information.

3)细胞学水平分析miR-4660对基因AGXT表达的影响：

a)RT-PCR分析：正常人肝脏细胞系L02可以特异性表达AGXT，利用L02进行分析，可以减少外源转染相关基因导致的实验误差。因此，分别将hsa-miR-4660mimics或hsa-miR-4660沉默子antagomir以及随机miRNA序列(negative miRNA mimics)载体分别转染至L02细胞，转染48小时后，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后，利用设计的AGXT定量引物对cDNA中AGXT的表达水平进行定量测定，检测miRNAs过表达或者干扰miRNAs表达后，AGXT的mRNA水平是否有显著变化，明确hsa-miR-4660对基因转录水平的影响。

AGXT定量引物包括：

正向引物：5’-GGCATCCAGTACGTGTTCCA-3’SEQ ID NO：2。

反向引物：5’-TGCACTCGGGCTCCTATG-3’SEQ ID NO：3。

b)Western blot分析：分别将hsa-miR-4660mimics或hsa-miR-4660沉默子antagomir以及随机miRNA序列(negative miRNA mimics)载体分别转染至L02细胞，转染48小时后，提取细胞总蛋白，检测miRNAs过表达或者干扰miRNAs表达后，AGXT蛋白水平差异，明确hsa-miR-4660对基因翻译水平的影响。

4)草酸结石患者及正常组对照miRNAs及基因表达水平的检测:

本发明通过对AGXT-3’UTR的种属间同源性进行比对，发现人源AGXT-3’UTR与大鼠及小鼠agxt-3’UTR的同源性较低，因此本分析不适合利用大鼠或小鼠作为分析对象验证miR-4660对AGXT的影响。因此，本分析拟收集人外周血液标本还肝脏组织穿刺标本，验证人体内miR-4660对AGXT的影响。

i)免疫组化实验：因AGXT是肝脏特异性表达基因，故仅在人肝脏组织中才能检测到，而肝脏穿刺活检目前并非草酸结石患者确诊的必要诊断方法，且肝脏穿刺活检为有创操作，故本分析无法收集收集草酸结石患者肝脏组织标本。本分析对需要进行肝脏穿刺活检确认肝脏性疾病(肝硬化，脂肪肝等)的患者的肝脏组织(确诊病因后剩余的组织)，定制AGXT及hsa-miR-4660特异性探针，石蜡包埋组织后切片染色，通过荧光显微镜观察AGXT及hsa-miR-4660表达水平的差异；本分析通过华中科技大学同济医学院同济医院伦理委员会批准，分析中的所取样本的患者均签署知情同意书。

ii)RT-PCR实验：收集草酸结石患者和正常对照组外周血标本，提取总RNA，利用miR-4660特异性逆转录引物逆转录并检测miR-4660的表达情况，确定草酸结石患者与正常对照组外周血中AGXT及hsa-miR-4660表达水平的差异。

下面结合效果对本发明作进一步描述。

在本发明中，图2所示，人血清和肝脏组织中，miR-4660表达与AGXT的表达显著负相关。说明在人体内，miR-4660可以显著抑制基因AGXT的表达。

图3所示，mRNA和蛋白表达水平证明miR-4660可以特异性显著抑制AGXT基因的转录和表达。

图4所示，双荧光素酶报告基因实验证明miR-4660可以特异性结合AGXT基因。该研究证明miR-4660可以通过与AGXT基因3’UTR区域特异性的结合抑制其表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120> 抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atatgagctc ctgagggatc aggagcaaac 30

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcatccagt acgtgttcca 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcactcggg ctcctatg 18

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgataagctt cagctcattt ggaaggcact 30

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaggaggtg ccactatcac cgaaagggct gcctggg 37

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaggcagc cctttcggtg atagtggcac ctcctgg 37

Claims (6)

1.一种MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，所述MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法包括：

第一步，生物信息学预测：利用DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICRAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、TargetScan的miRNAs与靶标基因结合位点预测软件对AGXT-3’UTR的miRNAs靶标序列进行预测，并通过IBIVU server、UCSC检测结合位点保守性，分析miR-4660和miR-6797的结合AGXT 3-’UTR特性；

第二步，分析miR-4660/miR-697对基因AGXT 3’UTR的影响，确定靶标位点：将AGXT-3’UTR亚克隆至pMIR-Report荧光素酶报告基因下游，表达融合AGXT-3’UTR的重组荧光素酶；将报告载体分别与hsa-miR-4660/hsa-miR-6797 mimics以及随机miRNA序列共同转染Hela细胞，培养后，分析融合重组荧光素酶报告载体荧光值变化；

第三步，利用细胞学水平分析miR-4660对基因AGXT的表达：进行RT-PCR分析、Westernblot分析；

第四步，miRNAs及基因表达水平的检测:进行免疫组化检测、RT-PCR实验检测。

2.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，第二步中，培养48小时后，分析融合重组荧光素酶报告载体荧光值是否有变化；通过连续位点点突变的方法，获取miR-4660/miR-6797具体结合的靶标序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

3.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，RT-PCR分析的方法包括：

分别将hsa-miR-4660mimics或hsa-miR-4660沉默子antagomir以及随机miRNA序列载体分别转染至L02细胞，转染48小时后，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后，利用设计的AGXT定量引物对cDNA中AGXT的表达水平进行定量测定，检测miRNAs过表达或者干扰miRNAs表达后，AGXT的mRNA水平是否有变化，获得hsa-miR-4660对基因转录水平影响信息；

AGXT定量引物包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。

4.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，Western blot分析方法包括：

分别将hsa-miR-4660mimics或hsa-miR-4660沉默子antagomir以及随机miRNA序列载体分别转染至L02细胞，转染48小时后，提取细胞总蛋白，检测miRNAs过表达或者干扰miRNAs表达后，AGXT蛋白水平差异，获得hsa-miR-4660对基因翻译水平影响信息。

5.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，免疫组化分析方法包括：

对需要进行肝脏穿刺活检的肝脏组织，定制AGXT及hsa-miR-4660特异性探针，石蜡包埋组织后切片染色，分析AGXT及hsa-miR-4660表达水平的差异。

6.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，RT-PCR实验方法包括：

提取草酸结石组和正常对照组外周血标本总RNA，利用miR-4660特异性逆转录引物逆转录并检测miR-4660的表达，分析草酸结石组与正常对照组外周血中AGXT及hsa-miR-4660表达水平的差异。