CN109749997B - 一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法。其包含基础培养基和添加组分；其中，所述添加组分包括：人重组EGF、胰岛素、3,3',5‑三碘‑L‑甲腺原氨酸、氢化可的松、毛喉素、一水硫酸锰、***钠、偏硅酸钠、偏钒酸铵、六水合氯化镍、二水氯化亚锡、乙醇胺、磷酸乙醇胺、四水合钼酸铵、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、维生素C、牛血清白蛋白、脂质浓缩物和血清替代物。本发明的无血清培养基不含胎牛血清及任何动物来源成份，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，有效代替血清的作用，细胞生长良好，且提高了细胞的纯度及稳定性，为角膜缘干细胞特异性机制研究和移植治疗提供了快速稳定的细胞来源，临床应用前景广阔。

Description

一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法。
背景技术
角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜的鉴别标志是Bowman氏膜的终止处；与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞，宽约1～2 mm，此处仅有上皮层和基质层；其上皮细胞层含10层细胞，排列不规则，细胞呈小的圆柱状，核深染；其深部基质细胞为一层小圆柱状或立方形细胞，细胞核为卵圆形，与表面平行，在基底部***形成，形成特殊的“栅栏”样上皮结构，其中含有色素和丰富的血管网，并与基底膜联系紧密。
角膜上皮为有序排列的单层非角质化细胞，角膜上皮细胞的更新来源于角膜缘干细胞（LSCs），对角膜透明、视力的维持起重要作用。更新过程进行时，角膜缘干细胞向角膜中央迁移，并进行分化，这一完整的过程大概需要14天。LSCs缺乏是世界性、灾难性的眼科疑难病症，严重威胁人类视觉质量，目前缺乏有效治疗手段。常见原因包括眼外伤、碱烧伤和免疫性眼病等，在临床上，表现为角膜不透明化及视觉缺失；眼科检查以角膜上结膜化、出现新生血管、瘢痕及睑球粘连形成为诊断标准。
目前，针对角膜缘干细胞缺乏的传统治疗手段包括羊膜移植和LSCs移植，但羊膜移植可导致角膜上皮表型改变，而传统的LSCs移植需要组织多、医源性损伤较大，临床治疗效果均不理想。自体角膜缘组织移植不适合双眼角膜缘病变的患者。异体角膜缘组织移植存在排斥反应。因此，采用体外培养的角膜缘干细胞移植联合穿透性角膜移植治疗严重的角膜病变，近年来成为人们关注的热点。对于角膜缘干细胞的培养方法，目前主要采用多种不同的基底层如鼠源NIH 373滋养层、人源羊膜、纤维蛋白胶、Myogel、等离子聚合物涂层、人重组胶原基底物等对角膜缘干细胞进行培养。这些方法都能获得上皮植片，并成功用于角膜缘干细胞缺乏的补充以治疗眼表疾病。
目前国内外实验室和临床研究的角膜缘干细胞体外扩增体系，其培养基中大多数都添加了一定浓度的胎牛血清（FBS）。动物细胞的生长有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加入血清，绝大部分细胞不能增殖。血清的主要作用在于提供细胞生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，维持细胞较好的生长状态，促进细胞的生长与***增殖。但是，FBS中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险；其次，FBS的来源不稳定、成分不明确、以及有抑制生长的成分，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化；进一步，制品中残留的FBS易引起被接种者对血清的过敏反应，不利于动物实验或者临床试验。因此，FBS在干细胞临床大规模培养中的不利因素已经逐渐暴露出来，现已有很多学者研究FBS的替代品。无血清培养基具有成分明确的特点，但是现有的无血清培养基存在培养效果不甚理想，干细胞增殖速度以及培养后干细胞的纯度和数量不理想等问题。因此，寻找质量稳定、使用便捷的无血清培养体系对于LSCs的临床应用具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种角膜缘干细胞无血清培养基。
本发明的另一目的是提供所述的无血清培养基在培养角膜缘干细胞中的应用。
本发明的再一目的是提供一种角膜缘干细胞的分离培养方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种角膜缘干细胞无血清培养基，包含基础培养基和添加组分；其中，所述添加组分以浓度计，包括：10～20 ng/mL人重组EGF、5～10 μg/mL胰岛素、1×10-9～5×10-9M 3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸（即3,3′,5-triiodo-L-thyronine）、0.2～1 μg/mL氢化可的松、0.5×10-5～2×10-5M毛喉素、0.5×10-9～2×10-9M一水硫酸锰、5×10-7～10×10-7M***钠、0.1×10-3～1×10-3M偏硅酸钠（即Na2SiO3•9H2O）、3×10-6～8×10-6M偏钒酸铵、3×10-10～8×10-10M六水合氯化镍、3×10-10～8×10-10M二水氯化亚锡、3×10-7～8×10-7M乙醇胺、3×10-6～8×10-6M磷酸乙醇胺、1×10-9～6×10-9M四水合钼酸铵、2～8 g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、20～50 μg/mL维生素C、1%～3%牛血清白蛋白、0.5%～2%脂质浓缩物和10%～15%血清替代物。
本发明建立了新型无血清培养***，该培养***不含有胎牛血清，以表皮生长因子EGF、胰岛素、3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸、氢化可的松和毛喉素等可促进LSCs增殖的因子作为培养基组分，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，各添加组份能通过各种机制在角膜缘干细胞培养过程中有效地代替血清成分，细胞生长良好，能显著提高角膜缘干细胞的纯度和数量。
优选地，所述添加组分中的各组分在该无血清培养基中的浓度为：10 ng/mL的人重组EGF、5 μg/mL胰岛素、2.5×10-9M 3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸、0.4 μg/mL氢化可的松、1×10-5M毛喉素、1×10-9M一水硫酸锰、6×10-7M***钠、0.5×10-3M偏硅酸钠、5×10-6M偏钒酸铵、5×10-10M六水合氯化镍、5×10-10M二水氯化亚锡、5×10-7M乙醇胺、5×10-6M磷酸乙醇胺、3×10-9M四水合钼酸铵、5.4 g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、30 μg/mL维生素C、2%牛血清白蛋白、1%脂质浓缩物和10%血清替代物。
优选地，所述无血清培养基中还含有抗生素。
更优选地，所述抗生素为青霉素-链霉素双抗溶液。
更进一步优选地，所述青霉素的添加量为100 IU/mL，所述链霉素的添加量为100IU/mL。
更进一步优选地，每500 mL无血清培养基中添加5 mL 100×青霉素-链霉素双抗溶液。
优选地，所述基础培养基为DMEM/Ham’s F12培养基。
更优选地，所述DMEM与Ham’s F12的体积比为1:1。
本发明中，所述血清替代物，是指一种完全人工合成、无动物源蛋白污染、适合于临床研究的干细胞培养组分。本发明所述血清替代物购于Invitrogen，商标编号10828-028。
本发明中，所述脂质浓缩物（lipid concentrate）是指一种化学成分确定的脂质浓缩混合液，是指一种用于脊椎动物细胞和非脊椎动物细胞无血清培养的油脂添加成分，其对细胞结构、能量供给具有重要作用。所述脂质浓缩物即化学成分确定的脂质浓缩物购于Gibco，商标编号11905031。
相应地，将所述的无血清培养基应用于角膜缘干细胞体外培养中的用途，也在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种角膜缘干细胞的分离培养方法，所述分离培养方法包括：清洗角膜缘组织后，对角膜缘组织进行酶解，将酶解后的产物置于所述的无血清培养基中进行培养。
具体地，本发明所述分离培养方法是：取48 h内人类死亡胎儿的角膜缘组织，利用含双抗的PBS清洗后，进行酶解，将酶解后的产物以所述的角膜缘干细胞无血清培养基进行培养后，传代。
优选地，所述酶解是一次酶解；所述酶解是直接用IV型胶原酶进行酶解。本发明可以使用IV型胶原酶进行酶解分离，使角膜缘组织在胶原酶下充分酶解，从而保证获得单个细胞、减少对细胞的损伤，增大细胞得率。
优选地，所述IV型胶原酶的浓度为0.1%～0.5%；酶解时间为30～60 min。
更优选地，采取0.2% IV型胶原酶进行酶解；该IV型胶原酶溶解于DMEM/Ham’s F12培养基中；酶解时间为45 min。
优选地，上述角膜缘干细胞的分离培养方法，将酶解后的产物置于无血清培养基中进行培养之前，先加入I型胶原蛋白，再加入分离后的角膜缘干细胞。
本发明采用I型胶原蛋白作为角膜缘干细胞生长的基底物质对培养板等材料做涂层处理，提高角膜缘干细胞的纯度及稳定性，方便细胞贴壁。
具体优选地，所述角膜缘干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
S1. 取48 h内人类死亡胎儿的角膜缘组织，利用含双抗的PBS清洗后，先用0.2%的IV型胶原酶酶解45 min，加入本发明所述的无血清培养基终止酶解消化，离心去除上清；
S2. 将10%的I型胶原蛋白置于冰浴中，培养皿加入I型胶原蛋白进行包被后，再加入含有所述分离后的角膜缘干细胞的无血清培养基重悬细胞进行培养。
采用本发明提供的培养基分离角膜缘干细胞，细胞中p63、PAX6等抗体阳性率为96%～100%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供的培养基成分中无血清添加，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，各添加组份能通过各种机制在角膜缘干细胞培养过程中有效地代替血清成分，细胞生长良好；在培养过程中角膜缘干细胞增殖快、纯度高、活性高，且稳定性好。
（2）本发明建立了一种新型无滋养层、无载体、无血清的角膜缘干细胞培养方法，获得均一、高效体外扩增功能性的角膜缘干细胞，提高了细胞纯度，改善了细胞品质，为角膜缘干细胞特异性机制研究和移植治疗提供了快速稳定的细胞来源。
附图说明
图1为无血清人角膜缘干细胞培养（显微镜下形态）。
图2为角膜缘干细胞特异性标志PAX6抗体免疫化学染色；图2A为DAPI；图2B为PAX6；图2C为融合后。
图3为角膜缘干细胞特异性标志p63抗体免疫化学染色；图3D为DAPI；图3E为p63；图3F为融合后。
图4为角膜缘干细胞特异性标志Ki67抗体免疫化学染色；图4G为DAPI；图4H为Ki67；图4I为融合后。
图5为角膜缘干细胞特异性标志K12抗体免疫化学染色；图5J为DAPI；图5K为K12；图5L为融合后。
图6为利用本发明所述无血清培养基培养4天后的细胞形态图。
图7为利用本发明所述无血清培养基培养8天后的细胞形态图。
图8为利用本发明所述无血清培养基培养20天后的细胞形态图。
图9为利用本发明所述无血清培养基传代培养P1代LSCs的细胞形态图。
图10为含胎牛血清人角膜缘干细胞培养基（显微镜下形态）。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
I型胶原蛋白：1 mL I型胶原蛋白溶解于9 mL DMEM/Ham’s F12培养基中。
IV型胶原酶：以DMEM/Ham’s F12培养基配制，5 mg/mL IV型胶原酶。
人重组EGF储备液：以PBS配制，配成10 µg/mL EGF储备液。
胰岛素储备液：以0.005 mol/L HCl配制，浓度为5 mg/mL。
3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸（3,3´,5-Triiodo-L-Thyronine）储备液：13.6 mg的3,3´,5-碘甲状腺原氨酸溶解于15 mL 0.02 mol/L的NaOH溶液中，加入85 mL PBS；取0.1mL配制好的液体，添加PBS至20 mL，以作为储备液，浓度为：1×10-6M。
氢化可的松储备液：5 mg氢化可的松溶于1 mL无水乙醇中，取400 µL加入到10 mLPBS里，即为储存液。
一水硫酸锰储备液：1.69 mg一水硫酸锰入10 mL PBS，溶解后作为100万倍储备液，浓度为1×10-3M。
偏硅酸钠储备液：0.61 g偏硅酸钠加入10 mL PBS，溶解后即为1000倍储备液，浓度为0.5M。
***钠储备液：1.038 g***钠加入10 mL PBS，溶解后即为100万倍储备液，浓度为0.6M。
偏钒酸铵储备液：5.85 g偏钒酸铵加入10 mL PBS，溶解后即为100万倍储备液，浓度为5M。
六水合氯化镍储备液：1.19 mg六水合氯化镍加入10 mL PBS，溶解后即为100万倍储备液，浓度为5×10-4M。
二水氯化亚锡储备液：1.13 mg二水氯化亚锡加入10 mL PBS，溶解后即为100万倍储备液，浓度为5×10-4M。
乙醇胺储备液：305 mg乙醇胺加入10 mL PBS，溶解后即为100万倍储备液，浓度为0.5M。
磷酸乙醇胺储备液：7 mg磷酸乙醇胺加入10 mL PBS，溶解后即为1000倍储备液，浓度为5×10-3M。
四水合钼酸铵储备液：37.08 mg四水合钼酸铵加入10 mL PBS，溶解后即为100万倍储备液，浓度为3×10-3M。
维生素C储备液：取300 mg维生素C加到10 mL PBS，溶解后即为1000倍储存液。浓度为30 mg/mL。
实施例1
1、一种角膜缘干细胞无血清培养基
一种角膜缘干细胞无血清培养基，由以下组分组成：
216 mL Ham’s F12、216 mL DMEM、5 mL 100×青霉素-链霉素双抗溶液、1 mL人重组EGF储备液、500 μL胰岛素储备液、500 μL维生素C储备液、500 μL 3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸储备液、500 μL氢化可的松储备液、1 μL毛喉素储备液、0.5 μL一水硫酸锰、0.5 μL***钠、500 μL偏硅酸钠、0.5 μL偏钒酸铵、0.5 μL六水合氯化镍、0.5 μL二水氯化亚锡、0.5 μL乙醇胺、500 μL磷酸乙醇胺、0.5 μL四水合钼酸铵、2.7 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10g牛血清白蛋白、5 mL脂质浓缩物和50 mL血清替代物。
各添加组分浓度分别为10 ng/mL人重组EGF、5 μg/mL胰岛素、2.5×10-9M 3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸、0.4 μg/mL氢化可的松、1×10-5M毛喉素、1×10-9M一水硫酸锰、6×10- 7M***钠、0.5×10-3M偏硅酸钠、5×10-6M偏钒酸铵、5×10-10M六水合氯化镍、5×10-10M二水氯化亚锡、5×10-7M乙醇胺、5×10-6M磷酸乙醇胺、3×10-9M四水合钼酸铵、5.4 g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、30 μg/mL维生素C、2%牛血清白蛋白、1%脂质浓缩物和10%血清替代物。
2、一种角膜缘干细胞的分离培养方法
（1）在手术显微镜下，用组织镊和角膜剪剪取人角膜缘组织于无菌环境中用含双抗（青霉素-链霉素，1×）的PBS冲洗2次，每次5 min；再用剪刀把组织剪碎。
（2）根据组织块的体积，每1 cm3组织块加入5 mL 0.5% IV型胶原酶液，37℃轻柔振荡消化45 min，加入10倍体积的上述无血清培养基中和，1000 rpm离心5 min，弃上清。
（3）用10%的matrigel包被12孔板，将离心沉淀的细胞加入培养基重悬，分别种植于12孔板中的各个孔中，置于37℃，含5%CO2培养箱中培养，隔天换液，并在显微镜中观察细胞的生长状态。
3、实验结果分析：
（1）如图1所示，为无血清人角膜缘干细胞培养。结果表明，培养出来的细胞具有角膜缘干细胞的形态结构，证明角膜缘干细胞确实能在此无血清培养基中培养。
（2）如图2A、2B、2C所示，为角膜缘干细胞特异性标志PAX6抗体免疫化学染色，蓝色为DAPI，绿色为PAX6。结果表明，所培养的细胞表现为PAX6阳性，具备角膜缘干细胞的特征，PAX6抗体阳性率为96%～100%。
（3）如图3D、3E、3F所示，为干细胞特异性标志p63抗体免疫化学染色，蓝色为DAPI，绿色为p63。结果表明，所培养的细胞表现为p63阳性，具备干细胞的特征，p63抗体阳性率为96%～100%。
（4）如图4G、4H、4I所示，为角膜缘干细胞特异性标志Ki67抗体免疫化学染色，蓝色为DAPI，绿色为Ki67。结果表明，所培养的细胞表现为Ki67阳性，具备角膜缘干细胞的特征，Ki67抗体阳性率为96%～100%。
（5）如图5J、5K、5L所示，角膜缘干细胞特异性标志K12抗体免疫化学染色，蓝色为DAPI，绿色为K12。结果表明，所培养细胞表现为K12阳性，具备角膜缘干细胞的特征，K12抗体阳性率为96%～100%。
（6）如图6～9所示，为利用本发明所述无血清培养基培养4～20天及传代后的细胞形态。结果表明，细胞形态特征符合角膜缘干细胞的特征。
综上结果可知，利用本发明的无血清培养基可以很好的代替含血清培养基，实现角膜缘干细胞的培养，且细胞生长良好，在培养过程中角膜缘干细胞增殖快、纯度高、活性高、稳定性好，获得了均一、高效体外扩增功能性的角膜缘干细胞，改善了细胞品质，为角膜缘干细胞特异性机制研究和移植治疗提供了快速稳定的细胞来源。
实施例2 培养基配方
实验方法同实施例1，唯一不同的是，本实施例所用的角膜缘干细胞无血清培养基中各添加组分的浓度为：
10 ng/mL人重组EGF、10 μg/mL胰岛素、5×10-9M 3-碘甲状腺原氨酸、0.2 μg/mL氢化可的松、2×10-5M毛喉素、0.5×10-9M一水硫酸锰、5×10-7M***钠、0.1×10-3M偏硅酸钠、8×10-6M偏钒酸铵、3×10-10M六水合氯化镍、8×10-10M二水氯化亚锡、3×10-7M乙醇胺、8×10-6M磷酸乙醇胺、1×10-9M四水合钼酸铵、8 g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、20 μg/mL维生素C、3%牛血清白蛋白、0.5%脂质浓缩物和15%血清替代物。
实施例3 培养基配方
实验方法同实施例1，唯一不同的是，本实施例所用的角膜缘干细胞无血清培养基中各添加组分的浓度为：
20 ng/mL人重组EGF、5 μg/mL胰岛素、1×10-9M 3-碘甲状腺原氨酸、1 μg/mL氢化可的松、0.5×10-5M毛喉素、2×10-9M一水硫酸锰、10×10-7M***钠、1×10-3M偏硅酸钠、3×10-6M偏钒酸铵、8×10-10M六水合氯化镍、3×10-10M二水氯化亚锡、8×10-7M乙醇胺、3×10-6M磷酸乙醇胺、6×10-9M四水合钼酸铵、2 g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、50 μg/mL维生素C、1%牛血清白蛋白、2%脂质浓缩物和5%血清替代物。
对比例1 阳性对照（含胎牛血清培养基）
实验方法同实施例1，唯一不同的是，本实施例所用的角膜缘干细胞培养基中含有胎牛血清，其具体组成为：216 mL Ham’s F12、216 mL DMEM、5 mL 100×青霉素-链霉素双抗溶液和63 mL胎牛血清。
如图10所示，为含血清人角膜缘干细胞培养。研究发现，与含血清培养基相比，利用实施例1的无血清培养基得到的角膜缘干细胞无明显差异；而且无血清培养基中角膜缘干细胞的生长速度与含血清培养基中角膜缘干细胞的生长速度差不多，细胞形态规则、统一，说明本发明的无血清培养基培养角膜缘干细胞的纯度也很高。结果表明，本发明的无血清培养基可以完全替代含血清培养基来培养角膜缘干细胞。
对比例2 阴性对照（只含基础培养基和抗生素）
实验方法同实施例1，唯一不同的是，本实施例所用的角膜缘干细胞培养基含有216 mL Ham’s F12、216 mL DMEM和5 mL 100×青霉素-链霉素双抗溶液。
研究发现，与实施例1无血清培养基与相比，细胞完全无法贴壁生长。结果表明，此培养基不适合作为角膜缘干细胞培养基。
对比例3 只含基础培养基、抗生素和血清替代物的培养基
实验方法同实施例1，唯一不同的是，本实施例所用的角膜缘干细胞培养基含有216 mL Ham’s F12、216 mL DMEM、5 mL 100×青霉素-链霉素双抗溶液和10%血清替代物。
结果发现，与实施例1无血清培养基与相比，细胞生长情况较差，不适合用于培养角膜缘干细胞。
对比例4
其它条件与实施例1相同，不同之处在于：血清替代物的浓度为1%。
结果发现，血清替代物的浓度为1%，血清替代物的浓度过低，会引起细胞形态发生改变。
对比例5
其它条件与实施例1相同，不同之处在于：毛喉素的浓度为0.1×10-5M。
结果发现，毛喉素浓度从1×10-5M降低到0.1×10-5M，结果发现角膜缘干细胞的细胞变大，细胞核变小，细胞贴壁能力差等。
对比例6
其它条件与实施例1相同，不同之处在于：脂质浓缩物的浓度为0.1%。
结果发现，细胞生长缓慢，表皮细胞的形态不明显，细胞与细胞间连接松散，死亡细胞较多。
另外发现，人重组EGF、胰岛素、3-碘甲状腺原氨酸、氢化可的松、毛喉素、一水硫酸锰、***钠、偏硅酸钠、偏钒酸铵、六水合氯化镍、二水氯化亚锡、乙醇胺、磷酸乙醇胺、四水合钼酸铵、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、维生素C、牛血清白蛋白、脂质浓缩物和血清替代物均在角膜缘干细胞培养中起到重要的作用，缺一不可。

Claims (8)

1.一种角膜缘干细胞无血清培养基，其特征在于，包含基础培养基和添加组分；其中，所述添加组分以浓度计，包括：10～20 ng/mL人重组EGF、5～10 μg/mL胰岛素、1×10-9～5×10-9M 3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸、0.2～1 μg/mL氢化可的松、0.5×10-5～2×10-5M毛喉素、0.5×10-9～2×10-9M一水硫酸锰、5×10-7～10×10-7M***钠、0.1×10-3～1×10-3M偏硅酸钠、3×10-6～8×10-6M偏钒酸铵、3×10-10～8×10-10M六水合氯化镍、3×10-10～8×10-10M二水氯化亚锡、3×10-7～8×10-7M乙醇胺、3×10-6～8×10-6M磷酸乙醇胺、1×10-9～6×10-9M四水合钼酸铵、2～8 g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、20～50 μg/mL维生素C、1%～3%牛血清白蛋白、0.5%～2%脂质浓缩物和10%～15%血清替代物；
所述无血清培养基中还含有抗生素，所述抗生素为青霉素-链霉素双抗溶液。
2.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分中的各组分在该无血清培养基中的浓度为：10 ng/mL人重组EGF、5 μg/mL胰岛素、2.5×10-9M 3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸、0.4 μg/mL氢化可的松、1×10-5M毛喉素、1×10-9M一水硫酸锰、6×10-7M***钠、0.5×10-3M偏硅酸钠、5×10-6M偏钒酸铵、5×10-10M六水合氯化镍、5×10-10M二水氯化亚锡、5×10-7M乙醇胺、5×10-6M磷酸乙醇胺、3×10-9M四水合钼酸铵、5.4 g/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、30 μg/mL维生素C、2%牛血清白蛋白、1%脂质浓缩物和10%血清替代物。
3.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/Ham’s F12培养基。
4.根据权利要求3所述的角膜缘干细胞无血清培养基，其特征在于，所述DMEM与Ham’sF12的体积比为1:1。
5.权利要求1～4任一所述的无血清培养基在体外培养角膜缘干细胞中的应用。
6.一种角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括：清洗角膜缘组织后，对角膜缘组织进行酶解，将酶解后的产物置于权利要求1～4任一所述的无血清培养基中进行培养。
7.根据权利要求6所述的分离培养方法，其特征在于，所述酶解是一次酶解；所述酶解是直接用IV型胶原酶进行酶解。
8.根据权利要求7所述的分离培养方法，其特征在于，所述IV型胶原酶的浓度为0.1%～0.5%；酶解时间为30～60 min。
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