CN109735625A - ***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用。本发明所述的应用是提取收集到的***溢液中的DNA，进行肿瘤相关基因的检测，其中，肿瘤相关基因的检测可采用基因芯片技术。与采用血液样本检测肿瘤相关基因相比较，***溢液目的成分浓度高，用量少，一般用量为500‑800μL即可完成检测，准确性高，而且取材方便快捷、无创伤、临床应用方便；与采用新鲜肿瘤组织和石蜡包埋组织检测肿瘤相关基因相比较，***溢液检测到的突变信息更全面，能够避免由穿刺活检引起的血道和淋巴道播散和转移风险，有效克服因异质性造成的检测偏差。

Description

***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用

技术领域

本发明涉及***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

现有癌基因、药物靶向基因检测的方法主要有两种方法：①血液检测：抽取病人10-20mL外周血液提取DNA进行检测，外周血液检测需要血液量多，而且血液检测之所以能检测到相关基因，是因为肿瘤细胞突破腺体的基底膜，到达血液中，发生全身转移后，才能在血液循环中检测出肿瘤相关基因，如果病人肿瘤生长没有突破腺体的基底膜，即便肿瘤是恶性，恶性程度很高，血液中也不会检测到肿瘤相关基因。所以，通过血液检测出基因的变化，已经是到了肿瘤的晚期才能实现，并且已经发生了血行转移；②用病人手术切下的肿瘤组织提取DNA进行检测。用组织检测的方法有不同的缺点，首先，无论用新鲜肿瘤组织或石蜡包埋组织检测，都是在手术切除以后进行，因此，不能够提前预知病人肿瘤的良恶性，也无法作为筛选肿瘤的方法，如果用石蜡包埋组织，因为组织经过前期的固定、脱水、包埋等处理，在一定程度上可能会造成DNA的损伤，也就可能会影响检测结果的准确性；其次，用穿刺活检肿瘤组织提取DNA进行检测，为乳腺恶性肿瘤需要做手术前化疗(新辅助治疗)提供诊断依据，但是穿刺取组织会损伤血管、***，可能增加恶性肿瘤血行播散和转移的风险，另外，乳腺肿瘤具有异质性，即肿瘤细胞之间具有不同的基因和表型，取肿瘤局部组织进行检测具有一定局限性。

***溢液是发生良性或恶性病变的乳腺导管上皮细胞的分泌物和脱落的乳腺导管上皮细胞进入乳腺导管混合而成的液体，或者是发生良性或恶性病变的乳腺导管上皮细胞的分泌物、脱落的乳腺导管上皮细胞和被肿瘤组织破坏的毛细血管流出的血液成分进入乳腺导管混合而成的液体。目前，国内临床上对于***溢液的检查项目仅限于蛋白水平的癌胚抗原、癌抗原以及细胞涂片的检测，而采用***溢液检测肿瘤相关基因却鲜有报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用，通过按压病变区域乳腺腺叶，将分泌物通过输乳管、***挤压出来，收集后提取其中的DNA成分检测肿瘤相关基因，能够比较全面地反应整个肿瘤基因变化的情况。

本发明的技术方案如下：

***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用，其特征在于，所述应用是提取收集到的***溢液中的DNA，进行肿瘤相关基因的检测。

根据本发明优选的，所述***溢液按照以下步骤收集：

1)用医用酒精棉球对患者***进行擦拭，去除***表面细胞碎屑；

2)对患侧***进行人工按压，自***四周向***按压，按压时适当用力，避免过度用力按压造成乳管损伤，使液体溢出，即得***溢液。

根据本发明优选的，所述收集到的***溢液≥20μL，进一步优选的，所述收集到的***溢液为500-800μL。

根据本发明优选的，所述***溢液中的DNA按照本领域常规方法进行提取。

根据本发明优选的，所述肿瘤相关基因的检测采用基因芯片技术。

进一步优选的，所述基因芯片技术是将提取到的DNA质控合格后采用基因芯片捕获肿瘤相关基因，测序后剔除测序数据中的低质量序列和接头序列，进行突变检出，得出***溢液中肿瘤相关基因。

进一步优选的，所述肿瘤相关基因包括已报道的肿瘤药物相关基因、原癌基因、抑癌基因以及人群突变频率较高基因的热点外显子区域。

进一步优选的，所述突变检出是指将单碱基变异(SNV)、小片段***/缺失(SmallIndel)、拷贝数变异(CNV)、融合基因变异和胚系变异检出。

本发明中的***溢液仅指人的***溢液。本发明适用于已报道的现有肿瘤基因。

有益效果：

***溢液是发生良性或恶性病变的乳腺导管上皮细胞的分泌物和脱落的乳腺导管上皮细胞进入乳腺导管混合而成的液体，或者是发生良性或恶性病变的乳腺导管上皮细胞的分泌物、脱落的乳腺导管上皮细胞和被肿瘤组织破坏的毛细血管流出的血液成分进入乳腺导管混合而成的液体。与采用血液样本检测肿瘤相关基因相比较，***溢液目的成分浓度高，用量少，准确性高，而且取材方便快捷、无创伤、临床应用方便；与采用新鲜肿瘤组织和石蜡包埋组织检测肿瘤相关基因相比较，***溢液检测到的突变信息更全面，能够避免由穿刺活检引起的血道和淋巴道播散和转移风险，有效克服因异质性造成的检测偏差。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作出进一步的说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例中，***溢液的收集由受过***训练的外科医生进行。

实施例中基因芯片技术检测肿瘤相关基因由吉因加公司提供技术支持。

实施例中基因芯片检测的相关基因包括：

1、体细胞变异基因检测表

表1. 288个包含全部外显子区域基因

表2. 38个包含内含子、启动子、融合断点区域基因

ALK

BCL2L11

BRAF

BRCA1

BRD4

CD74

EGFR

EML4

ERG

ETV6

EZR

FGFR1

FGFR2

FGFR3

KIF5B

KIT

MAML2

MET

MSH2

MYC

MYCL1

NCOA4

NOTCH2

NTRK1

NTRK2

NTRK3

PDGFRA

PMS2

PPARG

RAF1

RET

ROS1

RSPO2

SLC34A2

TERT

TFE3

TMPRSS2

TPM3

表3. 728个包含部分外显子区的基因

2、胚系变异基因检测表

表4.胚系变异检测基因

ATM	BRCA1	BRCA2	MLH1	MLH3	MSH2
						MSH3	MSH6	PALB2	PMS1	PMS2

实施例中未详细说明的，均按照本领域常规操作进行。

实施例1

***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用，临床诊断为右乳导管内癌的患者，收集其***溢液，提取DNA，进行肿瘤相关基因的检测，具体步骤如下：

(1)临床诊断为右乳导管内癌的患者，用医用酒精棉球对患者***进行擦拭，去除***表面细胞碎屑，对患侧***进行人工按压，自***四周向***按压，按压时适当用力，避免过度用力按压造成乳管损伤，使液体溢出，收集***溢液300μL，存储于液氮中备用；

(2)提取步骤(1)收集到的***溢液中的DNA，质控合格后采用基因芯片捕获肿瘤相关基因；

其中，基因芯片包括已报道的肿瘤药物相关基因、原癌基因、抑癌基因以及人群突变频率较高基因的热点外显子区域；

(3)将步骤(2)捕获到的肿瘤相关基因进行双末端测序，剔除测序数据中的低质量序列和接头序列，进行突变检出，检出的突变类型包括单碱基变异(SNV)、小片段***/缺失(Small Indel)、拷贝数变异(CNV)、融合基因变异和胚系变异，得出***溢液中肿瘤相关基因。

检测结果如表5-6所示。采用***溢液检测肿瘤相关基因，共检测出11个体细胞变异和0个胚系变异。ERBB2(又名HER2/neu)基因编码受体酪氨酸激酶Her2，属于表皮生长因子受体家族(EGFR)，ERBB2基因的扩增或过度表达会导致细胞过度增殖而形成肿瘤，***溢液检测结果显示，患者ERBB2基因的突变频率为5.3，提示的靶向药物为拉帕替尼、来那替尼、曲妥珠单抗、吡咯替尼、T-DM1、帕妥珠单抗、阿法替尼。FGFR4是FGFR酪氨酸激酶家族中的一员，在生理状态下，FGFR4信号通路被严格控制，而FGFR4信号失调导致癌症的发生发展、增殖、存活及转移，FGFR4的突变与肿瘤密切相关，***溢液的检测结果显示，患者FGFR4基因的突变频率为3.1，提示的靶向药物为帕那替尼。

表5***溢液中突变的检测结果

表6***溢液检测结果的靶向药物提示

注：*标记的是检测本癌种中获批的药物，其余为跨癌种药物。

***溢液检测出的11个体细胞变异如表7-9所示，包括1个小片段***/缺失突变，4个基因点突变和6个基因拷贝数变异，未发现融合基因变异。***溢液中未检测出胚系变异(表10)。

表7体细胞变异中点突变、小片段***/缺失检测结果

表8体细胞变异中拷贝数变异检测结果

表9体细胞变异中融合基因检测结果

表10胚系变异检测结果

BCL2L11基因是细胞凋亡相关基因，其多态性的***溢液检测结果如表11所示，2号内含子2903bp缺失多态性，导致BCL2L11基因编码的蛋白不能行使细胞凋亡相关功能，BCL2L11基因的多态性缺失与肿瘤密切相关。

表11 BCL2L11多态性检测结果

对比例1

采用实施例1中诊断为右乳导管内癌患者的石蜡包埋组织检测肿瘤相关基因，具体步骤如下：

(1)将实施例1诊断为右乳导管内癌的患者外科手术切除肿瘤组织，经固定、脱水、包埋等处理后制备得到石蜡包埋组织，备用；

(2)提取步骤(1)制备得到的石蜡包埋组织的DNA，质控合格后采用基因芯片捕获肿瘤相关基因；

其中，基因芯片包括已报道的肿瘤药物相关基因、原癌基因、抑癌基因以及人群突变频率较高基因的热点外显子区域；

(3)将步骤(2)捕获到的肿瘤相关基因进行双末端测序，剔除测序数据中的低质量序列和接头序列，进行突变检出，检出的突变类型包括单碱基变异(SNV)、小片段***/缺失(Small Indel)、拷贝数变异(CNV)、融合基因变异和胚系变异，得出石蜡包埋组织中肿瘤相关基因。

检测结果如表12-13所示。采用石蜡包埋组织检测肿瘤相关基因，共检测到6个体细胞变异和0个胚系变异，患者ERBB2基因的突变频率为2.9，提示的靶向药物为拉帕替尼、来那替尼、曲妥珠单抗、吡咯替尼、T-DM1、帕妥珠单抗、阿法替尼。

对比例1与实施例1相比，实施例1采用***溢液检测到更多突变(11个体细胞变异和0个胚系变异)，而且检测到的ERBB2基因的突变频率为5.3，比对比例1检测到的突变频率(2.9)更为准确；另外实施例1还检测到了FGFR4基因组变异。

表12石蜡包埋组织中突变的检测结果

表13石蜡包埋组织检测结果的靶向药物提示

注：*标记的是检测本癌种中获批的药物，其余为跨癌种药物。

石蜡包埋组织检测出的6个体细胞变异如表14-16所示，包括包括1个小片段***/缺失突变、3个基因点突变和2个基因拷贝数变异，未发现融合基因变异。石蜡包埋组织中未检测到胚系变异(表17)。

对比例1与实施例1相比，对比例1中检测出的6个体细胞变异均包含在实施例1的检测结果中，实施例1***溢液的检测结果更加全面。

表14体细胞变异中点突变、小片段***/缺失检测结果

表15体细胞变异中拷贝数变异检测结果

表16体细胞变异中融合基因检测结果

表17胚系变异检测结果

石蜡包埋组织检测到的细胞凋亡相关基因BCL2L11的多态性(表18)与实施例1的结果一致，均为2号内含子2903bp缺失多态性。

表18 BCL2L11多态性检测结果

实施例2

***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用，临床诊断为右乳导管内癌的另一患者，收集其***溢液，提取DNA，进行肿瘤相关基因的检测，具体步骤如下：

(1)临床诊断为右乳导管内癌的另一患者，用医用酒精棉球对患者***进行擦拭，去除***表面细胞碎屑，对患侧***进行人工按压，自***四周向***按压，按压时适当用力，避免过度用力按压造成乳管损伤，使液体溢出，收集***溢液500μL，存储于液氮中备用；

(2)提取步骤(1)收集到的***溢液中的DNA，质控合格后采用基因芯片捕获肿瘤相关基因；

其中，基因芯片包括已报道的肿瘤药物相关基因、原癌基因、抑癌基因以及人群突变频率较高基因的热点外显子区域；

(3)将步骤(2)捕获到的肿瘤相关基因进行双末端测序，剔除测序数据中的低质量序列和接头序列，进行突变检出，检出的突变类型包括单碱基变异(SNV)、小片段***/缺失(Small Indel)、拷贝数变异(CNV)、融合基因变异和胚系变异，得出***溢液中肿瘤相关基因。

检测结果如表19-20所示。采用***溢液检测肿瘤相关基因，共检测出6个体细胞变异和0个胚系变异。PIK3CA基因在细胞生长、凋亡及肿瘤的形成过程中起重要的作用，PIK3CA基因突变与乳腺癌生物学特性及临床预后等有关，***溢液检测结果显示，患者PIK3CA基因的突变频率为35.5％，提示的靶向药物为依维莫司、西罗莫司、替西罗莫司，提示的耐受药物为曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。

表19***溢液中突变的检测结果

表20***溢液检测结果的靶向药物提示

注：*标记的是检测本癌种中获批的药物，其余为跨癌种药物。

***溢液检测出的6个体细胞变异如表21-23所示，包括1个小片段***/缺失突变和5个基因点突变，未发现基因拷贝数变异和融合基因变异。***溢液中未检测出胚系变异(表24)。

表21体细胞变异中点突变、小片段***/缺失检测结果

表22体细胞变异中拷贝数变异检测结果

表23体细胞变异中融合基因检测结果

表24胚系变异检测结果

BCL2L11基因是细胞凋亡相关基因，其多态性的***溢液检测结果如表25所示，2号内含子2903bp缺失多态性，导致BCL2L11基因编码的蛋白不能行使细胞凋亡相关功能，BCL2L11基因的多态性缺失与肿瘤密切相关。

表25 BCL2L11多态性检测结果

对比例2

采用实施例2中诊断为右乳导管内癌患者的新鲜肿瘤组织检测肿瘤相关基因，具体步骤如下：

(1)将实施例2诊断为右乳导管内癌的患者外科手术切除肿瘤，得新鲜肿瘤组织，备用；

(2)提取步骤(1)得到的新鲜肿瘤组织的DNA，质控合格后采用基因芯片捕获肿瘤相关基因；

其中，基因芯片包括已报道的肿瘤药物相关基因、原癌基因、抑癌基因以及人群突变频率较高基因的热点外显子区域；

(3)将步骤(2)捕获到的肿瘤相关基因进行双末端测序，剔除测序数据中的低质量序列和接头序列，进行突变检出，检出的突变类型包括单碱基变异(SNV)、小片段***/缺失(Small Indel)、拷贝数变异(CNV)、融合基因变异和胚系变异，得出新鲜肿瘤组织中肿瘤相关基因。

检测结果如表26-27所示。采用新鲜肿瘤组织检测肿瘤相关基因，共检测出3个体细胞变异和0个胚系变异，患者PIK3CA基因的突变频率为15.7％，提示的靶向药物为依维莫司、西罗莫司、替西罗莫司，提示的耐受药物为曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。

对比例2与实施例2相比，实施例2检测出6个体细胞变异和0个胚系变异，比对比例2的检测结果更加全面。实施例2检测到的患者PIK3CA基因的突变频率为35.5％，与对比例2检测到的突变频率(15.7％)相比更加准确。

表26新鲜肿瘤组织中突变的检测结果

表27新鲜肿瘤组织检测结果的靶向药物提示

注：*标记的是检测本癌种中获批的药物，其余为跨癌种药物。

新鲜肿瘤组织检测出的3个体细胞突变如表28-30所示，包括1个小片段***/缺失突变和2个基因点突变，未发现基因拷贝数变异和融合基因变异。新鲜肿瘤组织中未检测出胚系变异(表31)。

对比例2与实施例2相比，对比例2检测出的3个体细胞变异均包含在实施例2的检测结果中，实施例2***溢液的检测结果更加全面准确。

表28体细胞变异中点突变，小片段***缺失检测结果

表29体细胞变异中拷贝数变异检测结果

表30体细胞变异中融合基因检测结果

表31胚系变异检测结果

新鲜肿瘤组织检测到的细胞凋亡相关基因BCL2L11的多态性(表32)与实施例2的结果一致，均为2号内含子2903bp缺失多态性。

表32 BCL2L11多态性检测结果

综上，将***溢液应用于肿瘤相关基因的检测，因其目的成分的浓度较高，所以检测时用量少、准确性高，而且取材方便快捷、无创伤、临床应用方便，与采用新鲜肿瘤组织和石蜡包埋组织检测肿瘤相关基因相比较，***溢液检测到的突变信息更全面准确，能够避免由穿刺活检引起的血道和淋巴道播散和转移风险，有效克服因异质性造成的检测偏差。新鲜肿瘤组织和石蜡包埋组织需要在术后检测，***溢液在手术前检测，可以提前检测出肿瘤相关基因。

Claims (7)

1.***溢液在检测肿瘤相关基因中的应用，其特征在于，所述应用是提取收集到的***溢液中的DNA，进行肿瘤相关基因的检测。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述***溢液按照以下步骤收集：

1)用医用酒精棉球对患者***进行擦拭，去除***表面细胞碎屑；

2)对患侧***进行人工按压，自***四周向***按压，按压时适当用力，避免过度用力按压造成乳管损伤，使液体溢出，即得***溢液。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述收集到的***溢液≥20μL。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述收集到的***溢液为500-800μL。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤相关基因的检测采用基因芯片技术。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因芯片技术是将提取到的DNA质控合格后采用基因芯片捕获肿瘤相关基因，测序后剔除测序数据中的低质量序列和接头序列，进行突变检出，得出***溢液中肿瘤相关基因。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述突变检出是指将单碱基变异、小片段***/缺失)、拷贝数变异、融合基因变异和胚系变异检出。