CN109722407A - 一种微藻冰温启动补偿生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微藻冰温启动补偿生长的方法，所述方法具体为：在黑暗条件下，将处于对数生长期的微藻的培养温度匀速降低至0～‑10℃，维持该温度1‑15h后，即可。本发明通过对微藻进行外部冰温刺激以诱导其细胞机体内部吸收与代谢机制发生变化，启动其冰温补偿生长机制，促进其机体活力。本发明简单有效，处理成本低廉，可直接用于微藻的工业化生产，大大提高微藻的工业化产率，利用本发明方法处理后的微藻生长速率比未处理微藻增加了2倍以上，这对于提高微藻养殖效率、延长养殖期和规模化养殖具有重大的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高微藻生长速率的方法，具体涉及一种微藻冰温启动补偿生长的方法。
背景技术
螺旋藻、盐藻和小球藻是属于可以大规模产业化的经济微藻，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、生物多糖、不饱和脂肪酸、叶绿素、类胡萝卜素及人体所需的各种矿物质等，具有良好的营养保健功能。目前，微藻食品处理片剂之一主导产品外，还陆续出现在把藻粉营养提取物作为食品添加至普通食品中，制成具有微藻营养和风味的食品。另一方面，在化石燃料大量消耗的几天，生物燃料正变得越来越重要，而微藻生物燃料作为第三代生物燃料，比之前的使用淀粉和玉米等农作物生产的第一代生物材燃料以及使用纤维素和作物秸秆等生产的第二代生物燃料具有更大的优势。
植物在经历某种环境因子胁迫后，在恢复期总干重大于对照组植物的总干重，这种显现称之为补偿生长，目前这种补偿生长的现在已广泛存在与陆地、水生动物和高等植物中进行了深入的研究，胁迫因子包括温度，光照、pH和盐胁迫。目前较有成效的藻类补偿生长的研究大多集中在光照和温度两方面，前人研究发现，由于，藻类的光饱和性，低光胁迫比高光胁迫的补偿生长效果更好；而高低温胁迫也皆有令藻类出现补偿生长的作用，但是就目前文献报道可知，高温胁迫虽然会藻类有一定的补偿生长作用，但是同时在一定程度上对藻丝体造成了损伤，而这类损伤需要花费较长一段时间恢复，而低温胁迫显然大大降低了这一损伤，但其补偿生长的效率却没有高温胁迫明显，目前对于低温胁迫的补偿生长研究的温度范围仅为2-15℃，零下冰温胁迫促进补偿生长未见报道。
在我国，微藻的生产普遍会受当地环境因素的限制，由于环境影响，使得微藻的养殖生产期大大受到了限制，无法实现全年养殖，以螺旋藻为例，其养殖生产期每年只有大概6个月，由于当地冬春季的环境温度较低，使得每年进入养殖生产期之前的育种期时间较长，并且，在养殖生产期初期的产量非常低，以至于在整年中只有6、7、8三个月最为高产。另一方面，在世界范围中，微藻的养殖基本采用的是传统大棚跑道式养殖这一落后的养殖方式，使得整个地区的养殖效率低下，生产成本较高。
为解决养殖生产效率低、养殖期生物量低、养殖期短和育种难的问题，结合当地实际，开展秋冬季养殖技术研究，发现了一种微藻冰温启动超补偿生长的方法，以期提高总产值，降低生产成本，获得最大的经济效益。
发明内容
为了提高微藻的工业化产量，降低生产成本，因地制宜，结合当地实际环境条件，本发明对如何启动微藻冰温补偿生长方面进行了大量研究，发明人通过对微藻进行外部冰温刺激以诱导其细胞机体内部吸收与代谢机制发生变化，启动其冰温补偿生长机制，促进其机体活力，从而提出一种微藻冰温启动补偿生长的方法。
所述方法具体为：在黑暗条件下，将处于对数生长期的微藻的培养温度匀速降低至0～-10℃，维持所述培养温度1-15h后，即可。
本发明通过对微藻进行外部冰温刺激以诱导其细胞机体内部吸收与代谢机制发生变化，启动其冰温补偿生长机制，促进其机体活力。
本发明进一步提出，所述微藻选自螺旋藻、盐藻、小球藻中的一种或多种；
其中，螺旋藻包括极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、盐泽螺旋藻；
盐藻包括杜氏盐藻；；
本发明对钝顶螺旋藻、杜氏盐藻和小球藻，促进生长的效果最优。
本发明所述的方法使用于上述类型的微藻，并不限于实施例中所列举的类型。
本发明进一步提出的，所述微藻采用如下预培养方式进入对数生长期：将所述微藻接种到培养基中，在温度为26～38℃，照度为5000～30000Lux的条件下进行培养；
优选地，将螺旋藻接种到pH值为8.25～9.5的Z氏培养基中；
将盐藻接种到pH值为7.2～7.8的DM培养基中；
将小球藻接种到pH值为7.0～7.4的BG-11培养基中。
进一步优选地，所述螺旋藻接种到pH值为8.5～9的Z氏培养基中；
所述盐藻接种到pH值为7.5的DM培养基中；
所述小球藻接种到pH值为7.1的BG-11培养基中。
其中，所述Z氏培养基的配方为：碳酸氢钠16.8g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硝酸钠2.4g/L，硫酸钾1.0g/L，氯化钠1.0g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，二水和氯化钙0.04g/L，七水合硫酸亚铁0.2g/L，EDTA二钠0.08g/L，混合均匀。
所述DM培养基的配方为：氯化钠87.69g/L，硝酸钠0.42g/L，二水合磷酸二氢钠0.0156g/L，二水合氯化钙0.044g/L，氯化钾0.074g/L，七水合硫酸镁1.23g/L，碳酸氢钠0.84g/L，柠檬酸铁(1％)0.5mL。
所述BG-11的配方为：硝酸钠10mL(15g/100mLdH2O),磷酸氢二钾10mL(2g/500mLdH2O)，七水合硫酸镁10mL(3.75g/500mLdH2O)，二水合氯化钙10mL(1.8g/500mLdH2O)，柠檬酸10mL(0.3g/500mLdH2O)，柠檬酸铁铵10mL(0.3g/500mLdH2O)，EDTA二钠10mL(0.05g/500mLdH2O)，碳酸钙10mL(1.0g/500mLdH2O)。
本发明进一步提出的，所述预培养在温度为31～33℃，照度为5000～7000Lux的条件下进行培养。
本发明进一步提出的，调整pH值可采用本领域常规手段；优选采用更有益于藻类生长的调整液，更优选采用富含磷源的磷酸溶液调节pH值；
具体采用浓度为0.1～0.5mol/L的磷酸溶液，优选为0.1mol/L。
所述微藻在所述培养基中的接种浓度8～12ml/L，优选为10ml/L。所述微藻是呈藻泥状态的，每10ml/L的藻泥，其OD值在0.3左右。
所述预培养的天数为1～3天，优选为2天。
本发明进一步提出的，所述培养温度匀速降低的速率为每20～60分钟降温1℃，优选为每30～42分钟降温1℃，进一步优选为每36分钟降温1℃。
本发明进一步提出的，所述培养温度匀速降低至0～-7℃，优选为0～-5℃；尤其是当温度降至-5℃时，补偿生长的效率最高。
本发明进一步提出的，维持所述培养温度的时间为6～15h，优选为9～12h。
作为本发明的优选方案，一种微藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将螺旋藻、盐藻或小球藻以8～12ml/L的接种浓度接种培养基中，在温度为31～33℃，照度为5000～7000Lux的条件下，培养使其进入对数生长期阶段；
其中，
所述螺旋藻接种到pH值为8.25～9.5的Z氏培养基中；
所述盐藻接种到pH值为7.2～7.8的DM培养基中；
所述小球藻接种到pH值为7.0～7.4的BG-11培养基中；
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的螺旋藻、盐藻或小球藻的培养温度以每30～40分钟降温1℃的速率匀速降低至0～-5℃，维持所述培养温度9-12h后，即可。
进一步提出的优选方案，一种微藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将螺旋藻、盐藻或小球藻以10ml/L的接种浓度接种培养基中，在温度为31～33℃，照度为5000～7000Lux的条件下，培养使其进入对数生长期阶段；
其中，
所述螺旋藻接种到pH值为8.5～9的Z氏培养基中；
所述盐藻接种到pH值为7.2～7.8的DM培养基中；
所述小球藻接种到pH值为7.0～7.4的BG-11培养基中；
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的螺旋藻、盐藻或小球藻的培养温度以每36分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃，维持所述培养温度12h后，即可。
本发明提供的启动微藻冰温补偿生长的方法，简单有效，处理成本低廉，可直接用于微藻的工业化生产，大大提高微藻的工业化产率，利用本发明方法处理过后的微藻其生长速率比普通微藻增加了2倍以上，具有不可估量的产业化应用价值。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例中采用的Z氏培养基的配制方法如下：
碳酸氢钠16.8g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硝酸钠2.4g/L，硫酸钾1.0g/L，氯化钠1.0g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，二水和氯化钙0.04g/L，七水合硫酸亚铁0.2g/L，EDTA二钠0.08g/L，混合均匀。
所述DM培养基的配方为：氯化钠87.69g/L，硝酸钠0.42g/L，二水合磷酸二氢钠0.0156g/L，二水合氯化钙0.044g/L，氯化钾0.074g/L，七水合硫酸镁1.23g/L，碳酸氢钠0.84g/L，柠檬酸铁(1％)0.5mL。
所述BG-11的配方为：硝酸钠10mL(15g/100mLdH2O),磷酸氢二钾10mL(2g/500mLdH2O)，七水合硫酸镁10mL(3.75g/500mLdH2O)，二水合氯化钙10mL(1.8g/500mLdH2O)，柠檬酸10mL(0.3g/500mLdH2O)，柠檬酸铁铵10mL(0.3g/500mLdH2O)，EDTA二钠10mL(0.05g/500mLdH2O)，碳酸钙10mL(1.0g/500mLdH2O)。
所述BG-11的配方为：硝酸钠10mL(15g/100mLdH2O),磷酸氢二钾10mL(2g/500mLdH2O)，七水合硫酸镁10mL(3.75g/500mLdH2O)，二水合氯化钙10mL(1.8g/500mLdH2O)，柠檬酸10mL(0.3g/500mLdH2O)，柠檬酸铁铵10mL(0.3g/500mLdH2O)，EDTA二钠10mL(0.05g/500mLdH2O)，碳酸钙10mL(1.0g/500mLdH2O)。
实施例中所采用的螺旋藻为钝顶螺旋藻，获自北京林业大学螺旋藻研究所保存的藻种；
盐藻(FACHB-435)和小球藻(FACHB-8)购自与中国科学院野生生物种质库-淡水藻种库。
实施例1
本实施例为一种螺旋藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将钝顶螺旋藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的Z氏培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝9的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期；
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的螺旋藻的培养温度以每36分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃；维持培养温度，处理12h。
将上述步骤培养的螺旋藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。检测其日相对生长速率，测得日相对生长速率(OD)0.210。
实施例2
本实施例为一种盐藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将盐藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的DM培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝7.5的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的盐藻的培养温度以每36分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃；维持培养温度9h。
将上述步骤培养的盐藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。检测其日相对生长速率，测得日相对生长速率(OD)0.168。
实施例3
本实施例为一种小球藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将小球藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的BG-11培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝7.1的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的小球藻的培养温度以每36分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃；维持培养温度3h。
将上述步骤培养的小球藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。检测其日相对生长速率，测得日相对生长速率(OD)0.089。
实施例4
本实施例为一种螺旋藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将钝顶螺旋藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的Z氏培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝9的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的螺旋藻的培养温度以每30分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃，维持培养温度12h；
3)将上述螺旋藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。日相对生长速率(OD)0.179。
实施例5
本实施例为一种螺旋藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将钝顶螺旋藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的Z氏培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝9的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的螺旋藻的培养温度以每42分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃，维持培养温度12h；
3)将上述螺旋藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。日相对生长速率(OD)0.147。
实施例6
本实施例为一种盐藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将杜氏盐藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的Z氏培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝9的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的盐藻的培养温度以每30分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃，维持培养温度9h；
3)将上述盐藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。日相对生长速率(OD)0.129。
对比例1
本对比例为一种螺旋藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将螺旋藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的Z氏培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝9的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在光照条件下，将步骤1)中处于对数生长期的螺旋藻的培养温度以每36分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃；维持所述培养温度12h。
将上述步骤培养的螺旋藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。检测其日相对生长速率，测得日相对生长速率(OD)0.011。
对比例2
本对比例为一种盐藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将盐藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的DM培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝7.5的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的盐藻进行低温处理，调节温度至-5℃，整个低温过程持续12h；
将上述步骤培养的螺旋藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。检测其日相对生长速率，测得
日相对生长速率(OD)0.013。
对比例3
本对比例为一种小球藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将小球藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的BG-11培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝7.1的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在光照条件下，将步骤1)中处于对数生长期的小球培养温度以每36分钟降温1℃的速率匀速降低至0℃，维持培养温度3h；
将上述步骤培养的螺旋藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。检测其日相对生长速率，测得
日相对生长速率(OD)0.039。
对比例4
本对比例为一种螺旋藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将螺旋藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的Z氏培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝9的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)光照条件下，将上述螺旋藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。日相对生长速率(OD)0.077。
对比例5
本实施例为一种螺旋藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将钝顶螺旋藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的Z氏培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝9的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在光照条件下，将步骤1)中处于对数生长期的螺旋藻的培养温度以每36分钟降温1℃的速率匀速降低至0℃，维持培养温度12h；
3)将上述螺旋藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。日相对生长速率(OD)0.019。
对比例6
本实施例为一种小球藻冰温启动补偿生长的方法，包括以下步骤：
1)将小球藻以10ml/L的接种浓度接种到新鲜的Z氏培养基中，在32℃，6000Lux，pH＝9的培养条件下培养2天，使其适应新的生长环境，进入对数生长期。
2)在光照条件下，将步骤1)中处于对数生长期的小球藻的培养温度以每42分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃，维持培养温度12h；
3)将上述小球藻在32℃，6000Lux下继续培养4天。日相对生长速率(OD)0.032。
实施例及对比例的处理参数和日相对生长速率见表1。
表1
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种微藻冰温启动补偿生长的方法，其特征在于，在黑暗条件下，将处于对数生长期的微藻的培养温度匀速降低至0～-10℃，维持所述培养温度1-15h后，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻选自螺旋藻、盐藻或小球藻中一种或多种；
优选地，所述螺旋藻为极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、盐泽螺旋藻中一种；和/或，所述盐藻为杜氏盐藻。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微藻采用如下预培养方式进入对数生长期：将所述微藻接种到培养基中，在温度为26～38℃，照度为5000～30000Lux的条件下进行培养；
优选地，所述微藻为螺旋藻时，接种到pH值为8.25～9.5的Z氏培养基中；
所述微藻为盐藻时，接种到pH值为7.2～7.8的DM培养基中；
所述微藻为小球藻时，接种到pH值为7.0～7.4的BG-11培养基中；
更优选地，所述螺旋藻接种到pH值为8.5～9的Z氏培养基中；
所述盐藻接种到pH值为7.5的DM培养基中；
所述小球藻接种到pH值为7.1的BG-11培养基中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预培养在温度为31～33℃，照度为5000～7000Lux的条件下进行培养。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，调节所述pH值的试剂为磷酸溶液；优选采用浓度为0.1～0.5mol/L的磷酸溶液。
6.根据权利要求3～5任一所述的方法，其特征在于，所述微藻在所述培养基中的接种浓度为8～12ml/L，优选为10ml/L。
7.根据权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，所述培养温度匀速降低的速率为每20～60分钟降温1℃，优选为每30～42分钟降温1℃。
8.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于，所述培养温度匀速降低至0～-7℃，优选为0～-5℃。
9.根据权利要求1～8任一所述的方法，其特征在于，维持所述培养温度的时间为6～15h，优选为9～12h。
10.根据权利要求根据1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将螺旋藻、盐藻或小球藻以8～12ml/L的接种浓度接种到培养基中，在温度为31～33℃，照度为5000～7000Lux的条件下，培养使其进入对数生长期阶段；
其中，
所述螺旋藻接种到pH值为8.25～9.5的Z氏培养基中；
所述盐藻接种到pH值为7.2～7.8的DM培养基中；
所述小球藻接种到pH值为7.0～7.4的BG-11培养基中；
2)在黑暗条件下，将步骤1)中处于对数生长期的螺旋藻、盐藻或小球藻的培养温度以每30～40分钟降温1℃的速率匀速降低至-5℃，维持所述培养温度9-12h后，即可。
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