CN109715832B - 源自丙酸杆菌属的细菌的纳米囊泡及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及源自丙酸杆菌属的细菌的囊泡及其用途。实验证实,通过高脂肪饮食而不是高碳水化合物饮食,源自丙酸杆菌属的细菌的囊泡的产生在体内增加;与正常人相比,患有癌症(如乳腺癌和肝癌)、炎性疾病(如哮喘和特应性皮炎)和代谢性疾病(如糖尿病和肝硬化)的患者的血液中的囊泡显著减少;所述囊泡抑制致病囊泡分泌炎症介质,抑制角质形成细胞凋亡,并且增加体内雄激素受体的表达。预期根据本发明的源自丙酸杆菌属细菌的囊泡有利地用于诊断或预测癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的方法,药物组合物,食品,化妆品等中。
Description
技术领域
本发明涉及源自属于丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的纳米囊泡及其用途,并且更具体地,涉及通过使用源自属于丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的纳米囊泡来诊断癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的方法,以及包含所述纳米囊泡的预防或治疗组合物。
背景技术
在21世纪,过去被认为是流行病的急性传染病的重要性变得不那么重要了。另一方面,伴随由人和微生物菌群(microbiome)的不相容性而发生的免疫功能障碍的慢性疾病,特别是癌症、心血管疾病、慢性肺病、代谢性疾病、神经精神病症等,在21世纪正成为大问题。
众所周知,在人体内共生的微生物数量为100万亿,是人类细胞数的10倍,微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)或微生物菌群(microbiome)指的是微生物群落,其包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物(eukarya),并且已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用,并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。
生活于人体中的细菌分泌纳米级的囊泡,以便与其他细胞交换关于基因、蛋白等的信息。粘膜形成不允许尺寸为200nm或以上的粒子通过的物理阻隔膜,因此共生在粘膜中的细菌不能通过,但源自细菌的囊泡具有大约为100nm或以下的尺寸,因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。吸收到体内的源自病原菌的囊泡已成为炎性疾病,例如,如特应性皮炎等炎症性皮肤病,如慢性鼻炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)等炎症性呼吸道疾病,以及如溃疡性结肠炎、克罗恩病等炎症性肠病的重要因素。此外,最近发现源自致病菌的囊泡与诸如糖尿病、肥胖等代谢性疾病以及诸如肝癌,胃癌,结肠直肠癌等的实体癌的发作密切相关,它们引起了人们的注意。
属于丙酸杆菌属的细菌是厌氧革兰氏阳性杆菌,其特征在于通过转羧酶合成丙酸。已知细菌是与动物(包括人类)共生的细菌,并且不仅在皮肤中共生,而且在胃肠道中也共生。在大多数情况下,细菌不会引起疾病,但众所周知,痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(痤疮细菌)使用皮脂腺分泌的皮脂中存在的脂肪酸作为能量来源,并且是皮肤病(如痤疮)中最重要的致病菌。属于丙酸杆菌属的细菌在工业上用于合成维生素B12、四吡咯化合物和丙酸、益生菌(probiotics)、干酪生产等。迄今为止,尚未报道属于丙酸杆菌属的细菌细胞外分泌囊泡的事实,并且仅对丙酸杆菌在治疗过敏、流感疫苗和胃肠功能障碍中的用途进行了研究,所述丙酸杆菌优选为费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii),其为痤疮丙酸杆菌的同种和异种物种(参见JP 2016-028033和KR10-1459166)。
同时,雄激素受体是与雄性激素(如睾酮、二氢睾酮等)结合并且在肌肉质量和骨密度的增加以及雄性表型(例如毛发生长)的表达和维持中起重要作用的细胞内受体。此外,已知雄性激素通过雄激素受体在预防骨质疏松症、虚弱等方面发挥重要作用。
因此,本发明的发明人证实,与正常人相比,患有癌症、慢性炎性疾病、内分泌疾病和代谢性疾病的患者的血液样品中源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡的量减少,从而基于这些发现完成了本发明。
发明内容
[技术问题]
本发明的发明人首次从属于丙酸杆菌属的细菌中分离出囊泡并确认其特性,从而证实该囊泡可用作预防或治疗癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的组合物。
具体而言,通过宏基因组分析证实,与正常人的相比,源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡的量在源自患有癌症(例如肝癌、乳腺癌等)和炎性或代谢性疾病(例如,特应性皮炎,哮喘,糖尿病,肝硬化等)的患者的样品中显著减少。通过在体外分离源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡并评价其治疗效果,证实囊泡表现出抗炎作用和抑制角质形成细胞死亡的作用,并通过评估囊泡的机制,证实囊泡增加了雄性激素受体的表达,从而基于这些发现完成了本发明。
因此,本发明的目的是提供一种提供用于诊断癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的信息的方法。
本发明的另一个目的是提供用于减轻或治疗癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的组合物,其包含作为活性成分的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡。
然而,本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题,并且对于本领域普通技术人员而言,根据以下描述,其他未提及的技术问题将变得显而易见。
[技术方案]
为了实现本发明的上述目的,本发明提供了一种提供用于诊断癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的信息的方法,该方法包括以下过程:
(a)从囊泡中提取DNA,所述囊泡从源自正常人的样品或源自患者的样品中分离出;
(b)通过使用16S rDNA序列中存在的成对的引物对所提取的DNA进行PCR,以检测源自属于丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡;以及
(c)通过定量分析所述PCR产物判定病例为癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病,在该病例中的源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡量比正常人的低。
在本发明的一实施方案中,所述源自患者的样品可以是血液或尿液。
本发明还提供了一种用于预防或治疗癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的药物组合物,该药物组合物包含作为活性成分的源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡。
在本发明的一实施方案中,属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的所述细菌可以是痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。
在本发明的一实施方案中,所述囊泡的平均直径可以为10nm至1000nm。
在本发明的一实施方案中,所述囊泡可以是从属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌中天然或人工分泌的。
在本发明的另一实施方案中,所述源自患者的样品可以是尿液或血液。
在本发明的另一实施方案中,所述组合物可以是吸入剂。
在本发明的另一实施方案中,所述组合物可以使用包含在源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中的蛋白。
在本发明的另一实施方案中,癌症可以是肝癌或乳腺癌。
在本发明的另一实施方案中,炎性疾病可以是特应性皮炎、哮喘、糖尿病或肝硬化。
在本发明的另一实施方案中,内分泌疾病可以是骨质疏松症、虚弱或脱发。
在本发明的另一实施方案中,代谢性疾病可以是糖尿病或肝硬化。
本发明还提供了一种用于预防或缓解癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的食物组合物,该食物组合物包含作为活性成分的源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡。
本发明还提供了一种用于缓解癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的化妆品组合物,所述化妆品组合物包含作为活性成分的源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡。
本发明还提供了一种预防或治疗癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的方法,该方法包括向个体施用药物组合物,所述药物组合物包含作为活性成分的源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡。
本发明还提供了包含作为活性成分的源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡的药物组合物的用途,所述药物组合物用于预防或治疗癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病。
[有利效果]
本发明的发明人证实,与常规CHO饮食小鼠相比,源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡的量在源自高脂肪饮食小鼠的粪便样品中增加,因此证实了属于丙酸杆菌属的细菌的活性通过脂肪增加。通过宏基因组分析(metagenomic analysis)源自患者血液样品中存在的细菌的囊泡证实,与正常人的相比,源自在患有肝癌、乳腺癌、哮喘、特应性皮炎、糖尿病和肝硬化的患者的血液样品中存在的属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡明显减少。此外,通过实验证实,当将从小鼠体内培养的痤疮丙酸杆菌(其是属于丙酸杆菌属的细菌中的一种)中分离的囊泡施用给小鼠时,***组织中雄激素受体的表达增加,并且观察到,当用囊泡预处理炎性细胞时,囊泡具有抗炎作用和免疫调节作用。因此,预期根据本发明的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡可有效地用于诊断或预测癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的方法,药物组合物,食品,化妆品等中。
附图说明
图1描绘了用于对从喂食常规CHO饮食(RCD)或高脂肪饮食(HFD)的小鼠粪便中分离的囊泡进行宏基因组分析的方案。
图2显示了从喂食常规CHO饮食(RCD)和12周长高脂肪饮食(HFD)的小鼠的粪便中分离的细菌和囊泡的宏基因组分析结果。
图3A示出了显示给小鼠口服给药后肠细菌和细菌来源的囊泡(EV)根据时间的分布模式的图像。
图3B示出了显示口服给药后12小时提取的血液、肾和各种器官中的细菌和囊泡的体内分布模式的评估结果的图像。
图4是说明对源自人体内存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析的方法的示意图。
图5A示出了在对源自肝癌患者以及年龄和性别与患者的年龄和性别匹配的正常人的血液样品中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,比较源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡的分布模式的结果。
图5B示出了在对源自乳腺癌患者以及年龄和性别与患者的年龄和性别匹配的正常人的血液样品中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,比较源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡的分布模式的结果。
图6A示出了在对源自哮喘患者以及年龄和性别与患者的年龄和性别匹配的正常人的血液样品中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,比较源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡的分布模式的结果。
图6B示出了在对源自特应性皮炎患者以及年龄和性别与患者的年龄和性别匹配的正常人的血液样品中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,比较源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡的分布模式的结果。
图7A示出了在对源自糖尿病患者以及年龄和性别与患者的年龄和性别匹配的正常人的血液样品中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,比较源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡的分布模式的结果。
图7B示出了在对源自肝硬化患者以及年龄和性别与患者的年龄和性别匹配的正常人的血液样品中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,比较源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡的分布模式的结果。
图8A是显示从通过体外培养痤疮丙酸杆菌获得的培养液中分离的囊泡形状的观察结果的电子显微镜图像。
图8B示出了通过动态光散射测量从痤疮丙酸杆菌培养溶液中分离的囊泡的大小的结果。
图9A示出了根据细胞组分对通过分析在源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中包含的蛋白组(proteomes)而获得的鉴定蛋白进行分类的结果。
图9B示出了根据功能对通过分析在源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中包含的蛋白组而获得的鉴定蛋白进行分类的结果。
图10A说明在用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡处理巨噬细胞系后测量所述囊泡的凋亡程度的结果。
图10B说明在用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡处理巨噬细胞系后,测量痤疮丙酸杆菌衍生的囊泡的IL-6的分泌的结果,所述IL-6是炎性介质。
图11A示出了当用各种浓度的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡预处理巨噬细胞,并且然后用大肠杆菌囊泡(E.coli EV)处理时评估大肠杆菌囊泡对作为炎性介质的IL-6的分泌的影响的结果,所述大肠杆菌囊泡是致病囊泡。
图11B示出了当用各种浓度的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡预处理巨噬细胞,并且然后用大肠杆菌囊泡(E.coli EV)处理时评估大肠杆菌囊泡对作为炎性介质的TNF-α的分泌的影响的结果,所述大肠杆菌囊泡是致病囊泡。
图12A示出了在用各种浓度的源自金黄色葡萄球菌的囊泡(S.aureus EV)处理皮肤角质形成细胞后,通过源自金黄色葡萄球菌的囊泡(S.aureus EV)评估角质形成细胞的凋亡程度的结果。
图12B示出了在用各种浓度的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡(P.acnes EV)处理皮肤角质形成细胞后,评估源自痤疮丙酸杆菌的囊泡(P.acnes EV)对角质形成细胞的凋亡程度的结果。
图13示出了在用各种浓度的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡(P.acnes EV)预处理,然后用高浓度的源自金黄色葡萄球菌的囊泡(S.aureus EV))处理角质形成细胞后测量角质形成细胞的细胞凋亡的结果,以便评价源自痤疮丙酸杆菌的囊泡对由源自金黄色葡萄球菌的囊泡引起的皮肤死亡的抑制作用,所述源自金黄色葡萄球菌的囊泡是皮肤病的致病囊泡。
图14示出了在将源自痤疮丙酸杆菌的囊泡按4周8次腹膜内施用给小鼠后,通过蛋白印迹评估***组织中雄激素受体的表达模式的结果。
具体实施方式
本发明涉及源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡及其用途。
本发明的发明人通过宏基因组分析证实,与正常人的相比,源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡的量在源自患有癌症(例如肝癌、乳腺癌等),炎性疾病(例如特应性皮炎,哮喘等)以及内分泌或代谢性疾病(例如,糖尿病,肝硬化等)的患者的样品中显著减少,从而基于这些发现完成了本发明。
因此,本发明提供了一种提供用于诊断癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的信息的方法,该方法包括以下过程:
(a)从从源自正常人的样品或源自患者的样品中分离出的囊泡中提取DNA;
(b)通过使用16S rDNA序列中存在的成对的引物对所提取的DNA进行PCR,以检测源自属于丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡;以及
(c)通过定量分析所述PCR产物判定,源自属于所述丙酸杆菌(Propionibacterium)属的细菌的囊泡量比正常人的低的病例为癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病。
本文所用的术语“诊断”在广义上是指在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容包括疾病的名称、疾病的原因、疾病的类型、疾病的严重程度、综合征的详细方面、并发症的存在或不存在、预后等。在本发明中,诊断是指确定癌症、炎性疾病或代谢性疾病、疾病的严重程度等的发病的存在或不存在。
作为本发明的诊断性靶疾病的术语“癌症”是指在渗入到周围组织中时迅速生长并且扩散或转移到身体的每个部位并因此危及生命的恶性肿瘤。作为身体的最小单位的细胞通常通过细胞自身的调节功能***和生长,当细胞寿命结束或细胞受损时,它们自身死亡,从而保持整体细胞数量的平衡。然而,当细胞由于各种原因而具有这种调节功能的问题时,通常会死亡的异常细胞过度增殖并渗入周围组织和器官,从而形成肿块,导致现有结构的破坏或修改。在本发明中,癌症可以是,但不限于,优选肝癌或乳腺癌。
本文所用的术语“炎性疾病”是指由哺乳动物体内的炎症反应引起的疾病,其代表性示例包括呼吸性炎性疾病,如哮喘、慢性阻塞性肺病、鼻炎等;皮肤炎症性疾病,如特应性皮炎、牛皮癣、痤疮、接触性皮炎等;胃肠道炎性疾病,如胃炎、消化道溃疡、炎症性肠病等;和上述疾病的并发症。此外,除了一般的炎性疾病,术语“炎性疾病”还用作包括与炎症反应相关的癌症,例如肺癌、胃癌、结肠直肠癌等。在本发明中,炎性疾病优选为哮喘或特应性皮炎,但本发明不受限于此。
本文所用的术语“内分泌疾病”是指由哺乳动物体内过量或缺乏激素引起的疾病,其示例包括由于过量的***引起的乳腺癌,由于雄性激素减少引起的骨质疏松症、虚弱、脱发等等。在本发明中,内分泌疾病优选包括但不限于骨质疏松症、虚弱或脱发。
本文所用的术语“代谢性疾病”是指由哺乳动物体内的代谢紊乱及其并发症引起的疾病,并且其示例包括由于脂质代谢异常引起的高脂血症,由于碳水化合物代谢异常引起的糖尿病,由于代谢紊乱的并发症而发生的肝硬化等。在本发明中,代谢性疾病优选包括但不限于糖尿病或肝硬化。
本文所用的术语“纳米囊泡”或“囊泡”是指由各种细菌分泌的纳米级膜组成的结构。源自革兰氏阴性细菌的EV或外膜囊泡(OMV)含有脂多糖、有毒蛋白和细菌DNA和RNA,而源自***的EV除了含有蛋白和核酸外,还含有肽聚糖和脂磷壁酸,它们是细菌的细胞壁成分。在本发明中,纳米囊泡或囊泡在属于丙酸杆菌属的细菌中天然分泌或人工产生,并且具有球形形状且平均直径为10nm至1000nm。
可以通过使用选自离心,超速离心,挤出,超声降解,细胞裂解,均质化,冻融,电穿孔,机械降解,化学处理,使用过滤器过滤,凝胶过滤色谱,自由流动电泳和毛细管电泳中的一种或多种方法从含有属于丙酸杆菌属的细菌的培养溶液中分离囊泡。另外,分离方法可以进一步包括洗涤以去除杂质,浓缩获得的囊泡等。
本文所用的术语“宏基因组”("metagenome")涉及包括在诸如粪便、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组,并且主要用作基因组的概念,其解释了使用测序仪一次性鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地,宏基因组不是指一种物种的基因组,而是指基因组的混合物,包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点:当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时,各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上,它是使用快速测序以识别一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题,无论物种如何都如此。
在本发明中,源自患者的样品可以是但不限于血液或尿液。
根据本发明的另一实施方案,提供了用于预防或治疗癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的药物组合物,其包含作为活性成分的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡。
根据本发明的另一实施方案,提供了用于预防或缓解癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的食物组合物,其包含作为活性成分的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡。
根据本发明的又一实施方案,提供了用于缓解癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的化妆品组合物,其包含作为活性成分的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡。
如本文所用的术语“预防”是指通过施用根据本发明的食物、吸入剂或药物组合物抑制癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病或延迟其发作的所有作用。
如本文所用的术语“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物缓解或有益地改变由于癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病引起的症状的所有作用。
本文所用的术语“缓解”是指通过施用根据本发明的食物或化妆品组合物至少降低正在治疗的癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病时所处的病况相关的参数程度的所有作用。
在本发明的一实施方案中,证实与喂食常规CHO饮食的小鼠的粪便相比,来自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡在喂食高脂肪饮食的作为高脂肪饮食动物模型的小鼠的粪便中增加(参见实施例1)。
在本发明的一实施方案中,使用从患有乳腺癌或肝癌的患者和正常人的血液样品中分离的囊泡进行细菌宏基因组分析。结果证实,与正常人的血液样品中的相比,在患有乳腺癌或肝癌的患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见实施例3)。
在本发明的一实施方案中,使用从患有哮喘或特应性皮炎的患者和正常人的血液样品中分离的囊泡进行细菌宏基因组分析。结果证实,与正常人的血液样品中的相比,在患有哮喘或特应性皮炎的患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见实施例4)。
在本发明的一实施方案中,使用从患有糖尿病或肝硬化的患者和正常人的血液样品中分离的囊泡进行细菌宏基因组分析。结果证实,与正常人的血液样品中的相比,在患有糖尿病或肝硬化的患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见实施例5)。
在本发明的另一实施方案中,基于实施例3至5的结果,通过进一步进行研究以分析源自属于痤疮丙酸杆菌属的丙酸杆菌的囊泡的特征,证实了囊泡具有小于200nm的平均直径,优选具有球形,尺寸为37.8±13.5nm(参见实施例6)。
在本发明的另一实施方案中,通过蛋白组学分析鉴定存在于源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中的252种蛋白,并根据细胞组分和蛋白功能对其进行分类(参见实施例7)。
在本发明的另一实施方案中,通过评估从培养的痤疮丙酸杆菌的菌株分离的囊泡对炎症介质分泌的影响,源自痤疮丙酸杆菌的囊泡的在巨噬细胞系中分泌IL-6的能力显著低于属于致病性囊泡的源自大肠杆菌的囊泡(E.coli EV)。此外,通过在巨噬细胞用不同浓度的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡处理,并且然后用大肠杆菌囊泡(其是炎症和代谢性疾病的致病因素)处理后评估炎症介质的分泌,证实源自痤疮丙酸杆菌的囊泡有效地抑制由于源自大肠杆菌的囊泡而导致的IL-6和TNF-α的分泌(参见实施例8)。
在本发明的另一个实施方案中,通过评估从培养的痤疮丙酸杆菌的菌株分离的囊泡对特应性皮炎的治疗的影响,证实当皮肤角质形成细胞在用作为特应性皮炎的重要致病因素的源自金黄色葡萄球菌的囊泡(Staphylococcus aureus EV)处理之前用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡预处理时,源自痤疮丙酸杆菌的囊泡抑制由源自金黄色葡萄球菌的囊泡引起的角质形成细胞的死亡(参见
实施例9)。
在本发明的另一实施方案中,在将源自痤疮丙酸杆菌的囊泡施用于小鼠后,通过分析提取的***组织以评估源自痤疮丙酸杆菌的囊泡对雄性激素受体的表达的影响(这是内分泌疾病的治疗机制之一),证实了在施用囊泡的情况下,雄激素受体的表达在***组织中增加(参见实施例10)。
在下文中,将描述示例性实施例以帮助理解本发明。然而,提供以下实施例仅仅是为了便于理解本发明,而不是为了限制本发明的范围。
[实施例]
实施例1.喂食常规CHO饮食和高脂肪饮食的小鼠的粪便中的细菌和源自细菌的囊
泡的宏基因组分析
根据图1所示的方法,从喂食常规CHO饮食(RCD)12周的正常小鼠和喂食高脂肪饮食(HFD)2个月的小鼠收集粪便从而诱导肥胖。随后,测量收集的小鼠粪便的重量(克)并将其分散在PBS中。为了去除杂质,将每个粪便样品依次以500×g离心5分钟,以3000×g离心5分钟,并以4350rpm离心5分钟以分离上清液,然后以10000×g超速离心20分钟以分离在粪便中包括的细菌。另外,为了分离囊泡,使用0.45μm过滤器过滤细菌已除去的上清液,然后定量蛋白。此后,制备0.8M和2.5M蔗糖垫,并在28500rpm和4℃下2小时超高速离心两次,然后在40200rpm和4℃下超高速离心2小时以获得源自粪便的囊泡,并将得到的囊泡分散在PBS中并保存。
将使用上述方法分离的100μl细菌和囊泡在100℃下煮沸以从脂质中释放内部DNA,然后在冰上冷却5分钟。然后,为了除去剩余的漂浮物质,将所得样品在10000×g和4℃下离心30分钟以仅收集上清液。然后使用Nanodrop定量DNA的量。随后,使用下表1中所示的成对的16S rRNA引物对提取的DNA进行PCR,以确认存在还是不存在源自细菌的DNA,从而证实所提取的DNA中存在源自细菌的基因。
[表格1]
使用上述方法提取的DNA使用所述成对的16S rDNA引物扩增,然后测序(IlluminaMiSeq测序仪),结果以标准流程格式(Standard Flowgram Format:SFF)文件的形式输出,并且通过使用GS FLX软件(v2.9)将SFF文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量评分文件,然后识别读数的可靠性估计,并且将窗(20bps)平均碱基调用精度小于99%(Phred评分<20)的部分去除。对于操作分类单元(OTU)分析,使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类,分别基于94%,90%,85%,80%和75%的序列相似性,对属、科、目、纲和门进行聚类,对属、科、目、纲和门的相应OTU的水平进行分类,并且使用BLASTN和GreenGenes 16SRNA序列数据库(108,453个序列)(QIIME)分析在属水平上具有97%或更高的序列相似性的细菌。
根据上述方法,通过对来自喂食常规CHO饮食和高脂肪饮食12周的小鼠的粪便中的细菌和源自细菌的囊泡进行宏基因组分析,如图2所示,证实在喂食常规CHO饮食的小鼠和喂食高脂肪饮食的小鼠之间,在属于丙酸杆菌属的细菌分布方面没有差异,而喂食高脂肪饮食的小鼠的粪便中的源自丙酸杆菌的囊泡(EV)的分布与喂食常规CHO饮食的小鼠的相比显著增加。
实施例2.肠细菌和源自细菌的囊泡的体内吸收、分布和***模式的分析
使用以下方法进行实验以评估肠细菌和源自细菌的囊泡是否通过胃肠道被全身吸收。将用荧光标记的肠细菌和源自肠细菌的囊泡以50μg的剂量施用于小鼠的胃肠道,并在0分钟、5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。
作为观察小鼠的整个图像的结果,如图3A所示,虽然细菌未被全身吸收,但源自细菌的囊泡在施用后5分钟被全身吸收,在施用后30分钟在膀胱中观察到强荧光,从而证实囊泡被***到泌尿道中。此外,证实囊泡存在于体内直至12小时。
为了评价肠道细菌和源自肠道细菌的囊泡在被全身吸收后进入各种器官的渗入模式,使用上述方法施用50μg用荧光标记的细菌和源自细菌的囊泡,然后在施用后12小时收集血液、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉。
作为观察收集的组织中的荧光的结果,如图3B所示,可以看出,源自细菌的囊泡分布在血液、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪、肌肉和肾脏中,而细菌未被吸收。
实施例3.来自正常人和患有乳腺癌或肝癌的患者的血液样品中的源自细菌的囊
泡的宏基因组分析
首先,为了从患者和正常人的血液样品中分离囊泡,将血液离心(3500×g,10分钟,4℃)以沉淀漂浮物质,仅将上清液转移到新的10ml管中。使用0.22μm过滤器从中除去细菌和杂质,然后将得到的上清液转移到离心过滤器(50kD)中,在1500×g和4℃下离心15分钟以除去尺寸小于50kD的材料,浓缩至10毫升。使用0.22μm过滤器再次从中除去细菌和杂质,然后使用90ti型转子在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时以除去上清液,并将附聚的沉淀物用生理盐水溶解(PBS)。
通过使用上述方法,从96名乳腺癌患者和作为对照的性别以及年龄与患者的性别和年龄相匹配的191名正常人的血液样品;以及91名患有肝癌的患者和作为对照的性别以及年龄与患者的性别和年龄相匹配的99名正常人的血液样品中存在的囊泡中提取基因。
作为在使用实施例1的方法对源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,评价所述囊泡的分布的结果,如图5A所示,证实与正常人的血液样品中的相比,在乳腺癌患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著降低(正常人的与患乳腺癌患者的比为:2.2%比0.5%;倍数变化为:0.23;p<0.000001)。
另外,如图5B所示,与正常人的血液样品中的相比,证实源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡在肝癌患者的血液样品中显著降低(正常人的与肝癌患者的比为:1.7%比0.6%;倍数变化:0.34,p=0.000001)。
实施例4.正常人和患有哮喘或特应性皮炎的患者的血液样品中的源自细菌的囊
泡的宏基因组分析
通过使用实施例3的方法,从277名哮喘患者和作为对照的246名正常人的血液样品中存在的囊泡中提取基因。作为在使用实施例1的方法对源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,评价所述囊泡的分布的结果,如图6A所示,证实与正常人的血液样品中的相比,在哮喘患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著降低(正常人的与哮喘患者的比为:1.8%比0.2%;倍数变化为:0.12;p<0.000001)。
通过使用实施例3的方法,从25名特应性皮炎患者和作为对照的138名正常人的血液样品中存在的囊泡中提取基因。作为在使用实施例1的方法对源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,评价所述囊泡的分布的结果,如图6B所示,证实与正常人的血液样品中的相比,在特应性皮炎患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著降低(正常人的与特应性皮炎患者的比为:0.7%比0.1%;倍数变化为:0.15;p<0.000003)。
实施例5.正常人和患有糖尿病或肝硬化的患者的血液样品中的源自细菌的囊泡
的宏基因组分析
通过使用实施例3的方法,从73名糖尿病患者和作为对照的146名正常人的血液样品中存在的囊泡中提取基因。作为在使用实施例1的方法对源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,评价所述囊泡的分布的结果,如图7A所示,证实与正常人的血液样品中的相比,在糖尿病患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著降低(正常人的与糖尿病患者的比为:1.3%比0.01%;倍数变化为:0.01;p<0.000001)。
通过使用实施例3的方法,从100名肝硬化患者和作为对照的100名正常人的血液样品中存在的囊泡中提取基因。作为在使用实施例1的方法对源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡进行宏基因组分析后,评价所述囊泡的分布的结果,如图7B所示,证实与正常人的血液样品中的相比,在肝硬化患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著降低(正常人的与肝硬化患者的比为:1.4%比0.5%;倍数变化为:0.4;p<0.00004)。
实施例6.从痤疮丙酸杆菌培养液中分离囊泡并且分析其特征
基于实施例3至5的结果,培养痤疮丙酸杆菌菌株,然后从中分离囊泡,并分析囊泡的特征。将痤疮丙酸杆菌6919菌株在脑心浸液(BHI)培养基中在37℃的厌氧室中培养直至吸光度(OD600)达到1.0至1.5,然后进行传代培养。随后,收集无痤疮丙酸杆菌6919菌株培养基上清液,并在10,000×g和4℃下离心15分钟,使用0.45μm过滤器过滤所得上清液,然后通过使用QuixStand台式***(GE Healthcare,UK)并使用100kDa中空过滤膜通过超滤浓缩至200ml体积。此后,将浓缩的上清液再次用0.22μm过滤器过滤,并将过滤的上清液在150,000×g和4℃下超速离心3小时,然后将沉淀物用DPBS悬浮。接下来,使用10%、40%和50%的OptiPrep溶液(Axis-Shield PoC AS,挪威)进行密度梯度离心,并用HEPES缓冲盐水(20mMHEPES,150mM NaCl,pH7.4)稀释OptiPrep溶液,以制备低密度溶液。在200,000×g和4℃下离心2小时后,将从上层以相同体积1ml分离的每种溶液在150,000×g和4℃下进一步超速离心3小时。此后,使用BCA测定法定量蛋白,并对获得的囊泡进行以下实验。
从根据上述方法培养的痤疮丙酸杆菌培养液中分离出囊泡,然后使用电子显微镜评估其形状和大小。
结果,如图8A所示,观察到从痤疮丙酸杆菌培养液中分离的囊泡是球形的并且具有小于200nm的尺寸,并且通过图8B中所示的动态光散射测量结果证实:囊泡的尺寸为37.8±13.5nm。
实施例7.源自痤疮丙酸杆菌的囊泡的蛋白组学分析
进行蛋白组学分析以确定哪种蛋白包含在源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中。为此,通过助滤剂样品制备(FASP)消化方法获得用胰蛋白酶消化的肽。将从源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中提取的18μg蛋白与还原溶液(在0.1M Tris-HCl中的4%SDS和0.1M DTT,pH 7.6)混合,然后使其在37℃下反应45分钟。然后将所得溶液煮沸7分钟,然后基于14,000×g和16℃离心40分钟过滤。另外,将滤液与UA溶液(在0.1M Tris-HCl中的0.2mL的8M尿素,pH8.5中)混合,并反复进行基于离心的过滤三次,然后将0.1ml的55mM IAA溶液加入其中,以使反应在室温下在暗室中进行20分钟,然后离心40分钟。类似地,将样品与UA溶液混合并对其重复进行基于离心的过滤三次,然后用0.2ml的100mM TEAB溶液稀释并再离心两次以进行溶液交换胰蛋白酶的处理。将过滤器置于1.5ml管中,将含有高纯度胰蛋白酶的100mM TEAB溶液在过滤器中于37℃分解12小时,然后在14,000×g和16℃下离心20分钟,然后将向其中加入75μl的100mM TEAB溶液的过程重复两次。将收集的样品用SpeedVac浓缩器干燥,然后溶解在180μl的5%ACN溶解的溶液(0.1%甲酸溶解的蒸馏水作为溶剂)中并用C-18旋转柱(ThermoScientific,美国)净化,然后真空干燥。
用连接至EASY nLC1000(Thermo Fisher Scientific,德国)的Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific,德国),使用纳米LC-ESI-MS/MS方法分析干燥的样品。将用胰蛋白酶切割的肽加载到填充有C18 3-μm树脂的捕获柱(75μm×2cm)上,然后使用5%-40%线性浓度梯度的B溶剂以300nl/分钟的速率洗脱85分钟。通过填充有C18 2-μm树脂的分析柱(75μm×50cm)分离洗脱的肽,然后在2.0kV下电喷雾至纳米ESI源。使用前10个数据依赖方法操作Q Exactive质谱仪。通过将归一化的碰撞能量设定为30%并将动态排除时间设定为30秒且使用测量扫描(m/z;400-2000)来选择最丰富的前体离子以进行更高能量的碰撞解离分离。通过将HCD光谱分辨率设置为17500,使用Orbitrap分析仪以70000的分辨率获得全MS扫描(Survey MS scans)。
使用SEQUEST引擎工具(Bioworks-Browser rev.3.1结合渗滤器验证)在痤疮丙酸杆菌Uniprot数据库(2015.11.综述)中搜索在三次重复中获得的质谱(MS/MS)光谱。在完全胰蛋白酶特异性中包括最多两个错过的裂解位点,并且前体离子和碎片离子的质量耐受性设定为10ppm和0.6Da。脲基甲基半胱氨酸的修饰是固定的,并且允许甲硫氨酸氧化的各种修饰。以FDR=0.01的截断值筛选肽。
结果,如图9A和9B所示,在源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中分析的蛋白中,通过选择在三次重复中被检测两次或更多次的高度可靠的蛋白,最终发现总共252种蛋白。痤疮丙酸杆菌的蛋白组研究尚未进行过许多,因此超过一半的分析蛋白的特征尚不清楚。分析根据细胞组分分析的蛋白的分布比例得到:膜相关蛋白为27.4%,细胞质蛋白为7.1%,细胞外蛋白为1.2%,并且脂质体蛋白为4.4%。这意味着源自痤疮丙酸杆菌的囊泡也被包围在膜中并且包括细胞质和细胞外蛋白,如同通常已知的源自细菌的囊泡。此外,当根据生物学功能基于分布比例对蛋白进行分类时,分析所述蛋白得到:15.9%用于代谢,7.5%用于物质转运,5.2%用于蛋白加工,4.8%用于翻译,4%用于致病性。根据源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中的蛋白在代谢和物质转运中以非常高的速率构成的特征,预期源自痤疮丙酸杆菌的囊泡在痤疮丙酸杆菌的代谢和物质转运中起重要作用。
从通过蛋白组学分析结果揭示的252种蛋白的功能可以看出,源自痤疮丙酸杆菌的囊泡在痤疮丙酸杆菌的生化生活方式、存活***、细胞粘附、致病性、炎症等方面显示出显著的特征。
在源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中的蛋白中,存在与氧化磷酸化(细胞色素c氧化酶,Rieske结构域蛋白)、氮固化(细菌细胞色素泛醇氧化酶,细胞色素泛醇氧化酶)、无氧呼吸(琥珀酸脱氢酶,甲基丙二酰-CoA变异酶)以及底物摄入(ATP结合盒)相关的蛋白,这与痤疮丙酸杆菌是非需氧和厌氧并且具有非运动生活方式的事实一致。另外,在源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中的蛋白中,相当多的蛋白具有与转录、翻译、蛋白转运和蛋白折叠相关的功能。由此可以预期,源自痤疮丙酸杆菌的囊泡具有诸如生物化学处理相关和能量代谢相关物质或蛋白的细胞间转运的功能,并且作为用于运输营养物而不是非运动性痤疮丙酸杆菌的大型转运蛋白起作用。
另外,根据结合细菌肽聚糖层或对青霉素具有抗性的蛋白,例如转糖基酶,β-内酰胺酶,多模式转肽酶-转糖基酶,FtsI等,可以预期痤疮丙酸杆菌在存在各种类型细菌的环境中存活,并使用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡在感染区域表现出抗生素抗性。
根据在粘附于细胞或形成生物膜中起关键作用的蛋白,例如与宿主的硫酸皮肤素结合以显示免疫力的推定的未表征的蛋白(PPA2127),与宿主的表皮细胞结合以形成生物膜的推定的糖基转移酶,粘附于细胞以通过糖基化表现出致病性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),结合表皮细胞并避免受损宿主对溶菌酶的免疫应答的多糖脱乙酰酶等,可以预期痤疮丙酸杆菌能够通过使用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡形成生态位(biological niche)。
根据蛋白,如降解宿主的细胞外基质以诱导在炎症细胞中的免疫反应的透明质酸裂解酶,裂解细胞表面的鞘糖脂且防止信号转导的神经酰胺糖内切酶,使用源自宿主细胞的底物作为代谢物的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶H,渗入到宿主中并通过穿孔破坏细胞以表现出强致病性的克里斯蒂-阿特金斯-蒙克-彼得森(CAMP)因子(Christie-Atkins-Munch-Peterson(CAMP)factors)等,可以预期源自痤疮丙酸杆菌的囊泡被有效地递送到细胞中。
据报道,NlpC/P60内肽酶家族蛋白、碱性膜蛋白、60kDa伴侣蛋白、10kDa伴侣蛋白等是痤疮丙酸杆菌存活的必需蛋白,并在渗入到宿主中时通过其防御机制表现出对炎症细胞的免疫应答。从这些事实可以看出,源自痤疮丙酸杆菌的囊泡可以通过使用源自痤疮丙酸杆菌的蛋白刺激宿主的免疫应答而用于免疫调节。
通过对源自痤疮丙酸杆菌的囊泡进行蛋白组学分析鉴定的蛋白示于下表2中。
[表2]
实施例8.源自痤疮丙酸杆菌的囊泡的抗炎作用
为了检查源自痤疮丙酸杆菌的囊泡对炎症细胞中炎症介质的分泌的影响,用不同浓度(0.001,0.01,0.1,1或10μg/ml)的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡(P.acnes EV)处理Raw264.7细胞,其属于一种小鼠巨噬细胞系,然后通过细胞凋亡和ELISA(R&D***,美国)测量炎症介质(IL-6,TNF-α等)的分泌量。更具体地,将Raw 264.7细胞以1×105个细胞/孔的密度分配到24孔细胞培养板中,然后在DMEM完全培养基中培养24小时。随后,通过MTT测定(Sigman,美国)评估细胞凋亡。此外,为了评估其分泌炎症介质的能力,除去培养基并将源自痤疮丙酸杆菌的囊泡与新的DMEM完全培养基混合并用该新的DMEM完全培养基处理,然后在37℃的培养箱中培养6小时至24小时,以获得培养上清液。将培养上清液收集在1.5ml管中,以3,000×g离心5分钟,收集上清液并在4℃下保存,然后进行ELISA分析。
对于ELISA分析,用PBS稀释捕获抗体,并按照操作浓度将稀释的溶液以50μl等分试样分配到96孔聚苯乙烯板中,然后使其在4℃下反应过夜。随后,用100μl的PBST(含0.05%Tween-20的PBS)溶液洗涤样品两次,然后将RD(含1%BSA的PBST)溶液以100μl等分试样分配到板中,接着在室温下封闭1小时并再次用100μl的PBST洗涤两次,然后根据浓度以50μl等分试样分配样品和标准品,并使其在室温下反应2小时。将样品和标准品再次用100μl的PBST洗涤两次,然后用RD稀释检测抗体,并将稀释的溶液按照操作浓度分配到50μl等分试样中并使其在室温下反应2小时。将样品和标准品再次用100μl的PBST洗涤两次,然后将链霉亲和素HRP(Strpetavidin-HRP)在RD中稀释至1/200,并将稀释的溶液以50μl等分试样分配,且使其在室温下反应30分钟。最后,用100μl的PBST洗涤样品和标准品三次,然后以50μl等分试样分配通过以1:1的比例混合TMB底物和0.04%氧化水制备的溶液。此后,等待显色,并且当在5分钟至20分钟后显色时,以50μl等分试样分配1M的硫酸溶液,停止反应,并使用SynergyTMHT多功能检测酶标仪(BioTek,美国)测量450nm处的吸光度。
结果,如图10A所示,无论源自痤疮丙酸杆菌的囊泡的处理浓度如何,都未诱导炎症细胞的凋亡。
另外,如图10B所示,证实与作为致病囊泡的大肠杆菌囊泡(E.coliEV)的相比,通过用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡处理的巨噬细胞炎症介质的分泌显著减少。
从这些结果确认,源自痤疮丙酸杆菌的囊泡在被吸收到体内时更加安全。
为了基于上述结果评价源自痤疮丙酸杆菌的囊泡的抗炎作用,将不同浓度的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡施用于巨噬细胞系,12小时后,用源自大肠杆菌的囊泡(浓度为1μg/ml)处理,然后通过ELISA测量由源自大肠杆菌的囊泡引起的炎性细胞因子的分泌。
结果,如图11A和11B所示,证实了在用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡预处理的情况下,显著抑制了由源自大肠杆菌的囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌。这意味着源自痤疮丙酸杆菌的囊泡能够有效地抑制由诸如源自大肠杆菌的囊泡等致病囊泡诱导的诸如哮喘等炎性疾病和诸如糖尿病等代谢性疾病。
实施例9.源自痤疮丙酸杆菌的囊泡对由源自金黄色葡萄球菌的囊泡引起的皮肤
角质形成细胞凋亡的抗细胞凋亡作用
为了评价源自痤疮丙酸杆菌的囊泡对由源自金黄色葡萄球菌的囊泡引起的皮肤上皮细胞的凋亡的抑制作用,使用角质形成细胞系(HaCaT细胞)代替巨噬细胞进行与实施例8中使用的预处理过程相同的预处理过程,然后用源自金黄色葡萄球菌的囊泡或源自痤疮丙酸杆菌的囊泡处理经预处理的角质形成细胞系24小时,然后进行MTT测定(Sigman,美国)。
结果,如图12A和12B所示,证实与源自金黄色葡萄球菌的囊泡相比,源自痤疮丙酸杆菌的囊泡显著减少了角质形成细胞的凋亡。
为了基于上述结果评价源自痤疮丙酸杆菌的囊泡对由源自金黄色葡萄球菌的囊泡引起的皮肤角质形成细胞的凋亡的抑制作用,向角质形成细胞系施用不同浓度的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡,12小时之后,用源自金黄色葡萄球菌的囊泡(浓度为100μg/ml)处理,然后进行MTT测定(Sigman,美国)。
结果,如图13所示,证实了在用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡预处理的情况下,抑制了由源自金黄色葡萄球菌的囊泡引起的角质形成细胞的凋亡。这意味着源自痤疮丙酸杆菌的囊泡能够有效地抑制由诸如源自金黄色葡萄球菌等致病囊泡诱导的皮肤病。
实施例10.源自痤疮丙酸杆菌的囊泡对雄激素受体的表达的影响
通过实施例3和5证实,与正常人的相比,在乳腺癌或特应性皮炎患者的血液样品中的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡显著减少,因此用于特应性皮炎、乳腺癌等的所述囊泡的治疗机制被特别检查了。为此,如图14所描绘的,用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡处理6周龄的雄性C57BL/6小鼠,以评估雄性激素受体在小鼠***组织中的表达。将1μg源自痤疮丙酸杆菌的囊泡(PaEV)腹膜内注射到实验组中,每组包括3只小鼠,每周两次,共4周,将PBS或1μg肽聚糖(PGN)和1μg脂磷壁酸(LTA)(其是源自痤疮丙酸杆菌的囊泡的众所周知的抗原)每周两次腹膜内注射到对照中,总共4周。最后一次注射后3天,提取***组织并研磨以获得上清液,并通过蛋白印迹检测雄激素受体(AR)的表达模式。
对于蛋白印迹分析,将提取的小鼠***组织转移至1.5ml管中,然后在液氮中快速冷却。随后,向其中加入裂解溶液,并加入珠子以用Tissuelyser II(Qiagen,德国)研磨组织。将研磨的组织溶液转移到新的1.5ml管中,并在17000×g和4℃下离心15分钟以获得上清液,并将该过程重复两次。使用BCA分析方法定量上清液的蛋白。将150μg蛋白样品与上样溶液混合,并在4%积层凝胶(stacking gel)和7.5%分离凝胶中在160V下进行SDS-PAGE1小时,然后将PA凝胶转移至在400mA下在冰桶中的100%乙醇内激活5分钟的PVDF膜中,持续50分钟。将转移的PVDF膜在RD溶液(含有5%脱脂乳的TBS-T)中在室温下振荡孵育40分钟。随后,用TBS-T将所得PVDF膜洗涤三次,持续30分钟,然后用RD将用于雄激素受体的一抗稀释至1/4000,然后在室温下振荡孵育1.5小时。将得到的PVDF膜用TBS-T洗涤三次,持续30分钟,然后用RD将二抗稀释至1/4000,然后在室温下振荡孵育1.5小时。将得到的PVDF膜用TBS-T洗涤三次,持续30分钟,然后用蒸馏水将ECL毫微微(femto)底物(ThermoScientific,USA)稀释至1/10以喷雾到PVDF膜上,并且Western图像为使用LAS-4000设备(GE Healthcare,UK)获得。β-肌动蛋白的Western图像用作对照。
结果,如图14所示,证实了与肽聚糖(PGN)和脂磷壁酸(LTA)(众所周知的抗原)不同,当施用源自痤疮丙酸杆菌的囊泡时,雄激素受体在***组织中过表达。可以从以下现象中看出源自痤疮丙酸杆菌的囊泡通过增加雄激素受体表达来表现出治疗功效(这是一种治疗机制):雄激素受体被刺激用于治疗乳腺癌,并且在发育期期间,当雄激素受体的表达增加时,特应性皮炎减轻。此外,可以预期雄激素受体的过表达是由源自痤疮丙酸杆菌的囊泡中的蛋白组分引起的,而不是非蛋白组分(如PGN和LTA)引起的。
提供本发明的前述描述仅用于说明目的,并且本发明所属领域的普通技术人员应理解,本发明可以在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下以其他特定形式容易地修改。因此,上述实施方式应被解释为仅出于说明性目的而提供,而不是出于限制的目的。
[工业适用性]
根据本发明的源自属于丙酸杆菌属的细菌的囊泡增加***组织中雄激素受体的表达,并且当用其预处理炎性细胞时具有抗炎作用和免疫调节作用,因此预期所述囊泡可有效地用于诊断或预测癌症、炎性疾病、内分泌疾病或代谢性疾病的方法,药物组合物,食品,化妆品等中。
<110> MD保健株式会社(MD Healthcare Inc.)
<120> 源自丙酸杆菌属的细菌的纳米囊泡及其用途(Nanovesicles derivedfrom Propionibacterium acnes and Use thereof)
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Claims (6)
1.一种用于预防或治疗选自乳腺癌、特应性皮炎和哮喘的疾病的药物组合物,该药物组合物包含作为活性成分的源自痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的囊泡。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述囊泡是从痤疮丙酸杆菌天然或人工分泌的。
3.根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述组合物是吸入剂。
4.一种药物组合物在制备用于预防或治疗选自乳腺癌、特应性皮炎和哮喘的疾病的药剂中的用途,该药物组合物包含作为活性成分的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡。
5.一种用于预防或缓解选自乳腺癌、特应性皮炎和哮喘的疾病的食物组合物,该食物组合物包含作为活性成分的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡。
6.一种用于预防或缓解选自乳腺癌、特应性皮炎和哮喘的疾病的化妆品组合物,该化妆品组合物包含作为活性成分的源自痤疮丙酸杆菌的囊泡。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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