CN109694484B

CN109694484B - 一种免疫佐剂及其制备方法

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Publication number: CN109694484B
Application number: CN201811224649.6A
Authority: CN
Inventors: 巩长旸; 吴秦洁; 何涛; 魏于全
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109694484A

Abstract

本发明公开了一种免疫佐剂及其制备方法。本发明羧甲基壳聚糖‑多醛基甘露聚糖水凝胶，是通过高碘酸钠氧化法合成了多醛基甘露聚糖，其能与羧甲基壳聚糖通过Schiff碱反应交联形成水凝胶OX‑M/NOCC。OX‑M/NOCC水凝胶作为佐剂用于体内抗原递送具有可注射、低毒性的优点，同时，OX‑M/NOCC水凝胶具有“抗原储存库”效应，可促进DC对抗原的摄取。与铝佐剂相比，OX‑M/NOCC水凝胶联合蛋白疫苗增加了抗原在***中的聚集，延长作用时间，并在免疫小鼠后引发强烈的抗原特异性体液免疫应答。结果表明OX‑M/NOCC水凝胶是一种潜在的新型疫苗佐剂。

Description

一种免疫佐剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫佐剂及其制备方法，具体为一种基于天然多糖水凝胶的免疫佐剂及其制备方法。

背景技术

随着生命科学技术的快速发展，涌现出多种新型疫苗，这些疫苗抗原特异性良好，安全性较高，但抗原分子量小、纯化程度高，导致免疫原性较差。免疫佐剂，又称为非特异免疫增强剂，能够提高抗原的免疫原性，增强机体的自我保护能力：包括刺激机体产生功能上合适类型的免疫反应；增加记忆细胞特别是记忆T细胞的产生；增加初始免疫反应的速度以及改变免疫反应的宽度，特异性或亲和力等等。近年来，国内外学者对适用于新型疫苗的免疫佐剂进行了大量的基础与临床研究，并取得了较大进展。尽管已有多种新型佐剂进入临床研究，但对于人用疫苗佐剂来说，安全性要求十分严格，只有极少数佐剂获准使用。因此，研制安全高效的免疫佐剂仍然是目前面临的重大挑战。

铝盐佐剂和弗氏佐剂是目前被广泛使用的免疫佐剂。其中弗氏佐剂联合蛋白抗原可以有效刺激浆细胞产生抗体，激发Th1和Th17细胞免疫反应，但是弗氏佐剂中的矿物油不能被机体代谢，容易引起注射部位炎症反应、肉芽肿和溃疡等副作用，因此该佐剂不能用于人类疫苗。铝盐佐剂因为其抗原储存库效应，上调MHC II类分子表达并促进抗原提呈，诱导Th2免疫应答等作用已得到广泛使用，但是铝盐佐剂不能冻干，制备的佐剂批次间差异大，难以控制质量。因此，既能增强机体免疫反应，又具有较低毒副作用的新型免疫佐剂亟待开发。

水凝胶是目前得到广泛研究的一类材料，它具有生物相容性，生物可降解性，设计灵活等特点，并且构成水凝胶基本原料的选择范围也比较宽广。多种材料(葡聚糖，明胶，透明质酸，壳聚糖，多肽等)和交联技术(Schiff碱反应，Michael加成，自组装，物理条件改变等)已经被研究用来设计不同孔隙率和机械强度的水凝胶。水凝胶不溶于水但能够在水性介质中膨胀形成三维网状结构，较高的溶胀比也使得水凝胶对氧气，营养物和代谢物是可渗透的。

树突状细胞是机体内最有效的抗原呈递细胞，对于产生有效的保护性免疫反应具有关键的作用。被DC摄取后，抗原在胞内的定位和加工过程显著影响着免疫应答的强度和质量。已有研究表明，未成熟的DC细胞表面高表达甘露糖受体(Mannose receptor,MR)，并且MR在DC细胞对抗原的摄取，加工，呈递以及引发下游免疫反应中发挥着至关重要的作用。已有研究者将甘露聚糖和抗原通过化学作用结合后，通过MR介导的内吞显著促进DC细胞对抗原的摄取，增强了MHC II限制性抗原特异T细胞反应。

壳聚糖是一种天然多糖类阳离子高分子材料，是一种氨基葡萄糖与N-乙酰葡萄糖胺的聚合物。壳聚糖具有良好的生物相溶性和生物可降解性，低毒性，低免疫原性和易修饰性，已经作为药物载体得到广泛应用。壳聚糖在水中溶解度低，仅能在酸性条件下溶解。为了克服低溶解性的特点，不同的壳聚糖衍生物被合成出来用于提高疫苗的免疫效果，例如N-三甲基壳聚糖氯盐，羧甲基壳聚糖和三甲基壳聚糖等等。这些壳聚糖衍生物溶解性好，能够在生理条件下产生较好的吸收促进作用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种免疫佐剂及其制备方法，具体为一种基于天然多糖水凝胶的免疫佐剂及其制备方法。

本发明提供了羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶，它是由羧甲基壳聚糖与多醛基甘露聚糖交联制得。

上述羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶，它是由如下方法制备得到：将羧甲基壳聚糖溶液与多醛基甘露聚糖溶液混匀，得羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖溶液与多醛基甘露聚糖溶液的体积比为1:3～3：1，优选为1:1。

进一步地，所述多醛基甘露聚糖的氧化度为7.66％～45.33％。

优选地，所述多醛基甘露聚糖的氧化度为13.41％～45.33％。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为10～30mg/mL；所述羧甲基壳聚糖溶液的溶剂为生理盐水。

优选地，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为15～30mg/mL，优选为20～30mg/mL。

进一步地，所述多醛基甘露聚糖溶液的浓度为10～30mg/mL，所述多醛基甘露聚糖的溶剂为生理盐水。

优选地，所述多醛基甘露聚糖溶液的浓度为为15～30mg/mL，优选为20～30mg/mL。

进一步地，所述混匀的温度为25℃。

进一步地，所述混匀的时间为0～527s。

优选地，所述混匀的时间为100～210s。

进一步地，所述多醛基甘露聚糖的制备方法为：将甘露聚糖溶于磷酸盐缓冲液中，形成均匀溶液，将NaIO₄加入溶液中，25℃条件下，避光反应12小时，终止反应，透析，即得。

进一步地，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0。

进一步地，所述甘露聚糖与磷酸盐缓冲液的质量体积比为1：50g/mL。

进一步地，所述NaIO₄与甘露聚糖单体单元的摩尔比为1:10～3:5。

进一步地，所述终止反应是利用乙二醇终止反应。

进一步地，所述透析使用的透析袋的截留分子量为3500。

上述羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶作为免疫佐剂的用途。

本发明提供了一种免疫佐剂，它是以羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶为有效成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。

本发明所成生理盐水是指质量分数为0.9％的NaCl的水溶液。

本发明中，OX-M代表多醛基甘露聚糖；NOCC代表羧甲基壳聚糖。

本发明的有益效果：本发明制备了一种免疫佐剂，有效成分为羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶。通过高碘酸钠氧化法合成了多醛基甘露聚糖(OX-M)，其能与羧甲基壳聚糖(NOCC)通过Schiff碱反应交联形成水凝胶OX-M/NOCC。OX-M/NOCC水凝胶作为佐剂用于体内抗原递送具有可注射、低毒性的优点，同时，OX-M/NOCC水凝胶具有“抗原储存库”效应，可促进DC对抗原的摄取。与铝佐剂相比，OX-M/NOCC水凝胶联合蛋白疫苗增加了抗原在***中的聚集，延长作用时间，并在免疫小鼠后引发强烈的抗原特异性体液免疫应答。结果表明OX-M/NOCC水凝胶是一种潜在的新型疫苗佐剂。并且，相较于多醛基甘露聚糖(OX-M)、羧甲基壳聚糖(NOCC)，OX-M/NOCC水凝胶作为免疫佐剂，具有能够引发更强烈的抗原特异性体液免疫应答、促进DC对抗原的摄取等优势。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为多醛基甘露聚糖的合成以及水凝胶的制备，(A)多醛基甘露聚糖的合成；(B)水凝胶的制备示意图；

图2为红外光谱图与X射线衍射分析，(A)甘露聚糖(Mannan)，多醛基甘露聚糖(OX-M)，羧甲基壳聚糖(NOCC)以及OX-M/NOCC交联水凝胶的红外光谱图；(B)NOCC，理论氧化度20％的OX-M，及其形成的交联水凝胶XRD图；(C)不同理论氧化度的甘露聚糖(2％，w/v)与NOCC(2％，w/v)交联形成的水凝胶XRD图；

图3为OX-M/NOCC水凝胶的流变分析，扫描电镜以及光学图片，(A)OX-M(2％，w/v)和NOCC(2％，w/v)形成交联水凝胶过程中储能模量(G')和损耗模量(G")随时间的变化曲线。G'和G"曲线交点对应时间为机械凝胶形成的时间点；(B)OX-M/NOCC交联水凝胶的扫描电镜图片(100×)；(C)OX-M(2％，w/v)，NOCC(2％，w/v)及其形成的交联水凝胶光学图；

图4为OX-M，NOCC以及OX-M/NOCC水凝胶浸提液的MTT细胞毒性检测，(A)OX-M和NOCC处理3T3细胞48h后，MTT检测细胞存活率；(B)OX-M和NOCC处理L929细胞48h后，MTT检测细胞存活率；(C)不同浓度OX-M/NOCC水凝胶浸提液分别处理3T3和L929细胞48h后，MTT检测细胞存活率；

图5为OX-M/NOCC水凝胶的抗原库效应，Balb/c小鼠分别注射OX-M/NOCC水凝胶与FITC-OVA疫苗***，以及注射大剂量FITC-OVA后，在不同的时间点具有代表性的小鼠活体荧光成像图(A)；在各个时间点，注射部位荧光强度占初始荧光强度的百分比(B)，每个时间点每组3只Balb/c小鼠(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)；

图6为OX-M/NOCC水凝胶对于骨髓来源树突状细胞(BMDCs)摄取OVA抗原的影响，BMDC分别与水溶性OVA-FITC(OF)和Hydrogel/OVA-FITC(HOF)在37℃(A)和4℃(B)条件下孵育2h，4h后，流式检测OVA-FITC阳性细胞比例；(C)BMDC与水溶性OVA-FITC和Hydrogel/OVA-FITC在37℃条件下孵育4h后，激光共聚焦显微镜观察抗原胞内定位，(*p<0.05)；

图7为OX-M/NOCC水凝胶促进体液免疫中抗原特异性抗体的产生。各组小鼠免疫后随时间变化，血清中抗原特异性抗体检测：(A)IgG，(B)IgG1，(C)IgG2b。(*p<0.05,**p<0.01表示Hydrogel组与OVA组的统计学差异；^#p<0.05表示Hydrogel组与Alum组之间的统计学差异)。

图8为NOCC和OX-M/NOCC水凝胶促进体液免疫中抗原特异性抗体滴度产生折线图。(A)IgG，(B)IgG1，(C)IgG2b。(*p<0.05,**p<0.01表示Hydrogel组与NOCC组的统计学差异)。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1 OX-M的制备

分别称取1.0g甘露聚糖溶于50mL、pH＝6.0的磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌溶解形成均匀溶液，再将130mg，260mg，520mg和780mg NaIO₄分别加入甘露聚糖溶液中(使NaIO₄与甘露聚糖单体单元的摩尔比为1:10，1:5，2:5和3:5)，25℃条件下，避光搅拌12小时；用0.5mL乙二醇终止反应，1小时后将溶液转移至截留分子量为3500的透析袋中，并在双蒸水中透析三天，每天换水3次，除去未反应的NaIO₄与乙二醇；透析结束后，将透析液分别转移至广口瓶，置于冰箱中(-20℃)，结冰后转移至已经预冷的冻干机中冻干，得到理论氧化度为10％、20％、40％、60％的多醛基甘露聚糖，其中，理论氧化度的计算是通过：1mol NaIO₄氧化1mol的甘露聚糖单体单元中的邻羟基结构，甘露聚糖由若干mol单体单元结构组成，所以可以根据计算得到总的单体单元mol数，然后通过计算得出不同氧化比例的多醛基甘露聚糖需要多少mol的NaIO₄,氧化的单体单元mol数与总的单体单元mol数比例即为氧化度，计算得到的理论氧化度是绝对值。将适量产品用作红外光谱表征以及X射线衍射分析，剩下的置于冰箱(-20℃)备用。

实施例2 OX-M/NOCC水凝胶的制备

将等体积的具有理论氧化度为20％、浓度为20mg/mL的OX-M溶液(溶剂为生理盐水)与浓度为20mg/mL的NOCC溶液(溶剂为生理盐水)混匀191s，OX-M与NOCC交联形成水凝胶。

实施例3 OX-M/NOCC水凝胶的制备

将等体积的具有理论氧化度为10％、浓度为30mg/mL的OX-M溶液(溶剂为生理盐水)与浓度为20mg/mL的NOCC溶液(溶剂为生理盐水)混匀208s，OX-M与NOCC交联形成水凝胶。

实施例4 OX-M/NOCC水凝胶的制备

将等体积的具有理论氧化度为40％、浓度为20mg/mL的OX-M溶液(溶剂为生理盐水)与浓度为10mg/mL的NOCC溶液(溶剂为生理盐水)混匀136s，OX-M与NOCC交联形成水凝胶。

实施例5 OX-M/NOCC水凝胶的制备

将等体积的具有理论氧化度为60％、浓度为10mg/mL的OX-M溶液(溶剂为生理盐水)与浓度为20mg/mL的NOCC溶液(溶剂为生理盐水)混匀110s，OX-M与NOCC交联形成水凝胶。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1测定OX-M实际氧化度

将盐酸羟胺干燥至恒重，称取4.35g溶解于40mL蒸馏水中形成均一溶液；将1.5mL0.05％甲基橙水溶液加入盐酸羟胺溶液，混匀后转移至250mL容量瓶中，加水稀释至刻度备用；取100mg冻干的各理论氧化度OX-M，将其加入25mL上述制备好的盐酸羟胺-甲基橙溶液中，充分搅拌12小时；以0.1mol/L NaOH溶液作为滴定剂，采用电位滴定法测定溶液中HCI产生的量，并观察溶液颜色变化；最终溶液变为黄色(pH＝5)时停止滴定，根据NaOH溶液的消耗量计算醛基的浓度和OX-M的实际氧化度。

OX-M的实际氧化度的计算：

Mannan-(CHO)_n+nH₂N-OH-HCI＝Mannan-(CH＝N-OH)_n+nH2O+nHCI (1)

HCI+NaOH＝NaCI+H₂O (2)

△V×0.001×n_NaOH＝n_CHO (3)

OD＝(n_CHO/2)/(w_甘露聚糖/162) (4)

其中△V为滴定时所消耗的NaOH的体积，单位为mL；n_NaOH为NaOH的摩尔浓度，单位为mol/L；n_CHO为甘露聚糖上醛基的摩尔数；w_甘露聚糖为甘露聚糖的质量，单位为g；162为甘露聚糖单体单元摩尔质量；OD表示实际氧化度，为甘露聚糖的摩尔质量。

我们通过高碘酸钠氧化法分别制备了理论氧化度为10％，20％，40％和60％的多醛基甘露聚糖(OX-M)(如图1A)，并通过盐酸羟胺法测定了OX-M的实际氧化度(如表1)。此外，我们通过FTIR对甘露聚糖和多醛基甘露聚糖进行了表征，如图2A所示，Mannan和OX-M的红外光谱图十分相似，并没有明显的醛基吸收峰出现，这可能是由于氧化得到的醛基与邻近羟基形成半缩醛结构，导致很难检测到聚合物链中醛基的存在。实验中我们也发现，经高碘酸钠氧化得到的OX-M能够溶解于水溶液，但是溶解度在25℃下明显低于甘露聚糖，需要加热到37℃溶解。这也可能是这种暂时的交联网络(半缩醛结构)降低了OX-M的溶解度。

表1多醛基甘露聚糖的制备

材料	理论氧化度	实际氧化度
			OX-M-1	10％	7.66±2.20
OX-M-2	20％	13.41±1.20
			OX-M-3	40％	31.25±1.24
OX-M-4	60％	45.53±2.19

等体积混匀NOCC(20mg/mL)和理论氧化度为20％的OX-M(20mg/mL)后，OX-M与NOCC通过Schiff碱反应交联形成水凝胶(图1B)。我们分别通过FTIR和XRD对水凝胶的结构进行了分析。图2A可以清楚观察到水凝胶的红外光谱包含NOCC的特征吸收峰(对称和非对称羧酸根阴离子伸缩振动吸收峰：1411cm^-1和1319cm^-1；N-H伸缩振动：3379cm^-1)，此外水凝胶图谱中并未出现OX-M中半缩醛结构吸收峰814cm^-1，表明OX-M中醛基与NOCC的氨基发生了Schiff碱反应。

图2B显示了OX-M，NOCC以及OX-M/NOCC水凝胶的XRD图谱。如图所示，OX-M/NOCC水凝胶分别在2θ＝31.9°，45.6°检测出两个明显的衍射峰。这表明OX-M的醛基与NOCC的氨基结合形成Schiff碱后，聚合物链发生改变，形成新的晶体结构。此外，我们通过等比例混匀NOCC和不同理论氧化度的OX-M(10％，20％，40％，60％)制备水凝胶，并通过XRD检测其晶形的改变。如图2C所示，四种不同理论氧化度OX-M与NOCC制备的水凝胶均在2θ＝31.9°，45.6°处观察到明显的衍射峰，但不同的是氧化度越高，峰强度越弱。氨基与羟基构成的氢键是稳定晶体结构的重要因素，这表明OX-M中醛基越多，通过Schiff碱消耗掉NOCC中的氨基越多，氢键的减少导致水凝胶的晶体结构越来越不稳定。

实验例2 OX-M/NOCC水凝胶的流变分析

通过流变仪和正交法分析不同氧化度OX-M与NOCC在37℃条件下形成凝胶的时间以及凝胶强度，以此筛选适合用于体内应用的材料浓度组合。首先打开流变仪并预热，选择37℃振荡模式；按照10mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，60mg/mL的浓度将NOCC和各不同氧化度的OX-M分别溶解于生理盐水中，并搅拌形成均一溶液；采用双注射器将200μL NOCC和OX-M加在流变仪平行板上，避免气泡产生；使混合溶液与转子之间的间隙保持在1mm，记录20min内，储能模量(G')与损耗模量(G")随时间的变化，并通过Origin作图分析不同浓度和氧化度的OX-M与NOCC形成水凝胶的时间。

我们使用流变仪检测了在37℃下，36种水凝胶样品凝胶形成时间，并记录了10分钟和20分钟时储能模量G'值(如表2)。当OX-M的理论氧化度为10％时，凝胶化时间较长，随着氧化度和浓度的增加，凝胶化时间越来越短，G'值越来越大，当OX-M理论氧化度为60％时，凝胶化时间低于160秒，并且OX-M浓度达到20mg/mL后，凝胶化时间无法检测。能够用于体内的交联水凝胶凝胶化时间不能太短，因为半固态的水凝胶不能用于皮下注射，而通过皮下移植又会对机体造成额外的伤害。此外，水凝胶的储能模量也不能过高或过低，因为过高会不利于水凝胶在体内降解，过低又不利于抗原在体内的缓释。基于这些原因，优选理论氧化度为20％，浓度均为20mg/mL的OX-M和NOCC制备的水凝胶，后续的试验也采用该条件制备的水凝胶。

表2不同OX-M/NOCC水凝胶的制备

如图3A所示，OX-M(20mg/mL)与NOCC(20mg/mL)等比例混匀后，损耗模量G"较小，呈缓慢增长的趋势，储能模量G'刚开始低于0.1pa，随着时间的延长快速增加。当t＝191秒时，G'＝G"，并且之后G'＞G"。OX-M/NOCC水凝胶冷冻干燥后，我们通过扫描电镜观察水凝胶横截面形貌，如图3B所示，可以清楚地看到水凝胶的多孔状和高度连接的内部结构，这可能对蛋白抗原具有高渗透性并支持细胞的浸润。OX-M，NOCC都表现为可流动的溶液，交联后表现为不可流动的凝胶状(图3C)。

实验例3体外细胞毒性检测

取对数生长期的L929与3T3细胞，胰酶消化离心后，细胞计数板计数，使用新鲜培养基重悬；分别将100μL的L929与3T3细胞悬液加入不同的96孔板中，细胞密度分别设置为4×10³个/孔和2.5×10³个/孔；细胞培养过夜使其贴壁生长，每孔分别加入100μL含不同浓度OX-M与NOCC(0mg/mL至2mg/mL)的培养基，与不同含量的实施例2制备的OX-M/NOCC水凝胶浸提液(1mL水凝胶加4mL培养基，于37℃摇床中放置24h制备浸提液，随后用培养基稀释浸提液使原液含量分别为0％，25％，50％和100％。)，每种材料浓度设置6个复孔；继续培养48h后，每孔加入20μL无菌MTT溶液(5mg/mL)，并置于孵箱中继续培养4h；弃培养液，每孔加入150μL DMSO溶解生成的甲臜；将96孔板置于酶标仪上震荡1min后，测定570nm波长的吸光度，并以未处理组为对照，根据吸光度的平均值计算不同浓度材料下细胞的存活率。

我们采用MTT实验研究OX-M和NOCC以及OX-M/NOCC水凝胶浸提液对两种小鼠成纤维细胞系3T3和L929的细胞毒性。如图4所示，NOCC处理的细胞平均存活率均超过80％。对于OX-M处理的细胞，当浓度达到2mg/mL时，3T3细胞存活率能维持在68.9％，L929细胞存活率均超过80％(图4)。不同浓度水凝胶浸提液并未表现出明显的细胞毒性(图4C)。从MTT细胞毒性结果分析，OX-M，NOCC及其形成的水凝胶细胞毒性较低，是安全的生物材料。

实验例4体内释放实验

OX-M/NOCC与荧光标记的卵清白蛋白OVA-RBITC能够通过非共价键结合，在小鼠皮下原位形成水凝胶，利用活体成像仪观察并定量计算OX-M/NOCC释放OVA的速率。准备8只Balb/c，分为PBS组与实施例2制备的OX-M/NOCC水凝胶组，每组4只，用水合氯醛(10％)麻醉小鼠，并用剃毛机将小鼠背部注射部位及周围毛剔除干净；分别制备含OVA-RBITC的PBS溶液和水凝胶，OVA-RBITC浓度为1mg/mL，并将其分别注射到小鼠背部皮下，每只小鼠200μL；注射10min后，将小鼠置于活体成像仪黑箱中，进行荧光成像，标记小鼠并记录对应的荧光强度；此后，分别在1d，3d，6d，10d，18d对各只老鼠进行荧光成像并记录小鼠对应的荧光强度，以注射小鼠10min成像所获得的荧光强度作为总量，计算抗原体内释放速率。

我们利用罗丹明(RBITC)标记的OVA来进行体内成像，通过定量分析检测OX-M/NOCC水凝胶在体内释放抗原的速率。图5A表示各个时间点，每组小鼠具有代表性的活体荧光成像图。单独注射OVA-RBITC组的抗原荧光强度在1天之内快速衰减，仅剩初始荧光强度的33.31％。随后持续降低，到第18天几乎没有荧光信号被检测出来。水凝胶组OVA-RBITC荧光强度缓慢降低，到第18天仍检测出荧光信号，达到初始荧光强度的15.26％。这些结果表明，OVA水溶液在体内会被快速分解，而OX-M/NOCC水凝胶能够作为一种“抗原库”缓慢释放抗原。

实验例5 DC细胞摄取实验

OX-M/NOCC水凝：实施例2制备。

颈椎脱位法处死C57小鼠，无菌状态下取出股骨和胫骨，浸泡在75％酒精中，5min后转移至RPMI1640双无培养基中；用1ml注射器吸取RPMI1640双无培养基，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，1500rpm离心5min；弃去上清，加入5ml无菌红细胞裂解液重悬细胞，于室温下静置5分钟，溶解红细胞后，再次1500rpm离心5min，弃上清；用RPMI1640双无培养液洗涤细胞后用X-vivo15培养基重悬，计数，将细胞密度调整为1×10⁶个/mL，分至6孔培养板中，每孔中加入4ml含细胞的培养基，再加入rmGM-CSF至终浓度20ng/ml，rmIL-4终浓度10ng/ml；将细胞培养板放入37℃，含5％CO₂的孵箱中培养48～72小时；轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜的X-vivo15培养基及相同浓度的rmGM-CSF和rmIL-4，继续培养至第5天；半量换液，并补足rmGM-CSF，尽量保留悬浮细胞；继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞备用。

将细胞铺于24孔板中，500μL/孔，分为空白对照组，PBS/OVA-FITC组和OX-M/NOCC/OVA-FITC组，OVA-FITC的浓度为2.5μg/mL；孵箱中避光孵育4h后，PBS洗三次，300μL PBS重悬细胞，流式上机检测。

将细胞铺于多聚赖氨酸预处理的共聚焦8孔小室中，100μL/孔，分为空白对照组，PBS/OVA-FITC组和OX-M/NOCC/OVA-FITC组，OVA-FITC的浓度为2.5μg/mL；孵箱中避光孵育4h后，弃去培养上清，预冷PBS洗三次后，Lyso-Tracker Red(1：1000)避光染色20min标记溶酶体；弃去溶酶体染色液，预冷PBS洗三次后，Hoechst(1:100)染色5min标记细胞核；弃去细胞核染液，预冷PBS洗三次后用4％多聚甲醛固定10min，用激光共聚焦扫描显微镜进行观察。

外源性抗原进入人体后将首先被抗原呈递细胞摄取，比如DC细胞、巨噬细胞或B细胞。这个过程对于引发下游免疫反应具有重要的作用。如图6A所示，Hydrogel组DC细胞摄取显著增加(p值分别为0.0225和0.0138)，然而在4℃条件下共孵育2h或者4h，DC抗原摄取量均明显低于37℃(图6B)，这表明DC主要通过内吞的方式摄取抗原。接下来共聚焦荧光成像结果显示相比于水溶性OVA-FITC，Hydrogel组抗原荧光更强，这也表明Hydrogel促进了DC对抗原的摄取。

实验例6 ELISA检测抗原特异性抗体的产生

OX-M/NOCC水凝：实施例2制备。

6到8周龄的C57小鼠被随机分成4组：生理盐水组、OVA组、Alum/OVA组和OX-M/NOCC/OVA组，每组6只小鼠；各组小鼠分三次免疫(0d，14d，21d)，每次分别在背部皮下分两点注射100μL相应溶液，其中OVA浓度均为0.2mg/mL，Alum与OVA-FITC的质量比为5:1，OX-M/NOCC水凝胶浓度为20mg/mL；分别在21d，28d，35d，42d对各组小鼠进行眼眶取血，并置于4℃冰箱中过夜，4℃条件下3500rpm离心15min，分离血清，分装后置于-80℃冰箱保存备用；将含有10μg/mL OVA的碳酸盐缓冲液加入酶标板中，100μL/孔，置于4℃冰箱过夜进行预包被；取包被好的酶标板，PBST洗3次，每次在滤纸上扣干；每孔加入150μL封闭液，37℃恒温孵箱中孵育1h；PBST洗5次，每次在滤纸上扣干；每孔加入100μL稀释后的血清，37℃恒温孵箱中孵育1.5h后，PBST洗5次，每次在滤纸上扣干；加入100μL稀释后的HRP标记二抗，37℃恒温孵箱中孵育1h，PBST洗5次，每次在滤纸上扣干；每孔加入100μL TMB单组分显色液，37℃恒温孵箱中避光显色20min；每孔直接加50μL终止液后，酶标仪上读取450nm吸光度值。当实验孔吸光度值大于对照孔2.1倍时所对应的最低稀释倍数为该组血清所对应的抗体滴度。

OX-M/NOCC水凝胶对抗原OVA的缓释性以及促进抗原在***的聚集作用促使我们进一步研究其是否在体内诱导更强的保护性免疫反应。图7A可以看出，从最后一次免疫开始，水溶性OVA组相比Hydrogel组与Alum组产生的抗原特异性IgG抗体滴度更低，Hydrogel组产生的IgG抗体滴度在各个时间点都显著高于OVA组与Alum组，并在最后一次增强免疫后的第28天达到最高值，对于IgG分型抗体，Hydrogel组同样显著高于Alum组与OVA组(图7B和C)。这些结果表明OX-M/NOCC水凝胶能够在体内增强机体的免疫反应。

实验例7 ELISA检测OX-M/NOCC水凝胶组与NOCC组抗原抗体滴度的产生

OX-M/NOCC水凝：实施例2制备。

6到8周龄的C57小鼠被随机分成4组：生理盐水组、OVA组、NOCC组和OX-M/NOCC/OVA组，每组6只小鼠；各组小鼠分三次免疫(0d，14d，21d)，每次分别在背部皮下分两点注射100μL相应溶液，其中OVA浓度均为0.2mg/mL，NOCC浓度为20mg/mL，OX-M/NOCC水凝胶浓度为20mg/mL；分别在21d，28d，35d对各组小鼠进行眼眶取血，并置于4℃冰箱中过夜，然后4℃条件下3500rpm离心15min，分离血清，分装后置于-80℃冰箱保存备用；将含有10μg/mL OVA的碳酸盐缓冲液加入酶标板中，100μL/孔，置于4℃冰箱过夜进行预包被；取包被好的酶标板，PBST洗3次，每次在滤纸上扣干；每孔加入150μL封闭液，37℃恒温孵箱中孵育1h；PBST洗5次，每次在滤纸上扣干；每孔加入100μL稀释后的血清，37℃恒温孵箱中孵育1.5h后，PBST洗5次，每次在滤纸上扣干；加入100μL稀释后的HRP标记二抗，37℃恒温孵箱中孵育1h PBST洗5次，每次在滤纸上扣干；每孔加入100μL TMB单组分显色液，37℃恒温孵箱中避光显色20min；每孔直接加50μL终止液后，酶标仪上读取450nm吸光度值。当实验孔吸光度值大于对照孔(生理盐水对照组小鼠血清)2.1倍时所对应的最低稀释倍数为该组血清所对应的抗体滴度。

已有研究报道，壳聚糖具有刺激机体免疫的作用，但其水溶性衍生物对于机体体液免疫的影响未见报道。如图8所示，单独NOCC组刺激小鼠产生抗原特异性IgG抗体滴度与水溶性OVA组相当，均显著低于OX-M/NOCC水凝胶组(图8A，表3)。此外，对于IgG分型抗体IgG1和IgG2b，我们发现了同样的结果(图8B和C，表3)。这些结果表明NOCC并不具有单独刺激机体体液免疫的作用。

实验结果说明，NOCC单独刺激机体体液免疫的作用较小，本发明采用OX-M与NOCC交联的方式可以大幅度提高其刺激作用，而OX-M本身的免疫刺激作用也非常弱，证明本发明将OX-M与NOCC复合可以发挥协同增效的作用。

表3

综上，我们制备了一种可注射的，低毒性的OX-M/NOCC水凝胶佐剂用于体内抗原递送。OX-M/NOCC水凝胶具有“抗原储存库”效应，促进DC对抗原的摄取。与铝佐剂相比，OX-M/NOCC水凝胶联合蛋白疫苗增加了抗原在***中的聚集，延长作用时间，并在免疫小鼠后引发强烈的抗原特异性体液免疫应答。结果表明OX-M/NOCC水凝胶是一种潜在的新型疫苗佐剂。并且，相较于多醛基甘露聚糖(OX-M)、羧甲基壳聚糖(NOCC)，OX-M/NOCC水凝胶作为免疫佐剂，具有能够引发更强烈的抗原特异性体液免疫应答、促进DC对抗原的摄取等优势。

Claims

1.羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶用于制备免疫佐剂的用途，其特征在于：羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶是由如下方法制备得到：将羧甲基壳聚糖溶液与多醛基甘露聚糖溶液混匀，得羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶；所述羧甲基壳聚糖溶液与多醛基甘露聚糖溶液的体积比为1:3~3：1；所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为10~30mg/mL；所述多醛基甘露聚糖溶液的浓度为10~30mg/mL；所述多醛基甘露聚糖的氧化度为13.41%~45.33%；所述羧甲基壳聚糖溶液的溶剂为生理盐水；所述多醛基甘露聚糖溶液的溶剂为生理盐水；所述免疫佐剂是以羧甲基壳聚糖-多醛基甘露聚糖水凝胶为有效成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述羧甲基壳聚糖溶液与多醛基甘露聚糖溶液的体积比为1: 1。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为15~30mg/mL；和/或，所述多醛基甘露聚糖溶液的浓度为15~30mg/mL。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为20~30mg/mL；和/或，所述多醛基甘露聚糖溶液的浓度为20~30 mg/mL。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述混匀的温度为25℃；和/或，所述混匀后水凝胶形成时间低于527s。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述混匀的时间为100~210s。

7.根据权利要求1~6任意一项所述的用途，其特征在于：所述多醛基甘露聚糖的制备方法为：将甘露聚糖溶于磷酸盐缓冲液中，形成均匀溶液，将NaIO₄加入溶液中，25℃条件下，避光反应12小时，终止反应，透析，冻干，即得。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的pH=6.0；和/或，所述甘露聚糖与磷酸盐缓冲液的质量体积比为1：50g/mL；和/或，所述NaIO₄与甘露聚糖单体单元的摩尔比为1:10~3:5；和/或，所述终止反应是利用乙二醇终止反应；和/或，所述透析使用的透析袋的截留分子量为3500。