CN109692130A - 一种含有防御素的面膜液及其制备方法 - Google Patents

一种含有防御素的面膜液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有防御素的面膜液及其制备方法，本发明的面膜液以重量百分比计包括以下组分：甘油4.0‑6.0％、防御素0.3‑0.6％、1,3‑丁二醇3.0‑5.0％、透明质酸0.1‑0.2％、熊果苷1.5‑2.5％、聚乙二醇1.5‑2.5％、卡波树脂0.4‑0.6％、泛醇0.4‑0.6％、维生素E脂质体4.0‑6.0％、维生素C脂质体2.0‑4.0％、三乙醇胺0.3‑0.5％、PEG(60)氢化蓖麻油0.2‑0.4％、防腐剂0.1‑0.5％、香精0.3‑0.6％，余量为去离子水。本发明的面膜液各组分间具有协同增效作用，能够多重修复肌肤，安全无刺激；且制备方法简单，可工业化生产，有利于推广应用。

Description

一种含有防御素的面膜液及其制备方法
技术领域
本发明涉及日用化妆品技术领域，具体涉及一种含有防御素的面膜液及其制备方法。
背景技术
随着社会的发展和科技的进步，人们的工作和生活压力越来越大，环境污染问题也越来越严重。长期生活在快节奏、饮食不规律和污染较大的环境中，导致人们的皮肤耐受能力不断减弱，皮肤敏感、受损的情况越来越严重，越来越多人的皮肤呈现亚健康状态。因此，皮肤护理已逐渐成为人们生活中不可缺少的一部分。
面膜作为美容产品之一，其具有改善皮肤效果显著，使用方便的优点而深受消费者的喜爱。面膜使用时是将浸有面膜液的无纺布面贴膜覆盖在脸部15-20分钟，这样可以暂时将脸部与外界的空气和污染隔离，提高肌肤温度，扩张皮肤毛孔，促进汗腺分泌与新陈代谢，使肌肤的含氧量上升，有利于肌肤排除表皮细胞新陈代谢的产物和累积的油脂类物质，贴膜中的面膜液渗入肌肤表皮的角质层，使皮肤变得柔软、自然光亮，且有弹性。
防御素(Defensin)是一种富含半胱氨酸的小分子多肽，通常由29-54个氨基酸组成，其中包括6-8个保守半胱氨酸。防御素具有广谱抗微生物活性，能有效的杀灭病毒、细菌、真菌、螺旋体等，对肿瘤细胞也有细胞毒作用。目前还未见有将防御素应用于制备面膜液的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种含有防御素的面膜液及其制备方法。本发明的面膜液能快速修复表皮过薄、受损、暗黄的肌肤；能有效抑菌、褪红肿、排除皮肤毒素、畅通毛细血管，同时可以软化表皮角质，平衡油脂分泌，收缩毛孔，有利于黑头及粉刺的清除；增强肌肤抵抗力，防止疤痕增生；同时具有温和杀菌、消炎，调节皮脂分泌，促进表皮细胞生长，令受损肌肤愈合不留色素、疤痕；还能调整皮肤酸碱度，平衡油脂、杀菌消炎、收缩毛孔，防止皮肤皱纹和暗疮的产生。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供防御素在制备面膜液中的应用。
优选的，所述防御素的氨基酸序列为：CYCRIPACIAGERRYGTCIYGGRLWAFCC；(SEQ IDNO.1)
更优选的，所述防御素的氨基酸序列中包含一个或多个的D-型氨基酸；具体的，其氨基酸序列为：
CYCRIPACIX1GERRYGX2CIYX3GRLWAX4CC；
其中，X1为Ala或D-Ala；
X2为Thr或D-Thr；
X3为Gly或D-Gly；
X4为Phe或D-Phe；
其中X1、X2、X3或X4中的至少一个为D氨基酸。
本发明的第二方面，提供一种含有防御素的面膜液，以重量百分比计包括以下组分：
甘油4.0-6.0％、防御素0.3-0.6％、1,3-丁二醇3.0-5.0％、透明质酸0.1-0.2％、熊果苷1.5-2.5％、聚乙二醇1.5-2.5％、卡波树脂0.4-0.6％、泛醇0.4-0.6％、维生素E脂质体4.0-6.0％、维生素C脂质体2.0-4.0％、三乙醇胺0.3-0.5％、PEG(60)氢化蓖麻油0.2-0.4％、防腐剂0.1-0.5％、香精0.3-0.6％，余量为去离子水。
优选的，所述防腐剂为植物提取物防腐剂；更优选的，所述植物提取物防腐剂为仙人掌提取物，由如下方法制备而成：
将新鲜仙人掌洗净后打浆，浆液经真空冷冻干燥，粉碎，即得仙人掌提取物。
优选的，所述香精为沙棘提取物，由如下方法制备而成：
将沙棘果实干燥、粉碎，过40-60目筛，然后采用超临界CO2萃取工艺进行提取，萃取压力25-30MPa，萃取温度35-45℃，CO2流量20-25L/h，夹带剂为体积浓度为95％的乙醇，夹带剂的用量为原料重量的6-8％，萃取时间为1-2h，即得沙棘提取物。
本发明的第三方面，提供上述含有防御素的面膜液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、聚乙二醇、卡波树脂、泛醇、三乙醇胺、PEG(60)氢化蓖麻油和去离子水加入到搅拌锅中，升温至70-80℃，搅拌10-20分钟，得混合液A；
(2)待混合液A降温至30-40℃时，加入防御素、透明质酸、熊果苷、维生素E脂质体、维生素C脂质体、防腐剂和香精，搅拌5-10分钟，然后均质5-10分钟，即得。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中，搅拌速度均为40-60r/min。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次以防御素为原料制备面膜液，其具有高度抗菌性，对耐药菌具有极强的抑菌、杀菌功效；且无毒副反应、无残留、不会导致细菌耐药性。
(2)本发明的面膜液各原料之间的相容性好，使产品更加均匀细腻，提高了产品对皮肤的亲和性。
(3)本发明的面膜液中以天然植物提取物作为防腐剂和香精，避免过多化学物质的添加，成分更加天然；而且上述天然植物提取物在作为防腐剂和香精的同时，还能与防御素之间产生协同促进作用，提高杀菌效果，还能促进细胞生长和加快伤口的愈合。
(4)本发明的面膜液各组分间具有协同增效作用，能够多重修复肌肤，安全无刺激；且制备方法简单，可工业化生产，有利于推广应用。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，防御素具有广谱的抗微生物活性和显著的杀菌效果，在植物抗病基因工程和生物制药等领域有着广泛应用。但是防御素的稳定性、抗水解性和生物活性仍有待进一步提高，因此，对防御素进行结构修饰成为研究的热点。
非天然的D-型氨基酸的引入是防御素结构修饰的方法之一，通过恰当引入D-型氨基酸，可以提高防御素的稳定性、抗水解性和生物活性。但是，D-型氨基酸引入的种类、位置和数量是影响防御素结构修饰效果的关键，若引入的D-型氨基酸的种类、位置或数量不合适，反而会降低防御素的稳定性、抗水解性和生物活性。
本发明中，所使用的防御素的氨基酸组成为：CYCRIPACIAGERRYGTCIYGGRLWA FCC；(SEQ ID NO.1)。
在此基础上，本发明首先对上述防御素进行了结构修饰，通过大量的试验发现，按如下氨基酸组成进行修饰，其效果较优：
CYCRIPACIX1GERRYGX2CIYX3GRLWAX4CC；
其中，X1为Ala或D-Ala；
X2为Thr或D-Thr；
X3为Gly或D-Gly；
X4为Phe或D-Phe；
其中X1、X2、X3或X4中的至少一个为D-型氨基酸。
对于防御素可采用化学合成或基因工程的方法等现有技术中的常规方法制备得到。
防御素结构修饰的方法可以在化学合成中直接掺入D-型氨基酸；或者在基因工程表达过程中在培养基中加入D-型氨基酸。
在对防御素进行结构修饰研究的基础上，本发明还首次将防御素用于面膜液的制备。在本发明的一种实施方案中，所述面膜液由如下原料制成：
甘油4.0-6.0％、防御素0.3-0.6％、1,3-丁二醇3.0-5.0％、透明质酸0.1-0.2％、熊果苷1.5-2.5％、聚乙二醇1.5-2.5％、卡波树脂0.4-0.6％、泛醇0.4-0.6％、维生素E脂质体4.0-6.0％、维生素C脂质体2.0-4.0％、三乙醇胺0.3-0.5％、PEG(60)氢化蓖麻油0.2-0.4％、防腐剂0.1-0.5％、香精0.3-0.6％，余量为去离子水。
考虑到采用化学的“防腐剂”和“香精”其功效比较单一，而且在如今倡导自然的背景下，面膜液中含有过多的化学成分不容易被消费者认可。基于此，本发明采用仙人掌提取物作为“防腐剂”，采用沙棘提取物作为“香精”；其中，仙人掌提取物具有显著的抑菌作用和抗氧化作用，沙棘提取物能释放出一种令人愉快的芳香气味。仙人掌提取物和沙棘提取物在作为防腐剂和香精的同时，还能与防御素之间产生协同促进作用，提高杀菌效果，还能促进细胞生长和加快伤口的愈合。
维生素E具有抗氧化、舒张血管和防皮肤粗糙等作用；维生素C可合成胶原蛋白和粘多糖，减少自由基对皮肤的损害，延缓衰老，同时可以抑制皮肤异常色素的沉积以及酪氨酸酶的活性，减少黑色素的形成。但是维生素E和维生素C容易氧化变质，若以普通方法加入到面膜基质中，容易被氧化变质而失去作用；而且维生素C是水溶性的，不易渗透到皮肤角质层，故不能充分发挥作用。
脂质体是一种新型的生物载体，具有缓释和通透等良好特性，本发明将维生素E和维生素C用脂质体包封后作为制备面膜液的原料，可以有效提高维生素E和维生素C的利用率。
对于维生素E脂质体和维生素C脂质体，可以购买市售的产品，也可以按现有的方法制备得到。例如：
将卵磷脂和胆固醇按质量比为6:1制成空白脂质体，以空白脂质体和维生素E/维生素C按质量比为9:2混合，超声处理3min，并经稳定化处理和离心分离后的维生素E或维生素C脂质体。
本发明的面膜液中，各原料组分是一个有机的整体，缺一不可，原料之间具有协同促进作用。其中，防御素、仙人掌提取物、沙棘提取物和熊果苷配伍使用，具有协同促进作用，不仅能够提升杀菌效果，还能促进细胞生长和加快伤口的愈合；透明质酸、泛醇、三乙醇胺和甘油的相溶性好，配合使用可以提高产品对皮肤的亲和性，同时提高皮肤的保水性；维生素E脂质体和维生素C脂质体的加入，能够提高维生素E和维生素C的稳定性，减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，同时还有杀菌和消炎的作用。
本发明在试验过程中，依次将“防御素”、“仙人掌提取物”和“沙棘提取物”等原料组分去掉，制备得到面膜液。然后将制备的面膜液进行抑菌试验，结果发现，与本发明的面膜液相比，删减其中的原料组分都会降低面膜液的抑菌效果。
在本发明的面膜液原料的基础上，再增加一种或多种常见的制备面膜液的原料，例如单硬脂酸甘油酯、槲皮素、鱼腥草素等，制备得到面膜液，同样用于抑菌试验，结果发现，与本发明的面膜液相比，在本发明的面膜液原料基础上，再增加其他原料组分，对抑菌效果的提升不显著，甚至还有抑菌效果降低的情况出现。
综上，本发明通过对原料的选择和用量的优化，制备得到面膜液。本发明的面膜液具有多种功效：能快速修复表皮过薄、受损、暗黄的肌肤；能有效抑菌、褪红肿、排除皮肤毒素、畅通毛细血管，同时可以软化表皮角质，平衡油脂分泌，收缩毛孔，有利于黑头及粉刺的清除；增强肌肤抵抗力，防止疤痕增生；同时具有温和杀菌、消炎，调节皮脂分泌，促进表皮细胞生长，令受损肌肤愈合不留色素、疤痕；还能调整皮肤酸碱度，平衡油脂、杀菌消炎、收缩毛孔，防止皮肤皱纹和暗疮的产生。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：面膜液的制备
1.原料组成(重量百分比)：
甘油5.0％、防御素0.5％、1,3-丁二醇4.0％、透明质酸0.1％、熊果苷2.0％、聚乙二醇1500 2.0％、卡波树脂0.5％、泛醇0.5％、维生素E脂质体5.0％、维生素C脂质体3.0％、三乙醇胺0.4％、PEG(60)氢化蓖麻油0.3％、防腐剂0.3％、香精0.4％，余量为去离子水。
其中，所述防御素的氨基酸序列为：
CYCRIPACIX1GERRYGX2CIYX3GRLWAX4CC；
其中，X1为D-Ala；X2为D-Thr；X3为D-Gly；X4为D-Phe。
防御素是采用Fmoc固相合成方法，按照设计的替换位点在相应位置引入D-型氨基酸，然后按序列延长肽链即得。
所述防腐剂为仙人掌提取物，由如下方法制备而成：
将新鲜仙人掌洗净后打浆，浆液经真空冷冻干燥，粉碎，即得仙人掌提取物。
所述香精为沙棘提取物，由如下方法制备而成：
将沙棘果实干燥、粉碎，过40目筛，然后采用超临界CO2萃取工艺进行提取，萃取压力28MPa，萃取温度40℃，CO2流量25L/h，夹带剂为体积浓度为95％的乙醇，夹带剂的用量为原料重量的7％，萃取时间为2h，即得沙棘提取物。
2.制备方法：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、聚乙二醇、卡波树脂、泛醇、三乙醇胺、PEG(60)氢化蓖麻油和去离子水加入到搅拌锅中，升温至75℃，搅拌15分钟，得混合液A；
(2)待混合液A降温至35℃时，加入防御素、透明质酸、熊果苷、维生素E脂质体、维生素C脂质体、防腐剂和香精，搅拌10分钟，然后均质5分钟，即得。
实施例2：面膜液的制备
1.原料组成(重量百分比)：
甘油4.0％、防御素0.6％、1,3-丁二醇3.0％、透明质酸0.2％、熊果苷1.5％、聚乙二醇1500 2.5％、卡波树脂0.4％、泛醇0.6％、维生素E脂质体4.0％、维生素C脂质体4.0％、三乙醇胺0.3％、PEG(60)氢化蓖麻油0.4％、防腐剂0.1％、香精0.6％，余量为去离子水。
其中，所述防御素的氨基酸序列为：
CYCRIPACIX1GERRYGX2CIYX3GRLWAX4CC；
其中，X1为Ala；X2为D-Thr；X3为Gly；X4为D-Phe。
防御素是采用Fmoc固相合成方法，按照设计的替换位点在相应位置引入D-型氨基酸，然后按序列延长肽链即得。
所述防腐剂为仙人掌提取物，制备方法同实施例1。
所述香精为沙棘提取物，制备方法同实施例1。
2.制备方法：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、聚乙二醇、卡波树脂、泛醇、三乙醇胺、PEG(60)氢化蓖麻油和去离子水加入到搅拌锅中，升温至70℃，搅拌20分钟，得混合液A；
(2)待混合液A降温至30℃时，加入防御素、透明质酸、熊果苷、维生素E脂质体、维生素C脂质体、防腐剂和香精，搅拌5分钟，然后均质10分钟，即得。
实施例3：面膜液的制备
1.原料组成(重量百分比)：
甘油6.0％、防御素0.3％、1,3-丁二醇5.0％、透明质酸0.1％、熊果苷2.5％、聚乙二醇1500 1.5％、卡波树脂0.6％、泛醇0.4％、维生素E脂质体6.0％、维生素C脂质体2.0％、三乙醇胺0.5％、PEG(60)氢化蓖麻油0.2％、防腐剂0.5％、香精0.3％，余量为去离子水。
其中，所述防御素的氨基酸序列为：
CYCRIPACIX1GERRYGX2CIYX3GRLWAX4CC；
其中，X1为Ala；X2为D-Thr；X3为Gly；X4为Phe。
防御素是采用Fmoc固相合成方法，按照设计的替换位点在相应位置引入D-型氨基酸，然后按序列延长肽链即得。
所述防腐剂为仙人掌提取物，制备方法同实施例1。
所述香精为沙棘提取物，制备方法同实施例1。
2.制备方法：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、聚乙二醇、卡波树脂、泛醇、三乙醇胺、PEG(60)氢化蓖麻油和去离子水加入到搅拌锅中，升温至80℃，搅拌10分钟，得混合液A；
(2)待混合液A降温至40℃时，加入防御素、透明质酸、熊果苷、维生素E脂质体、维生素C脂质体、防腐剂和香精，搅拌10分钟，然后均质10分钟，即得。
对比例1：面膜液的制备
1.原料组成(重量百分比)：
甘油5.0％、1,3-丁二醇4.0％、透明质酸0.1％、聚乙二醇1500 2.0％、卡波树脂0.5％、泛醇0.5％、维生素E脂质体5.0％、维生素C脂质体3.0％、三乙醇胺0.4％、PEG(60)氢化蓖麻油0.3％、防腐剂0.3％、香精0.4％，余量为去离子水。
其中，防腐剂为咪唑烷基脲；香精为沙棘提取物(制备同实施例1)。
2.制备方法：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、聚乙二醇、卡波树脂、泛醇、三乙醇胺、PEG(60)氢化蓖麻油和去离子水加入到搅拌锅中，升温至75℃，搅拌15分钟，得混合液A；
(2)待混合液A降温至35℃时，加透明质酸、维生素E脂质体、维生素C脂质体、防腐剂和香精，搅拌10分钟，然后均质5分钟，即得。
对比例2：
1.原料组成(重量百分比)：
甘油5.0％、1,3-丁二醇4.0％、透明质酸0.1％、聚乙二醇1500 2.0％、卡波树脂0.5％、泛醇0.5％、维生素E脂质体5.0％、维生素C脂质体3.0％、三乙醇胺0.4％、PEG(60)氢化蓖麻油0.3％、防腐剂0.3％、香精0.4％，余量为去离子水。
其中，防腐剂为仙人掌提取物(制备同实施例1)；香精为乳化香精。
2.制备方法：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、聚乙二醇、卡波树脂、泛醇、三乙醇胺、PEG(60)氢化蓖麻油和去离子水加入到搅拌锅中，升温至75℃，搅拌15分钟，得混合液A；
(2)待混合液A降温至35℃时，加透明质酸、维生素E脂质体、维生素C脂质体、防腐剂和香精，搅拌10分钟，然后均质5分钟，即得。
安全性试验：
按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)中的微生物检验方法、毒理学试验方法和人体安全性检验方法对实施例1-实施例3制备的面膜液进行检验，结果均符合规范的要求，说明本发明的面膜液使用安全。
试验例1：抑菌试验
1.试验材料：实施例1和对比例1-对比例2制备的面膜液。
2.供试菌的准备：
在无菌操作室中分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌接种至牛肉膏培养液中，将曲霉、啤酒酵母和假丝酵母接种至豆芽汁培养液中，在28-30℃条件下培养1-3d。
3.试验方法：
采用琼脂打孔扩散法，将无菌培养皿分为4组，每组4个，将灭菌后的牛肉膏培养液倒入无菌培养皿中，每皿15～20mL，待其凝固后用无菌移液管吸取0.1mL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金杆菌和枯草芽孢杆菌供试菌加到培养皿上，涂布均匀，每组每个培养皿加入不同的菌种。
将无菌培养皿分为4组，每组3个，将灭菌后的豆芽汁培养液倒入无菌培养皿中，每皿15～20mL，待其凝固后用无菌移液管吸取0.1mL曲霉、啤酒酵母和假丝酵母供试菌加到培养皿上，涂布均匀，每组每个培养皿加入不同的菌种。
涂布完毕后，然后用外径4mm的灭菌不锈钢打孔器在培养基上打4个等距离的孔。用微量加样器分别吸取实施例1、对比例1和对比例2制备的面膜液30μL，中间一孔添加等量无菌水做对照组，做好标记。将细菌置于37℃下培养24h，将霉菌和酵母置于28℃下培养72h。量取抑菌圈直径(抑菌直径mm计)，试验重复5次，以5次平均值为抑菌圈直径。
4.试验结果：
试验结果如表1所示。
表1：抑菌试验数据
由表1可以看出，本发明制备的面膜液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌、曲霉、啤酒酵母和假丝酵母均具有显著的抑制作用；而对比例1-对比例2制备的面膜液中，由于缺少防御素、仙人掌提取物和沙棘提取物，对上述菌的抑制作用显著下降，说明防御素、仙人掌提取物和沙棘提取物可以协同增强抑菌作用。
试验例2：成纤维细胞增殖试验
1.试验样品：实施例1和对比例1-对比例2制备的面膜液。
分别将上述试验样品干燥制得粉末，然后用PBS配制成浓度为0.5mg/ml的试验样品溶液。
2.试验方法：
将制备好的人成纤维细胞(取自手术后剩余的正常皮肤，第4～10代)悬液配制成浓度为2.5×104个/ml接种于96孔板内，空白对照组中不接种细胞加入相应体积培养基，待细胞贴壁后，阴性对照组每孔加入20μl PBS，样品组每孔加入20μl试验样品溶液(PBS配制)，每组设6个复孔，置培养箱(37℃，5％CO2)中孵育48小时，然后加人MTT(购自Sigma公司，批号：08797HJ)溶液(PBS配制)20μl，继续在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育4h。取出96孔板，小心吸去每孔内的培养基，加入DMSO，混合均匀。用酶联免疫检测仪测定570nm处的吸光值，通过与阴性对照组的比较得到样品组的相对增殖率。
式中：T-样品孔Abs；C-阴性对照孔Abs；C0-空白对照孔Abs。
试验结果见表2。
表2：成纤维细胞增殖试验结果
真皮结构的改变是皮肤衰老的主要原因，成纤维细胞是组成真皮层的主要细胞。随着衰老的发生真皮层中的成纤维细胞数量会逐渐减少，皮肤厚度逐渐变薄。因此促进成纤维细胞增殖是解决皮肤衰老问题的重要途径。由表2可以看出，本发明的面膜液具有协同促进人成纤维细胞增殖的效果，证实本发明的面膜液具有抗衰老的功效。
试验例3：创伤愈合试验
1.试验材料：
实施例1和对比例1-对比例2制备的面膜液，HACAT细胞，购于上海博谷生物科技有限公司，货号为BG183。
2.试验方法：
取对数生长期的HACAT细胞，接种于6孔培养板中，待HACAT细胞100％融合，在6孔板背面用笔画等距离横线。使用100uL枪头在细胞单层纵向划痕，造成培养细胞创口模型。划痕后随机分组，分别为对照组和试验组1-3，对照组用等量的细胞维持液处理，而试验组1-3分别用实施例1和对比例1-对比例2制备的面膜液处理。处理完后观察划痕与所画横线交汇点附近的变化情况，并在0、6、12h分别拍照，在荧光显微镜下测量划痕的宽度。
3.试验结果：
试验结果见表3。
表3：荧光显微镜下测量的划痕宽度
由表3可以看出，本发明的面膜液可以有效的促进HACAT细胞的迁移融合，证明本发明的面膜液可以促进伤口的愈合。
试验例4：抑制黑色素形成试验
1.试验样品：
实施例1和对比例1-对比例2制备的面膜液。
2.试验方法：
将人皮肤黑色素瘤细胞SK-MEL-1置于含10％牛胚胎血清的极限必需培养基中，并在37℃和5％CO2的条件下培养。将培养的细胞涂抹于75孔***底部，细胞数为3×105/孔，放置过夜，从而使细胞粘附于壁上。确认后，将每一培养基变成含有10ppm试验样品的新培养基。对照组采用含DMSO(二甲基亚砜)的培养基。
以上述方式，每2天一次将每种培养基变成含有试验样品的新培养基，直至培养的细胞足以充满烧瓶。然后，取出培养基流体，用PBS(磷酸缓冲液)洗涤，再溶解于1N的NaOH中，测量在500纳米下的光密度(opticaldensity，OD)，按下式1计算黑色素形成的抑制率,结果如表4所示。
式1：黑色素形成抑制率(％)＝{1-(每一种实验样品的OD/对照组的OD)}×100。
表4：抑制黑色素形成试验结果
试验样品 黑色素形成抑制率(％)
实施例1 50.6
对比例1 21.8
对比例2 14.5
由表4可以看出，与对比例1和对比例2相比，本发明的面膜液能够显著抑制黑色素的形成，能够对皮肤起到增白效果。
试验例5：抵御干燥环境下的水分散失试验
1.试验样品：
实施例1和对比例1-对比例2制备的面膜液。
2.试验方法：
为模拟皮肤状态，选用25.4×76.2mm的载玻片，贴上3M胶带。称取约200mg的样品，将其均匀涂抹于载玻片上，放入恒温恒湿的仪器内。本实验在室温(25℃)下进行，采用饱和硫酸铵溶液来控制80％的恒定湿度环境。一定时间(30、60、90、120、240分钟)后称重；以水作为空白对照，计算样品的失水率，通过失水率的大小来比较保湿率，失水率越小表示保湿效果越好。结果见表5。
失水率(％)＝(M2-M3)/(M2-M1)×100％；
式中，M1-载玻片重量(g)，M2-涂抹后放置前总重量(g)，M3-涂抹后放置后总重量(g)。
表5：抵御干燥环境下的水分散失试验结果
由表5可以看出，本发明的面膜液能够在干燥环境下抵御干燥损伤，具有保湿美肤的效果。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 威海同丰海洋生物科技有限公司
<120> 一种含有防御素的面膜液及其制备方法
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 防御素
<400> 1
Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Cys Ile Tyr Gly Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys
20 25

Claims (10)

1.防御素在制备面膜液中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防御素的氨基酸序列为：CYCRIPACIAGERRYGTCIYGGRLWAFCC。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述防御素的氨基酸序列中包含一个或多个的D-型氨基酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述防御素的氨基酸序列为：
CYCRIPACIX1GERRYGX2CIYX3GRLWAX4CC；
其中，X1为Ala或D-Ala；
X2为Thr或D-Thr；
X3为Gly或D-Gly；
X4为Phe或D-Phe；
其中X1、X2、X3或X4中的至少一个为D-型氨基酸。
5.一种含有防御素的面膜液，其特征在于，以重量百分比计包括以下组分：
甘油4.0-6.0％、防御素0.3-0.6％、1,3-丁二醇3.0-5.0％、透明质酸0.1-0.2％、熊果苷1.5-2.5％、聚乙二醇1.5-2.5％、卡波树脂0.4-0.6％、泛醇0.4-0.6％、维生素E脂质体4.0-6.0％、维生素C脂质体2.0-4.0％、三乙醇胺0.3-0.5％、PEG(60)氢化蓖麻油0.2-0.4％、防腐剂0.1-0.5％、香精0.3-0.6％，余量为去离子水；
所述防御素的氨基酸序列如权利要求2-4任一项所述。
6.根据权利要求5所述的面膜液，其特征在于，所述防腐剂为植物提取物防腐剂。
7.根据权利要求6所述的面膜液，其特征在于，所述植物提取物防腐剂为仙人掌提取物，由如下方法制备而成：
将新鲜仙人掌洗净后打浆，浆液经真空冷冻干燥，粉碎，即得仙人掌提取物。
8.根据权利要求5所述的面膜液，其特征在于，所述香精为沙棘提取物，由如下方法制备而成：
将沙棘果实干燥、粉碎，过40-60目筛，然后采用超临界CO2萃取工艺进行提取，萃取压力25-30MPa，萃取温度35-45℃，CO2流量20-25L/h，夹带剂为体积浓度为95％的乙醇，夹带剂的用量为原料重量的6-8％，萃取时间为1-2h，即得沙棘提取物。
9.权利要求5-8任一项所述的面膜液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、聚乙二醇、卡波树脂、泛醇、三乙醇胺、PEG(60)氢化蓖麻油和去离子水加入到搅拌锅中，升温至70-80℃，搅拌10-20分钟，得混合液A；
(2)待混合液A降温至30-40℃时，加入防御素、透明质酸、熊果苷、维生素E脂质体、维生素C脂质体、防腐剂和香精，搅拌5-10分钟，然后均质5-10分钟，即得。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，搅拌速度均为40-60r/min。
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