CN109680090A

CN109680090A - 一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法

Info

Publication number: CN109680090A
Application number: CN201811572102.5A
Authority: CN
Inventors: 叶子弘; 张雅芬; 葛鑫涛; 夏文强; 俞晓平; 崔海峰
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2019-04-26

Abstract

一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法，属于分子生物学技术领域。该鉴定茭白表型特征的分子标记包括分子标记UeG1、UeG2、UeG3、UeG4、UeG5和UeG6。本发明通过SNP标记筛选灰茭，可以对正常茭白提早选择，减少工作量，提高筛选效率。

Description

一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法。

背景技术

茭白(Zizania latifolia Turcz.)为禾本科多年生宿根草本植物,原产于我国和东南亚地区，是我国的第二大水生蔬菜。茭白在我国早有栽培，西周之前，茭白的种子被作为粮食食用，后因发现其茎部被菰黑粉菌(Ustilago esculenta)感染而形成的菌瘿不仅可以食用，而且肉质肥嫩、口感极佳，而被当成一种蔬菜食用，唐朝末期开始被作为一种蔬菜广泛种植。除了作为蔬菜，茭白也可药用，具有利尿止渴、清热解毒之功效。田间茭白一般以正常茭(white Jiaobai)的形式存在，但由于水温、种植模式、管理模式、光照等原因，会产生一定量的灰茭(Grey Jiaobai)。灰茭由于茎部聚集大量灰孢子，导致其口感下降，茭白品质下降，一般不可食用。因此田间去除灰茭，是茭白田间管理的一大重点。然而灰茭的产生是随机的不可预见的，因此在茭白苗期对茭白进行表型鉴定有利于提早选择高品质的正常茭，降低田间灰茭率，使茭白收益提高。

SNP标记的原理是：生物体内经常发生单核苷酸变异(缺失，***，移码)，这种变异的结果成为单核苷酸多态性。尽管SNPs大多位于非编码区，但与生物体表型有非常密切的关系。随着高通量测序技术的发展，大量的SNPs被解析出来，也极大地推动了基因组层面评估遗传多样性的研究。由于SNP数据量非常庞大，因此基于SNP开发的分子标记具有较高的精准度。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法的技术方案。本发明通过对茭白内生菰黑粉菌作SNP扫描，筛选出多个与茭白表型特征相关的分子标记，从而建立起茭白表型筛选分子标记辅助选择体系，提高正常茭的选择效率，为茭白高效选育奠定基础。

所述的一种鉴定茭白表型特征的分子标记，其特征在于包括分子标记UeG1、UeG2、UeG3、UeG4、UeG5和UeG6，所述分子标记UeG1的正向引物UeGSNP1-F核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物UeGSNP1-R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述分子标记UeG2的正向引物UeGSNP2-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物UeGSNP2-R核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述分子标记UeG3的正向引物UeGSNP3-F核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物UeGSNP3-R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述分子标记UeG4的正向引物UeGSNP4-F核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物UeGSNP4-R核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述分子标记UeG5的正向引物UeGSNP5-F核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物UeGSNP5-R核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述分子标记UeG6的正向引物UeGSNP6-F核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物UeGSNP6-R核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

所述的分子标记在茭白育种中的应用。

所述的分子标记在茭白育种中鉴定茭白表型特征中的应用。

所述的分子标记的获得方法，其特征在于包括以下步骤：

a、茭白表型特征的鉴定：选取不同地区不同表型的茭白品种并记录；

b、群体分析

1)分离培养茭白中的菰黑粉菌；

2)CTAB法提取菰黑粉菌基因组DNA；

3)将47个不同表型特征的茭白的菰黑粉菌基因组DNA进行基因组二代重测序；

4)扫描得到所有SNP；

5)筛选出在正常茭白菰黑粉菌和灰茭菰黑粉菌的差异SNP位点；

6)选取36个采集自不同地区的茭白分离菰黑粉菌对筛选得到的SNP位点进行验证；

c、使用其他具有表型特性的品种鉴定筛选的SNP位点并获得图谱；共获得6对具有表型筛选特性的分子标记UeG1、UeG2、UeG3、UeG4、UeG5和UeG6。

所述的分子标记的获得方法，其特征在于步骤a中茭白表型特征的鉴定具体为：从浙江省桐乡市、浙江省金华市、浙江省缙云县、浙江省余姚市、浙江省杭州市以及江苏省苏州市搜集不同品种的茭白，同品种茭白在同一块大田搜集正常茭和灰茭数个；采收时选取茭形完整、个头中等、茭叶无病害的茭白。

所述的分子标记的获得方法，其特征在于所述的步骤b的1)中分离培养茭白中的菰黑粉菌具体为：

1)灰茭菰黑粉菌分离培养方法

a、用灭菌枪头挑取少量灰孢子，

b、涂布至YEPS培养基上培养3-5d；

2)正常茭菰黑粉菌分离培养方法

a、将茭白茎部切碎，置于无菌研钵中，加入1mL无菌水，细细研磨；

b、吸取200μL研磨后的混合液涂布至添加50μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的YEPS培养基中，28℃培养4-6d。

所述的获得方法，其特征在于步骤b的5)中筛选出在正常茭白菰黑粉菌和灰茭菰黑粉菌的差异SNP位点具体为：

a、将所有SNP数据标记为A、B两类，代表正常茭、灰茭两个表型。

b、计算机自动识别A、B两类所有的SNP并归类；输出格式为Genotyping*simple-A/B.txt.；数据内容为SNP_site a/b,a代表具有该SNP的个数，b代表一类的总个数。

c、将数据复制至Excel工作表，使用筛选功能，选取只在A类中为1，B类中为0的SNP。

所述的获得方法，其特征在于步骤b的6)中选取36个采集自不同地区的茭白分离菰黑粉菌对筛选得到的SNP位点进行验证具体包括：

a、将48个采集自不同地区的茭白进行研磨分离；

b、提取全部菰黑粉菌基因组DNA；

c、针对获得的SNP数据设计AS-PCR引物；

d、选取典型表型特征的茭白菰黑粉菌DNA进行AS-PCR验证，验证获得10个具有多态性的SNP位点；针对这10个SNP位点设计HRM检测扩增引物，即；

e、将48个茭白菰黑粉菌DNA用10对HRM引物扩增，PCR产物用于HRM检测；

f、用不同颜色的曲线标记表型特性。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明以47个具有表型特征的茭白的基因组重测序数据为基础，扫描得到SNP数据，并且通过有效手段筛选得到表型特征相关联位点。结合48种不同地区不同表型的茭白菰黑粉菌为对象的鉴定结果，筛选出表型相关的分子标记。

2)研究周期短，以各个地区茭白品种为材料，可以排除环境因子对茭白表型的干扰。

3)SNP标记基于基因组重测序数据，具有良好的精准度，且位点丰富，信息量大，筛选的位点更具可靠性；

4)茭白田间管理难度大，灰茭产生不确定性高，通过SNP标记筛选灰茭，可以对正常茭白提早选择，减少工作量，提高筛选效率。

附图说明

图1为8个同品种不同表型茭白菰黑粉菌39对引物AS-PCR多态性结果；

图2为实施例3中LightScanner高分辨熔解曲线；

图3为6个SNP位点在48种茭白菰黑粉菌中的分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实验方法种如无特殊说明，均为常规方法。实施例种除实验材料以外其他均可通过商业途径购买获得。

实施例1：试验材料及表型特征分类

以下试验材料分别来源于浙江省金华市农业科学研究院、浙江省丽水市缙云县农业局、浙江省宁波市余姚市农业科学研究所、江苏省苏州市农业科学研究院、浙江省嘉兴市桐乡市董家茭白合作社、浙江省绍兴市嵊州市普惠蔬菜合作社、浙江省台州市黄岩区蔬菜研究所、浙江省杭州市中国计量大学生命科学学院。样品采收时间在2016年秋季、2017年秋季、2018年夏季、2018年秋季。

表1供试样品品种、表型及来源

实施例2：群体分析

1)采用CTAB法提取菰黑粉菌基因组DNA，用核酸微量测定仪测定DNA浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。用ddH₂O稀释至100ng/μL，置于-20℃保存。

2)将不同表型的的47个茭白品种的DNA送去二代重测序，。参考基因组为菰黑粉菌MT型基因组，WGS INSDC:JTLW00000000.1。

3)测序数据用GATK、SAMTOOLS、BWA软件比对至参考基因组，获得SNP数据文件。共获得321659个SNP位点。

4)将所有参与SNP扫描的菰黑粉菌样品编号为A、B两类，分别代表正常茭、灰茭两类。通过提取SNP扫描结果中的Genotype数据，将A、B两类的SNP数据输出为SNP c a/b格式，a代表在第c个SNP位点该类SNP个数，b代表该类样品总个数。将输出结果一并粘贴至Excel工作表中，运用Excel筛选功能，筛选出灰茭中为b/b，正常茭中为0/b的SNP位点。(在本例中，A为32，B为15，因此选出SNP c＝(A列＝0/32，C列＝15/15)共1330个SNP位点。

实施例3：SNP位点鉴定

1)在1330个筛选得到的SNP位点中每间隔20个挑选1个SNP位点作为验证位点。同时由于参考基因组测序质量问题，需排除在参考基因组较为靠后的contig中的SNP位点，一共筛选出39个可用于验证的SNP位点，并设计相关引物。

2)AS-PCR(等位基因特异性PCR)，AS-PCR是利用引物3‘端碱基错配能使PCR延伸程序中断致使无扩增产物的原理，在检测SNP、等位基因基因型方面有重要作用。本例设计了40对AS-PCR引物，所有引物已附表2

表2等位基因特异性PCR引物序列表

3)本例使用8个同品种不同表型的的茭白菰黑粉菌DNA作为模板验证上表SNP位点的多态性。

4)AS-PCR体系：1μL菰黑粉菌基因组DNA；0.4μM正向引物；0.4μM反向引物；5μL 2×Taq Master Plus Mix；3.2μL ddH₂O。

5)AS-PCR程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性30s；65℃退火30s；72℃延伸15s；共34个循环；72℃彻底延伸7min；12℃保存。

6)将所有PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，检测条带有无。

7)电泳验证结果，如图1所示：1代表有条带；0代表条带；N代表非特异性条带；带*代表该位点在表型中具有多态性。

8)本例中将10个具有多态性的位点进行进一步的检测，检测方法为HRM曲线(高分辨率熔解曲线)。

9)HRM的主要原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。其优势在于成本低廉，单次检测量大，精确度高，检测后的样品可继续用于其他实验，且可以用于区分等位基因纯合子和杂合子。

10)本例中针对上述10个SNP位点设计16对HRM检测片段扩增引物。所有引物已附表3。

表3 HRM检测片段扩增引物

11)本例中使用48种具有不同表型特征的茭白(表1中第48-95个品种)菰黑粉菌DNA作为模板验证步骤7)中筛选得到的10个多态性SNP位点。

12)HRM-PCR体系：1μL菰黑粉菌基因组DNA；0.6μM正向引物；0.6μM反向引物；7.5μL2×Taq Master Plus Mix；5.3μL ddH₂O。

13)HRM-PCR程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性30s；65℃退火30s；72℃延伸15s；共40个循环；72℃彻底延伸7min；12℃保存。

14)向所有PCR产物的孔里加1μL 5×Eva Green荧光染料，封口1000rpm离心15s，然后加20μL矿物油封闭。

15)94℃变性2min，使荧光染料充分结合到DNA双链中。

16)使用LightScanner高分辨熔解曲线***检测产物，检测结果如图2所示。

17)结果显示，HRMG-1、HRMG-3、HRMG-6、HRMG-7、HRMG-9、HRMG-10、对茭白表型特征分型较明显，分别命名为分子标记UeG1、UeG2、UeG3、UeG4、UeG5和UeG6。

18)6个SNP位点在48种茭白菰黑粉菌中的分布如图3所示。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 1

cgaccgcatt acaaactcag caa 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 2

gaacctgtca accagctcgg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

ggaaggacgg taggacgagg tt 22

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

agcaccaata gtcttgaggt tagcatag 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 5

ccagcggagc atcacgaaca 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 6

agccaatcat cacgaccacc atac 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 7

cgctcaatgt gacgcagaaa ggt 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 8

gccgctgaag acgaggaaga gt 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 9

atcacctctc gcagtagcat cag 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 10

gcaccttgtc gccgtcattg 20

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 11

aggactgtag gatctggaaa ctgtga 26

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 12

ctcattagca gccaagttga tactattgac 30

Claims

1.一种鉴定茭白表型特征的分子标记，其特征在于包括分子标记UeG1、UeG2、UeG3、UeG4、UeG5和UeG6，所述分子标记UeG1的正向引物UeGSNP1-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物UeGSNP1-R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述分子标记UeG2的正向引物UeGSNP2-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物UeGSNP2-R核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述分子标记UeG3的正向引物UeGSNP3-F核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物UeGSNP3-R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述分子标记UeG4的正向引物UeGSNP4-F核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物UeGSNP4-R核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述分子标记UeG5的正向引物UeGSNP5-F核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物UeGSNP5-R核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述分子标记UeG6的正向引物UeGSNP6-F核苷酸序列如SEQID NO.11所示，反向引物UeGSNP6-R核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.如权利要求1所述的分子标记在茭白育种中的应用。

3.如权利要求1所述的分子标记在茭白育种中鉴定茭白表型特征中的应用。

4.如权利要求1所述的分子标记的获得方法，其特征在于包括以下步骤：

b、群体分析

1)分离培养茭白中的菰黑粉菌；

2)CTAB法提取菰黑粉菌基因组DNA；

4)扫描得到所有SNP；

5.如权利要求4所述的分子标记的获得方法，其特征在于步骤a中茭白表型特征的鉴定具体为：从浙江省桐乡市、浙江省金华市、浙江省缙云县、浙江省余姚市、浙江省杭州市以及江苏省苏州市搜集不同品种的茭白，同品种茭白在同一块大田搜集正常茭和灰茭数个；采收时选取茭形完整、个头中等、茭叶无病害的茭白。

6.权利要求4所述的分子标记的获得方法，其特征在于所述的步骤b的1)中分离培养茭白中的菰黑粉菌具体为：

1)灰茭菰黑粉菌分离培养方法

a、用灭菌枪头挑取少量灰孢子，

b、涂布至YEPS培养基上培养3-5d；

2)正常茭菰黑粉菌分离培养方法

7.如权利要求4所述的获得方法，其特征在于步骤b的5)中筛选出在正常茭白菰黑粉菌和灰茭菰黑粉菌的差异SNP位点具体为：

8.如权利要求4所述的获得方法，其特征在于步骤b的6)中选取36个采集自不同地区的茭白分离菰黑粉菌对筛选得到的SNP位点进行验证具体包括：

a、将48个采集自不同地区的茭白进行研磨分离；

b、提取全部菰黑粉菌基因组DNA；

c、针对获得的SNP数据设计AS-PCR引物；

f、用不同颜色的曲线标记表型特性。