CN109679989A - 一种提高碱基编辑***编辑效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高碱基编辑***编辑效率的方法。该方法包括如下步骤：使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑；受体为植物愈伤组织；导入植物愈伤组织的过程中，使用潮霉素作为筛选剂筛选抗性愈伤组织；潮霉素的浓度为35‑80mg/L。实验证明，提高筛选剂潮霉素的浓度，可以提高SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***和rAPOBEC1&SpCas9n&UGI碱基编辑***的C→T碱基替换效率，进而获得高效获得突变体。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种提高碱基编辑***编辑效率的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高碱基编辑***编辑效率的方法。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率(即C→T碱基替换效率)。

PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sealamprey)是一种胞苷脱氨酶。在所测试的PmCDA1编辑器中，SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI))的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracil DNAglycosylase，UDG)催化清除DNA中尿嘧啶(Uracil，U)，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。SpCas9n(D10A)连带着PmCDA1通过sgRNA定位到靶点，PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成U，通过DNA的修复使得U与A(腺嘌呤，Adenine)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。

为了提高工作效率，降低工作成本，C→T碱基替换效率的提高一直是植物基因组碱基编辑***的研究方向。

发明内容

本发明的目的是提高碱基编辑***的编辑效率。

本发明首先保护提高碱基编辑***编辑效率的方法。

本发明要保护的提高碱基编辑***编辑效率的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

上述方法一中，所述“使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶”可通过将所述sgRNA的编码基因、所述抗潮霉素蛋白的编码基因、所述Cas9蛋白的编码基因和所述胞嘧啶脱氨酶编码基因导入受体实现。具体的，可以放在一个载体中导入受体，也可以放在不同的载体中分别导入受体。

本发明要保护的提高碱基编辑***编辑效率的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

上述方法二中，所述“使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂”可通过将所述sgRNA的编码基因、所述抗潮霉素蛋白的编码基因、所述Cas9蛋白的编码基因、所述胞嘧啶脱氨酶编码基因和所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的编码基因导入受体实现。具体的，可以放在一个载体中导入受体，也可以放在不同的载体中分别导入受体。

上述任一所述的方法中，所述受体可为植物愈伤组织。

上述任一所述的方法中，“导入植物愈伤组织”可经过侵染、共培养、筛选步骤，得到编辑后的植物愈伤组织。其中在筛选步骤用潮霉素作为筛选剂处理植物愈伤组织。

上述任一所述的方法中，所述导入受体的过程中，可使用潮霉素作为筛选剂筛选抗性愈伤组织。所述潮霉素的浓度为35-80mg/L(如35-50mg/L、50-80mg/L、35mg/L、50mg/L或80mg/L)。在碱基编辑***的编辑效率未达到饱和之前(即碱基编辑***编辑窗口中还有C没有转换为T)，作为筛选剂的潮霉素的浓度越高，则碱基编辑***的编辑效率越高。

上述任一所述的方法中，所述抗潮霉素蛋白可为潮霉素磷酸转移酶。潮霉素磷酸转移酶的氨基酸序列可由序列表中序列1自5’末端起第10786至11811位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述潮霉素磷酸转移酶的基因可如序列表中序列1自5’末端起第10786至11811位所示。

上述任一所述的方法中，所述Cas9蛋白可为SpCas9n蛋白。SpCas9n蛋白的氨基酸序列可由序列表中序列1自5’末端起第3010至7278位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述SpCas9n蛋白的基因可如序列表中序列1自5’末端起第3010至7278位所示。

上述任一所述的方法中，所述胞嘧啶脱氨酶可为PmCDA1或rAPOBEC1。PmCDA1的氨基酸序列可由序列表中序列1自5’末端起第7570至8193位所示的核苷酸序列翻译而成。rAPOBEC1的氨基酸序列可由序列表中序列2自5’末端起第3010至3696位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述PmCDA1的基因可如序列表中序列1自5’末端起第7570至8193位所示。编码所述rAPOBEC1的基因可如序列表中序列2自5’末端起第3010至3696位所示。

上述任一所述的方法中，所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的氨基酸序列可由序列表中序列1自5’末端起第8215至8511位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的基因可如序列表中序列1自5’末端起第8215至8511位所示。

上述任一所述的方法中，所述sgRNA可根据受体基因组中预期进行碱基编辑的靶基因设计。

上述任一所述的方法中，所述植物可为a1)或a2)或a3)：a1)禾本科植物；a2)水稻；a3)水稻品种日本晴。

上述任一所述方法可使碱基编辑***的编辑效率显著提高。在碱基编辑***的编辑效率未达到饱和之前，作为筛选剂的潮霉素的浓度越高，则碱基编辑***的编辑效率越高。

本发明还保护X1)或X2)。

X1)潮霉素在提高碱基编辑***编辑效率中的应用。

X2)潮霉素在碱基编辑***编辑受体基因组中的应用。

上述任一所述编辑可为C→T碱基替换。

上述任一所述编辑效率可为C→T碱基替换效率。

在本发明的一个实施例中，本发明的发明人构建了载体SpCas9n&PmCDA1&UGI。载体SpCas9n&PmCDA1&UGI中的sgRNA根据表1的三个靶点设计。载体SpCas9n&PmCDA1&UGI(环形)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列1中，自5’至3’起，第131至467位为OsU3启动子的核苷酸序列，第474至550位、第647至723位和第820至896位均为pre-tRNA的核苷酸序列，第551至570位为CS650的核苷酸序列，第571至646位、第744至819位和第917至992位均为sgRNA骨架的核苷酸序列，第724至743位为CS651的核苷酸序列，第897至916位为CS652的核苷酸序列，第993至1283位为OsU3终止子的核苷酸序列，第1290至3003位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3010至7278位为SpCas9n蛋白的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第7570至8193位为PmCDA1的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8215至8511位为UGI的核苷酸序列，第8518至8712位为35S终止子的核苷酸序列，第8787至10779位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第10786至11811位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列，第11812至12064位为Nos终止子的核苷酸序列。将载体SpCas9n&PmCDA1&UGI导入水稻品种日本晴(即受体)，以潮霉素作为筛选剂(潮霉素浓度为35mg/L、50mg/L或80mg/L)，得到抗性愈伤；统计阳性抗性愈伤中的C→T碱基替换效率。结果表明，SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***对三个靶点的C→T碱基替换效率均较高；筛选时随着潮霉素浓度的增加，靶点的C→T碱基替换效率也随之增加，且当潮霉素的浓度达到50mg/L时，靶点的C→T碱基替换效率基本达到饱和。并且，筛选时随着潮霉素浓度的增加，抗性愈伤阳性率基本不受影响，均保持较高水平。

在本发明的另一个实施例中，本发明的发明人构建了载体rAPOBEC1&SpCas9n&UGI。载体rAPOBEC1&SpCas9n&UGI中的sgRNA根据表1中的CS650和CS652设计。载体rAPOBEC1&SpCas9n&UGI(环形)的核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列2中，自5’至3’起，第131至467位为OsU3启动子的核苷酸序列，第474至550位和第820至896位均为pre-tRNA的核苷酸序列，第551至570位为CS650的核苷酸序列，第571至646位和第917至992位均为sgRNA骨架的核苷酸序列，第897至916位为CS652的核苷酸序列，第993至1283位为OsU3终止子的核苷酸序列，第1290至3003位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3010至3696位为rAPOBEC1的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第3745至8013位为SpCas9n的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8020至8316位为UGI的核苷酸序列，第8323至8517位为35S终止子的核苷酸序列，第8592至10584位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第10591至11616位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列，第11643至11858位为CaMV35S polyA的核苷酸序列。将rAPOBEC1&SpCas9n&UGI碱基编辑***导入水稻品种日本晴，以潮霉素作为筛选剂(潮霉素浓度为35mg/L、50mg/L或80mg/L)，得到抗性愈伤；统计阳性抗性愈伤中的C→T碱基替换效率。结果表明，与SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***相比，rAPOBEC1&SpCas9n&UGI碱基编辑***对CS650和CS652的C→T碱基替换效率均较低；但随着筛选培养基中潮霉素浓度的增加，靶点的C→T碱基替换效率也随之增加；对于靶点CS652，当筛选培养基中潮霉素的浓度达到50mg/L时，靶点的C→T碱基替换效率基本达到饱和。并且，筛选时随着潮霉素浓度的增加，抗性愈伤阳性率均保持较高水平。

实验证明，提高作为筛选剂的潮霉素的浓度，可以提高SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***和rAPOBEC1&SpCas9n&UGI碱基编辑***的编辑效率(即C→T碱基替换效率)。由此可见，提高作为筛选剂的潮霉素的浓度，可以在不影响抗性愈伤阳性率的情况下，提高碱基编辑***编辑受体基因组的C→T碱基替换效率，进而高效获得突变体。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***的C→T碱基替换效率的实验结果。

图2为rAPOBEC1&SpCas9n&UGI碱基编辑***的C→T碱基替换效率的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例1选择表1中第2列所示的三个靶点进行实验，实施例2选择表1中第2列所示的两个靶点进行实验，靶点序列见表1中第3列，对应的靶基因见表1中第1列。

表1

靶基因	靶点名称	靶点序列
			OsALS	CS650	cgcgtccatggagatccacc
OsCDC48	CS651	gaccagccagcgtctggcgc
			OsNRT1.1B	CS652	cggcgacggcgagcaagtgg

引物对650由引物CS650-F：5’-taagaaccaccagcgacacc-3’和引物CS650-R：5’-ggtaattgtgcttggtgatggag-3’组成，用于扩增CS650。

引物对651由引物CS651-F：5’-acatcgagatggagaagcgg-3’和引物CS651-R：5’-ccatgctccaatcgatgaatac-3’组成，用于扩增CS651。

引物对652由引物CS652-F：5’-ttacgaactttataactttgtcgg-3’和引物CS652-R：5’-atggaggcgatgaggaagac-3’组成，用于扩增CS652。

C→T碱基替换效率＝发生C→T碱基替换的水稻阳性抗性愈伤块数/20×100％。

实施例1、高浓度潮霉素筛选提高SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***对靶点的C→T碱基替换效率

一、基因编辑载体的构建

本发明的发明人构建了载体SpCas9n&PmCDA1&UGI。

载体SpCas9n&PmCDA1&UGI(环形)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列1中，自5’至3’起，第131至467位为OsU3启动子的核苷酸序列，第474至550位、第647至723位和第820至896位均为pre-tRNA的核苷酸序列，第551至570位为CS650的核苷酸序列，第571至646位、第744至819位和第917至992位均为sgRNA骨架的核苷酸序列，第724至743位为CS651的核苷酸序列，第897至916位为CS652的核苷酸序列，第993至1283位为OsU3终止子的核苷酸序列，第1290至3003位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3010至7278位为SpCas9n的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第7570至8193位为PmCDA1的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8215至8511位为UGI的核苷酸序列，第8518至8712位为35S终止子的核苷酸序列，第8787至10779位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第10786至11811位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列，第11812至12064位为Nos终止子的核苷酸序列。

二、在愈伤中进行基因编辑

1、将载体SpCas9n&PmCDA1&UGI导入农杆菌LBA4404(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#为AC1030)，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌接种至含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基，28℃、150rpm震荡培养，得到OD600nm为1.0-2.0的培养菌液；取所述培养菌液，室温、10000rpm离心1min，收集菌体；取所述菌体，用侵染液重悬并稀释至OD600nm为0.2，得到农杆菌侵染液。

侵染液为将N6液体培养基中的糖分替换为葡萄糖和蔗糖得到；侵染液中，葡萄糖的浓度为10g/L，蔗糖的浓度为20g/L。

3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到愈伤。

4、完成步骤3后，将愈伤置于含100μM乙酰丁香酮的农杆菌侵染液中浸泡10min，然后先置于铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200mL侵染液)上，21℃暗培养1天；然后将愈伤置于恢复培养基(含有200mg/L特美汀的N6固体培养基)上，25-28℃暗培养3天。

5、取步骤4得到的愈伤，置于筛选培养基(含35mg/L潮霉素的N6固体培养基、含50mg/L潮霉素的N6固体培养基或含80mg/L潮霉素的N6固体培养基)，28℃暗培养2周。

6、取步骤5得到的愈伤，再次置于筛选培养基，28℃暗培养2周，得到抗性愈伤。

7、分别提取48块抗性愈伤的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-attatgtagcttgtgcgtttcg-3’)和引物R(5’-gatgaagagcttatcgacgt-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约1150bp的DNA片段，则相应的抗性愈伤为阳性抗性愈伤；如果PCR扩增产物中不含有约1150bp的DNA片段，则相应的抗性愈伤不为阳性抗性愈伤。

统计抗性愈伤阳性率。抗性愈伤阳性率为48块抗性愈伤中阳性抗性愈伤所占的比例。

抗性愈伤阳性率统计结果见表2中第2列。结果表明，SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***中，筛选培养基中的潮霉素浓度在35-80mg/L之间时，抗性愈伤阳性率均较高，达到70％以上。

表2

筛选培养基中的潮霉素浓度	抗性愈伤阳性率
		35mg/L	72.1％
50mg/L	87.1％
		80mg/L	70.7％

8、分别以步骤7获得的20块阳性抗性愈伤的基因组DNA作为模板，采用引物对650、引物对651或引物对652进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

9、将步骤8得到的PCR扩增产物进行测序。

测序结果如下：对于CS650，发生C→T碱基替换的位点对应为cgTgtccatggagatccacc；对于CS651，发生C→T碱基替换的位点对应为gaTTagccagcgtctggcgc；对于CS652，发生C→T碱基替换的位点对应为cggTgacggcgagcaagtgg、Tggcgacggcgagcaagtgg或TggTgacggcgagcaagtgg。

分别统计CS650、CS651和CS652的C→T碱基替换效率。统计结果见图1(Hpt-35为含35mg/L潮霉素的N6固体培养基，Hpt-50为含50mg/L潮霉素的N6固体培养基，Hpt-80为含80mg/L潮霉素的N6固体培养基)。结果表明，SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***对三个靶点的C→T碱基替换效率均较高；随着筛选培养基中潮霉素浓度的增加，靶点的C→T碱基替换效率也随之增加，且当筛选培养基中潮霉素的浓度达到50mg/L时，靶点的C→T碱基替换效率基本达到饱和。

实施例2、高浓度潮霉素筛选提高rAPOBEC1&SpCas9n&UGI碱基编辑***对靶点的C→T碱基替换效率

一、基因编辑载体的构建

本发明的发明人构建了载体rAPOBEC1&SpCas9n&UGI。

载体rAPOBEC1&SpCas9n&UGI(环形)的核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列2中，自5’至3’起，第131至467位为OsU3启动子的核苷酸序列，第474至550位和第820至896位均为pre-tRNA的核苷酸序列，第551至570位为CS650的核苷酸序列，第571至646位和第917至992位均为sgRNA骨架的核苷酸序列，第897至916位为CS652的核苷酸序列，第993至1283位为OsU3终止子的核苷酸序列，第1290至3003位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3010至3696位为rAPOBEC1的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第3745至8013位为SpCas9n的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8020至8316位为UGI的核苷酸序列，第8323至8517位为35S终止子的核苷酸序列，第8592至10584位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第10591至11616位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列，第11643至11858位为CaMV35S polyA的核苷酸序列。

二、在水稻愈伤中进行基因编辑

1、按照实施例1二中1-7的步骤，将载体SpCas9n&PmCDA1&UGI替换为载体rAPOBEC1&SpCas9n&UGI，其它步骤均不变，得到阳性抗性愈伤。

统计抗性愈伤阳性率。抗性愈伤阳性率为48块抗性愈伤中阳性抗性愈伤所占的比例。

抗性愈伤阳性率统计结果见表3中第2列。结果表明，rAPOBEC1&SpCas9n&UGI碱基编辑***中，筛选培养基中的潮霉素浓度在35-80mg/L之间时，抗性愈伤阳性率均较高，达到60％以上。

表3

筛选培养基中的潮霉素浓度	抗性愈伤阳性率
		35mg/L	62.8％
50mg/L	68.9％
		80mg/L	75.4％

2、分别以步骤1获得的20块阳性抗性愈伤的基因组DNA作为模板，采用引物对650或引物对652进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。。

3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序。

测序结果如下：对于CS650，发生C→T碱基替换的位点对应为

cgTgtccatggagatccacc；对于CS652，发生C→T碱基替换的位点对应为

cggTgacggcgagcaagtgg、Tggcgacggcgagcaagtgg或TggTgacggcgagcaagtgg。

分别统计CS650和CS652的C→T碱基替换效率。统计结果见图2(Hpt-35为含35mg/L潮霉素的N6固体培养基，Hpt-50为含50mg/L潮霉素的N6固体培养基，Hpt-80为含80mg/L潮霉素的N6固体培养基)。结果表明，与SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑***相比，rAPOBEC1&SpCas9n&UGI碱基编辑***对CS650和CS652的C→T碱基替换效率均较低；但随着筛选培养基中潮霉素浓度的增加，靶点的C→T碱基替换效率也随之增加；对于靶点CS652，当筛选培养基中潮霉素的浓度达到50mg/L时，靶点的C→T碱基替换效率基本达到饱和。

上述结果表明，随着筛选培养基中潮霉素浓度的增加，靶点的C→T碱基替换效率也随之增加。

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种提高碱基编辑***编辑效率的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18476

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacatg gcactagcct caccgtcttc gcagacgagg 60

ccgctaagtc gcagctacgc tctcaacggc actgactagg tagtttaaac gtgcacttaa 120

ttaaggtacc gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg 180

tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg 240

gaagccggga acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt 300

aggagaaaag catttcgtag tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg 360

ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc 420

acatagatca aagctgattt aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcgga tccaacaaag 480

caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc 540

ggctggtgca cgcgtccatg gagatccacc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 600

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcaaca aagcaccagt 660

ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt 720

gcagaccagc cagcgtctgg cgcgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 780

gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgca acaaagcacc agtggtctag 840

tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcacggc 900

gacggcgagc aagtgggttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 960

atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt ttcgttttgc attgagtttt 1020

ctccgtcgca tgtttgcagt tttattttcc gttttgcatt gaaatttctc cgtctcatgt 1080

ttgcagcgtg ttcaaaaagt acgcagctgt atttcactta tttacggcgc cacattttca 1140

tgccgtttgt gccaactatc ccgagctagt gaatacagct tggcttcaca caacactggt 1200

gacccgctga cctgctcgta cctcgtaccg tcgtacggca cagcatttgg aattaaaggg 1260

tgtgatcgat actgcttgct gctaagctta caaattcggg tcaaggcgga agccagcgcg 1320

ccaccccacg tcagcaaata cggaggcgcg gggttgacgg cgtcacccgg tcctaacggc 1380

gaccaacaaa ccagccagaa gaaattacag taaaaaaaaa gtaaattgca ctttgatcca 1440

ccttttatta cctaagtctc aatttggatc acccttaaac ctatcttttc aatttgggcc 1500

gggttgtggt ttggactacc atgaacaact tttcgtcatg tctaacttcc ctttcagcaa 1560

acatatgaac catatataga ggagatcggc cgtatactag agctgatgtg tttaaggtcg 1620

ttgattgcac gagaaaaaaa aatccaaatc gcaacaatag caaatttatc tggttcaaag 1680

tgaaaagata tgtttaaagg tagtccaaag taaaacttat agataataaa atgtggtcca 1740

aagcgtaatt cactcaaaaa aaatcaacga gacgtgtacc aaacggagac aaacggcatc 1800

ttctcgaaat ttcccaaccg ctcgctcgcc cgcctcgtct tcccggaaac cgcggtggtt 1860

tcagcgtggc ggattctcca agcagacgga gacgtcacgg cacgggactc ctcccaccac 1920

ccaaccgcca taaataccag ccccctcatc tcctctcctc gcatcagctc cacccccgaa 1980

aaatttctcc ccaatctcgc gaggctctcg tcgtcgaatc gaatcctctc gcgtcctcaa 2040

ggtacgctgc ttctcctctc ctcgcttcgt ttcgattcga tttcggacgg gtgaggttgt 2100

tttgttgcta gatccgattg gtggttaggg ttgtcgatgt gattatcgtg agatgtttag 2160

gggttgtaga tctgatggtt gtgatttggg cacggttggt tcgataggtg gaatcgtggt 2220

taggttttgg gattggatgt tggttctgat gattgggggg aatttttacg gttagatgaa 2280

ttgttggatg attcgattgg ggaaatcggt gtagatctgt tggggaattg tggaactagt 2340

catgcctgag tgattggtgc gatttgtagc gtgttccatc ttgtaggcct tgttgcgagc 2400

atgttcagat ctactgttcc gctcttgatt gagttattgg tgccatgggt tggtgcaaac 2460

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ttagacatgg ttcaattatg tagcttgtgc gtttcgattt gatttcatat gttcacagat 2580

tagataatga tgaactcttt taattaattg tcaatggtaa ataggaagtc ttgtcgctat 2640

atctgtcata atgatctcat gttactatct gccagtaatt tatgctaaga actatattag 2700

aatatcatgt tacaatctgt agtaatatca tgttacaatc tgtagttcat ctatataatc 2760

tattgtggta atttcttttt actatctgtg tgaagattat tgccactagt tcattctact 2820

tatttctgaa gttcaggata cgtgtgctgt tactacctat ctgaatacat gtgtgatgtg 2880

cctgttacta tctttttgaa tacatgtatg ttctgttgga atatgtttgc tgtttgatcc 2940

gttgttgtgt ccttaatctt gtgctagttc ttaccctatc tgtttggtga ttatttcttg 3000

cagtacgtaa tggactacaa ggaccacgac ggggattaca aagaccacga catagactac 3060

aaggatgacg atgacaaaat ggcaccgaag aaaaaaagga aggtcggaat ccatggcgtt 3120

ccagctgccg ataagaaata ttccatcgga ctcgccattg gcacgaatag cgtcggatgg 3180

gctgttatta ctgatgagta caaagttccg tctaagaagt tcaaggtgct gggcaacaca 3240

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gcagaagcga caagattgaa aaggactgcg agaaggcgct atacacggcg taagaataga 3360

atctgctacc ttcaggagat tttctctaac gaaatggcta aggtcgatga cagtttcttt 3420

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agcagaaggt tggagaacct gatcgctcaa cttcctggag aaaagaaaaa cggtcttttt 3840

gggaatttga ttgccttgtc tctgggcctc acaccaaact tcaagtcaaa ttttgacctc 3900

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ctggcacaaa ttggcgacca gtacgcggat ctgttcctcg cagcgaagaa tctgagtgat 4020

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gtgcggcagc aattgccaga gaagtacaaa gaaatcttct ttgaccaatc taagaacgga 4200

tacgctggct atattgatgg aggagcttct caggaggaat tctataagtt tatcaaacct 4260

atacttgaga agatggatgg tacagaggaa ctccttgtta aattgaacag agaagatttg 4320

ctgcgcaagc aacggacctt tgacaacgga tcaattccgc atcagataca cctcggcgag 4380

cttcatgcca tccttcgccg gcaggaagat ttctacccct ttttgaagga caaccgcgag 4440

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gaggaagttg tggacaaggg agcttctgcc caatcattca ttgagaggat gactaacttc 4620

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accgtgtata acgaacttac gaaggttaaa tacgtgactg agggtatgag gaagccagca 4740

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gtgacagtca agcagctcaa agaggattat ttcaagaaaa ttgaatgttt cgactctgtg 4860

gagatatcag gagtcgaaga taggtttaac gcttcccttg gcacatacca tgacctcctt 4920

aagatcatta aggacaaaga tttcctggat aacgaggaaa atgaggacat cctcgaagat 4980

attgttctta ccttgacgct gtttgaggat cgcgaaatga tcgaggaacg gcttaagacg 5040

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gacgatagtc tcaccttcaa agaggacata cagaaggctc aagtgagtgg tcaaggggat 5280

tcgctgcatg aacacatcgc aaacctcgcg ggttcaccgg ccataaagaa aggaatcctt 5340

caaactgtta aggtcgttga tgagttggtt aaagtgatgg gtaggcacaa gcccgaaaac 5400

atagtgatcg agatggctcg cgaaaatcag actacacaaa aagggcagaa gaactctcgc 5460

gagcggatga aaaggattga ggaaggaatc aaggaactgg gctcacagat tctcaaagag 5520

catccagtcg aaaacacaca gctgcaaaat gagaagctct atctttacta tctccaaaat 5580

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aggaaaatga tagctaagag tgagcaggag atcggtaaag caactgcgaa gtatttcttt 6240

tactcgaaca tcatgaattt ctttaagacc gagataacgc tggcaaatgg cgaaattaga 6300

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gttgcttaca gcgtgctggt cgttgccaag gtcgagaagg gtaaatccaa gaaactcaaa 6600

agcgttaagg aactccttgg gattactatc atggagagat cttcattcga aaagaatcct 6660

atcgactttc ttgaggccaa aggatataag gaagttaaga aagatctgat aatcaaactc 6720

ccaaagtact cattgtttga gctggaaaac ggcaggaagc gcatgcttgc ttccgccgga 6780

gagttgcaga aagggaacga gttggctctg ccttctaagt atgttaactt cctctatctt 6840

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gtcgagcaac ataagcacta tttggatgag attatagaac agatcagtga attctcgaaa 6960

agggttatcc ttgcagatgc gaatcttgac aaggtgttgt ctgcatacaa caaacataga 7020

gataagccga tcagggagca agcggaaaat atcattcacc tcttcactct tacaaacttg 7080

ggtgctcccg ctgccttcaa gtattttgat accacgattg accggaaacg ttacacctca 7140

acgaaggagg tgctggatgc caccctcatc caccaatcta ttaccggact ctacgagact 7200

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caggctaaga agaagaaaga gctcggagga ggaggcacgg gaggaggagg ctccgccgag 7320

tatgtgcgcg cgctcttcga cttcaacggc aatgacgagg aggatctccc tttcaagaag 7380

ggcgacatcc tccgcatccg cgataagccg gaggagcagt ggtggaacgc agaggactcc 7440

gagggcaagc ggggcatgat cctggtgcca tacgtcgaga agtacagcgg cgattacaag 7500

gaccacgatg gcgactacaa ggatcatgac atcgattaca aggacgatga cgataagtcc 7560

ggcgtcgaca tgacggacgc ggagtatgtg cgcatccacg agaagctcga tatctacacc 7620

ttcaagaagc agttcttcaa caataagaag tcggtgtccc atcggtgcta cgtcctcttc 7680

gagctgaagc gcaggggaga gcgccgcgcc tgcttctggg gctacgcggt gaataagccg 7740

cagtcaggca cagagcgcgg catccacgcc gagatcttct cgatccggaa ggtcgaggag 7800

tacctccgcg acaacccagg ccagttcacg atcaattggt actccagctg gtccccttgc 7860

gcagattgcg cagagaagat cctcgagtgg tacaaccagg agctgagggg caatggccat 7920

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ctctggaacc tgcgggataa tggcgtgggc ctcaacgtga tggtgtccga gcactaccag 8040

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ggcagcacga acctcagcga catcatcgag aaggagacag gcaagcagct cgtgatccag 8280

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agataaggga attagggttc ttatagggtt tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc 8640

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tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca 8880

cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa 8940

taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag 9000

ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt 9060

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ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt 9180

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agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa 9300

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cagtgtttct ctttggggaa tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt 10020

tcatgatttt ttttgtttcg ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata 10080

tatgccgtgc acttgtttgt cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat 10140

gatgtggtct ggttgggcgg tcgttctaga tcggagtaga attctgtttc aaactacctg 10200

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aagatgatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgcg ggttttactg 10320

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aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgtgggttt tactgatgca tatacatgat 10560

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agtatgtttt ataattattt tgatcttgat atacttggat gatggcatat gcagcagcta 10680

tatgtggatt tttttagccc tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt 10740

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caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt tggcttgtat ggagcagcag 11520

acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat cgccacgact ccgggcgtat 11580

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gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg gactgtcggg 11700

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aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 11880

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 11940

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 12000

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tatgtgcatg ccaaccacag ggttcccctc gggatcaaag tactttgatc caacccctcc 12360

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cattaccgaa gagatcgagg cggagatgat cgcggccggg tacgtgttcg agccgcccgc 13320

gcacgtctca accgtgcggc tgcatgaaat cctggccggt ttgtctgatg ccaagctggc 13380

ggcctggccg gccagcttgg ccgctgaaga aaccgagcgc cgccgtctaa aaaggtgatg 13440

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atcggccggc gcgacttcgt agtgatcgac ggagcgcccc aggcggcgga cttggctgtg 13800

tccgcgatca aggcagccga cttcgtgctg attccggtgc agccaagccc ttacgacata 13860

tgggccaccg ccgacctggt ggagctggtt aagcagcgca ttgaggtcac ggatggaagg 13920

ctacaagcgg cctttgtcgt gtcgcgggcg atcaaaggca cgcgcatcgg cggtgaggtt 13980

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gcagcagcaa ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac gccagccatg aagcgggtca 14280

actttcagtt gccggcggag gatcacacca agctgaagat gtacgcggta cgccaaggca 14340

agaccattac cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct accagagtaa atgagcaaat 14400

gaataaatga gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg gcatggaaaa tcaagaacaa 14460

ccaggcaccg acgccgtgga atgccccatg tgtggaggaa cgggcggttg gccaggcgta 14520

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gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta 15300

catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga 15360

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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gaagccggga acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt 300

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gacccgctga cctgctcgta cctcgtaccg tcgtacggca cagcatttgg aattaaaggg 1260

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aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc 10800

gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct gacctattgc 10860

atctcccgcc gttcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct 10920

gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg 10980

agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc 11040

atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc 11100

agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa 11160

gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc 11220

ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc 11280

aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag 11340

cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt 11400

cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag 11460

ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc 11520

cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac 11580

cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag aaatagagta gatgccgacc gggatctgtc 11640

gatcgacaag ctcgagtttc tccataataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta 11700

gggttcctat agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg 11760

tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta 11820

aaatccagat cccccgaatt aattcggcgt taattcagcc tgcaggacgc gtttaattaa 11880

gtgcacgcgg ccgcctactt agtcaagagc ctcgcacgcg actgtcacgc ggccaggatc 11940

gcctcgtgag cctcgcaatc tgtacctagt gtttaaacta tcagtgtttg acaggatata 12000

ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg 12060

tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg 12120

gatcaaagta ctttgatcca acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca 12180

gtgcagccgt cttctgaaaa cgacatgtcg cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc 12240

gccctgccct tttcctggcg ttttcttgtc gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact 12300

tgcgactaga accggagaca ttacgccatg aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc 12360

tatgcccgcg tcagcaccga cgaccaggac ttgaccaacc aacgggccga actgcacgcg 12420

gccggctgca ccaagctgtt ttccgagaag atcaccggca ccaggcgcga ccgcccggag 12480

ctggccagga tgcttgacca cctacgccct ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac 12540

cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca ggaggccggc 12600

gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg 12660

gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc 12720

cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc 12780

accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa 12840

gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc 12900

gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc 12960

gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc 13020

accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg 13080

cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc 13140

tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa 13200

ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg 13260

tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt 13320

tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc 13380

ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc cccagggcag 13440

tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg 13500

cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg 13560

agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat 13620

tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa 13680

gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat 13740

caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat 13800

tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac 13860

cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga 13920

aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac 13980

acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg 14040

gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag 14100

ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc tgaatacatc 14160

gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa 14220

aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg 14280

tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg 14340

cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac 14400

aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc 14460

agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc 14520

gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc 14580

ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg 14640

atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg 14700

gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg 14760

gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat 14820

ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg 14880

ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg 14940

tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca 15000

agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg 15060

taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc 15120

gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga 15180

tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag 15240

aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga 15300

agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga 15360

aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg 15420

gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag 15480

gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc 15540

cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt 15600

cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt 15660

taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca 15720

cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg 15780

cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca 15840

atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag 15900

gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 15960

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 16020

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 16080

gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc 16140

ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt 16200

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 16260

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 16320

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 16380

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 16440

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 16500

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 16560

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 16620

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 16680

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 16740

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 16800

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 16860

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 16920

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 16980

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcatt 17040

ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc caatcaggct 17100

tgatccccag taagtcaaaa aatagctcga catactgttc ttccccgata tcctccctga 17160

tcgaccggac gcagaaggca atgtcatacc acttgtccgc cctgccgctt ctcccaagat 17220

caataaagcc acttactttg ccatctttca caaagatgtt gctgtctccc aggtcgccgt 17280

gggaaaagac aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa aaaatcatac agctcgcgcg 17340

gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc agatcgttat 17400

tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag ggacaatccg 17460

atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata atcttttcag 17520

ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca ctcatgagca 17580

gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc agctttcctt 17640

ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt ccacatcata ggtggtccct ttataccggc 17700

tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat accttagcag 17760

gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt ttcaattccg 17820

gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt atttaaagat 17880

accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa 17940

ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt ataacatagt 18000

atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta 18060

caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc 18120

gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg 18180

ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc 18240

cggtcgggga gctgttggct ggct 18264

Claims (10)

1.一种提高碱基编辑***编辑效率的方法，包括如下步骤：使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶”通过将所述sgRNA的编码基因、所述抗潮霉素蛋白的编码基因、所述Cas9蛋白的编码基因和所述胞嘧啶脱氨酶编码基因导入受体实现。

3.一种提高碱基编辑***编辑效率的方法，包括如下步骤：使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述“使受体表达sgRNA、抗潮霉素蛋白、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂”通过将所述sgRNA的编码基因、所述抗潮霉素蛋白的编码基因、所述Cas9蛋白的编码基因、所述胞嘧啶脱氨酶编码基因和所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的编码基因导入受体实现。

5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：所述受体为植物愈伤组织。

6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述导入受体的过程中，使用潮霉素作为筛选剂筛选抗性愈伤组织。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述潮霉素的浓度为35-80mg/L。

8.如权利要求5至7任一所述的方法，其特征在于：所述植物为a1)或a2)或a3)：a1)禾本科植物；a2)水稻；a3)水稻品种日本晴。

9.X1)或X2)：

X1)潮霉素在提高碱基编辑***编辑效率中的应用；

X2)潮霉素在碱基编辑***编辑受体基因组中的应用。

10.如权利要求1至8任一所述的方法或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述编辑效率为C→T碱基替换效率。