CN109679941A

CN109679941A - 一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109679941A
Application number: CN201910170774.1A
Authority: CN
Inventors: 刘英丽; 王静; 丁立; 万真; 孙宝国
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2019-03-07
Filing date: 2019-03-07
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2039-03-07
Also published as: CN109679941B

Abstract

一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，其可应用于溶栓。本发明通过一系列的酶学性质及体外体内溶栓性质初步研究证明了该酶具有较好的溶栓活性，并借助构建其他动物血栓模型，揭示其体内溶栓机理，借助毒理学试验，发掘其临床应用的安全性，为今后新的治疗血栓药物或者功能性食品的开发提供科学证明及数据支撑。

Description

一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

心脑血管疾病是世界上人类死亡的主要原因之一，血管内血栓形成是心脑血管疾病发病的一个主要原因。血管内血栓形成是由于纤维蛋白原在凝血酶作用下转变为纤维蛋白导致的，随后形成不可溶的纤维蛋白结块（凝血反应），这些结块就是血栓的主要组成部分。迄今为止，商业上使用的临床血栓溶解剂如组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂（t-PA）、尿激酶和链激酶，它们有一些不可避免的副作用存在，比如具有出血和堵塞并发症、对纤维蛋白降解的特异性较低、过敏反应及价格昂贵等。

蛹虫草作为一种中国传统的药食两用的珍贵可食用真菌资源，已可被人工大批次生产，被认为是冬虫夏草的理想替代品。蛹虫草中的具有纤溶活性的蛋白酶，作为一种可食用真菌来源的纤维蛋白溶解酶，与其他来源的纤维蛋白溶解酶和现有的治疗血栓的药物相比，具有原料广泛、价格低廉、安全性高、特异性好等优点。但目前对蛹虫草纤维蛋白溶解酶的研究还停留在生物工艺的下游阶段，对纤维蛋白溶解酶的基因研究尚未报道，本发明利用分子生物手段扩增得到编码该纤维蛋白溶解酶的基因序列。对蛹虫草纤维蛋白溶解酶基因进行异源表达，提高产量及酶活。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用，第一次获得了蛹虫草中一种纤维蛋白溶解酶基因，进行克隆后于大肠杆菌BL21中表达，得到蛹虫草纤维蛋白溶解酶的高酶活工程菌，提高表达产量。

本发明的技术方案，本发明对纯化出的蛹虫草纤维蛋白溶解酶进行N端测序并结合质谱测序，鉴定该蛋白为碱性丝氨酸蛋白酶Alp1（NCBI Protein id= EGX91264.1），第一次获得了蛹虫草中一种纤维蛋白溶解酶基因，进行克隆后于大肠杆菌BL21中表达，得到蛹虫草纤维蛋白溶解酶的高酶活工程菌，提高表达产量。

本发明制备的蛹虫草纤维蛋白溶解酶的酶学性质：该酶最适温度60℃，但该放置在室温以上的温度，超过30℃，放置1h酶活开始急剧下降；最适反应pH为7.0-11.0，且在较大pH范围（5.0-11.0）内保持稳定。

低浓度的Fe³⁺对所述蛹虫草纤维蛋白溶解酶酶活具有显著的抑制作用，酶活基本完全丧失，Fe²⁺和Cu²⁺对酶活具有轻微的抑制作用，其余离子如Na⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、K⁺对酶活影响不是特别显著，Ca²⁺和Mn²⁺离子对蛹虫草纤维蛋白溶解酶酶活具有显著的增强作用；丝氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂PMSF、 pepstatin A、EDTA-2Na、leupeptin和TPCK对酶活具有显著的抑制作用，可证明该酶是一个丝氨酸金属蛋白酶，且Ca²⁺和Mn²⁺离子参与酶活性中心的催化。

根据与加热纤维蛋白平板对比，证明蛹虫草纤维蛋白溶解酶溶栓方式为直接降解纤维蛋白，具有较高的纤维蛋白特异性，不具备纤维蛋白原催化活性。该蛋白酶对纤维蛋白原的三条链都具有一定的降解作用，在一定反应时间内，能够使α链含量降解到一定程度，60 min之内就能使β链完全降解，对γ链降解程度次于β链，随着反应时间延长三条链含量越来越少。

一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶工程菌的构建方法，所用菌株为蛹虫草CM01（Cordyceps militaris CM01）菌株，蛹虫草纤维蛋白溶解酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。

具体步骤为：

（1）根据蛋白N端测序及质谱鉴定的结果，通过对NCBI数据库中Alp1蛋白的编码基因序列进行分析，设计引物。通过CDS注释和signalP4.1信号肽预测以及N端测序结果，发现该蛋白是由信号肽、前导肽和成熟肽三部分组成。因此在设计引物时分别扩增这三部分，引物设计见表1，其中P1、P2、P3为上游引物，P4为下游引物。P1、P4扩增产物为全长基因g1，即含信号肽、前导肽和成熟肽的前酶原；P2、P4扩增产物为含前导肽和成熟肽的酶原基因g2；P3、P4为只有成熟肽的酶基因g3。

（2）进行蛹虫草RNA的提取和反转录，以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增。

（3）将步骤（2）纯化的扩增产物连接到pEASY-Blunt E2载体中，转化到大肠杆菌DH5α中，将正确的重组质粒转移到大肠杆菌BL21（DE3）中，然后通过测序确认，得到含有重组质粒的大肠杆菌。

表1 大肠杆菌表达所用引物

引物名称	引物序列	扩增长度
			P1	5'-ATGGTCGGCT TCAAAAGCTT CG-3'	1187 bp
P2	5'-AAGTACATTG TCACGCTCAA-3’	1133 bp
			P3	5'-GCCCTGACCA CGCAGTCCAA-3'	867 bp
P4	5'-CTGGTTACCG TTGTACGAGA GCA-3'	-

蛹虫草纤维蛋白溶解酶基因PCR扩增产物电泳图如图1所示，重组质粒提取图如图2所示，蛹虫草纤维蛋白溶解酶基因菌液PCR电泳图如图3所示。其中M1对应的是P1、P4引物对，M2对应的是P2、P4引物对，M3对应的是P3、P4引物对。

将所述基因工程菌用于异源表达蛹虫草纤维蛋白溶解酶的诱导表达的最优方法：

将含有重组质粒的大肠杆菌细胞转移至含氨苄（50~100μg/mL）的LB液体培养基中，摇瓶中过夜培养，此为一级种子液。之后按照1%~10%接种量转接至50 mL含氨苄的LB液体培养基中，相同培养条件，监测菌液OD600为0.1~1时加入IPTG至终浓度为10~50μg/mL以诱导酶的产生，继续培养10~20h。诱导后菌液离心后用无菌水洗涤后每50 mL原菌液定容到10 mL，利用超声破碎提取机进行破壁处理，破壁处理之后的样品离心取上清在4℃下以5000~10000rpm离心20min，并利用亲和层析的方法对重组表达酶进行再次纯化，用于后续酶学性质研究及溶栓活性分析。

提供蛹虫草纤维蛋白溶解酶在体内外的溶栓活性分析：

（1）重组酶的体外溶栓：健康SD大鼠心脏取血，离心管事先编号并称取空管质量记录，记为m1，血液自然放置凝固后，3000rpm离心10min去除上清血清，称取剩余血块及离心管质量，记为m2。设置5组，每组三管，组一加入 1×PBS缓冲液作为阴性对照，组二组三分别加入尿激酶、链激酶作为阳性对照，组四加入10μg纯化的蛹虫草纤维蛋白溶解酶，组五加入30μg纯化的蛹虫草纤维蛋白溶解酶。在37℃分别孵育3h，6h，9h，12h，24h后微型离心机简短离心取出上清到另一个干净的离心管中，称取剩余血块质量及空管质量，记为m3。称取完毕后再将液体重新加入血块中继续孵育，最后血块溶解率按公式进行计算。

（2）重组酶的体内溶栓作用：利用大鼠尾静脉血栓模型来研究蛹虫草纤维蛋白溶解酶体内溶栓活性。选择wistar雄性大鼠，用1×PBS溶解不同浓度k-角叉莱胶注射大鼠尾静脉诱发血栓形成。将42只雄性小鼠分成7组，每组6只。组1为阴性对照组，注射1×PBS。组2，3，4，5为实验组，分别注射不同浓度（1×PBS溶解）蛹虫草纤维蛋白溶解酶。组6和组7为实验阳性对照组，分别注射一定剂量的尿激酶、链激酶。注射上述酶液30 min后，结扎小鼠尾部静脉，利用k-角叉莱胶静脉注射诱导血栓形成。15 min后移除结扎，24h后测量血栓形成长度并拍照，按照公式进行体内溶栓率的计算。

本发明的有益效果：本发明对纯化出的蛹虫草纤维蛋白溶解酶进行N端测序及质谱测序相结合的方式将获得的序列进行拼接，第一次获得了蛹虫草中的一种纤维蛋白溶解酶基因，并进行了克隆表达。蛹虫草纤维蛋白溶解酶大肠表达量可达91.14mg/L，单位酶活1779U/mL，比天然菌株直接发酵表达量提高32.7倍，单位酶活提高35%，发酵时间大大缩短，提高了生产效率。

本发明通过一系列的酶学性质及体外体内溶栓性质初步研究证明了该酶具有较好的溶栓活性，并借助构建其他动物血栓模型，揭示其体内溶栓机理，借助毒理学试验，发掘其临床应用的安全性，为今后新的治疗血栓药物或者功能性食品的开发提供科学证明及数据支撑。

附图说明

图1 蛹虫草纤维蛋白溶解酶基因PCR扩增产物电泳图。

图2 重组质粒提取图。

图3 蛹虫草纤维蛋白溶解酶基因菌液PCR电泳图。

其中M为Marker，1号泳道为g1的PCR扩增产物或重组质粒，2号泳道为g2的PCR扩增产物或重组质粒，3号泳道为g3的PCR扩增产物或重组质粒。

图4 纯化后重组蛋白SDS-PAGE电泳图。

图5 不同纤维蛋白溶解酶体外溶栓活性比较。

图6 不同纤维蛋白溶解酶对大鼠尾静脉血栓影响。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案及优点更明确，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，以下所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 高酶活蛹虫草菌株的筛选

利用固体平板培养基对10株蛹虫草菌株进行活化，从斜面上切取一块放置在固体改良PDA平板（在普通PDA固体培养基基础上添加2%蛋白胨，0.3% KH₂PO₄，0.15% MgSO₄，0.002%VB₁）中央，24℃恒温避光培养10d，菌丝体长满平板且未转色。对活化的10株蛹虫草菌株进行液体培养发酵。

培养条件为：250mL三角瓶中装50mL培养基，其中加入一块边长为1cm左右的菌块，24℃、150r/min摇瓶避光培养。从第5d开始每天取样1mL，在4℃、10000r/min条件下离心5min，取上清作为粗酶液进行酶活检测，共监测20d，最后综合考虑酶活及产酶速度选择最佳高酶活蛹虫草菌株用于后续分离纯化。

实施例2：蛹虫草纤维蛋白溶解酶的鉴定

（1）纤溶酶的N端测序：以实施例1中获得的高酶活蛹虫草菌株作为研究对象，对其进行液体发酵并对粗酶液进行分离纯化后，将蛋白样品按照表2电泳方法跑胶，结束后将蛋白转移至PVDF膜。转印前，将合适大小的胶和滤纸事先浸泡在CAPS缓冲液中5-10min。PVDF膜用甲醇浸泡数秒钟，然后也放入CAPS电印迹缓冲液中。安装时从下到上依次为滤纸、PVDF膜、胶、滤纸，赶尽气泡。

采用半干法，转印条件为：25V恒压，1A，60min。转印完成，将PVDF膜用考马斯亮蓝染色，染色脱色后晾干，剪下目的条带，利用岛津蛋白质测序仪PPSQ-31B，测定该纤溶酶N端的前10个氨基酸序列，所用方法按照标准方法进行，数据结果按照质谱分析说明书进行分析。

利用蛋白质测序仪，通过Edman降解原理测得蛹虫草纤溶酶的N端前10个氨基酸序列为ALTTQSNVPH。利用NCBI蛋白数据库对其进行Blast搜索，发现其与蛹虫草（Cordyceps militaris CM01）的碱性丝氨酸蛋白酶Alp1（NCBI Protein id= EGX91264.1）的108-117位氨基酸完全匹配，而与其他研究者从蛹虫草中纯化出的纤溶酶以及其他真菌来源的纤溶酶相似度很低。蛹虫草可分泌多种蛋白酶，此次从CM01中分离到的纤溶酶很有可能是一种新型的蛋白酶，具有很高的研究开发潜力与价值。

表2 SDS-PAGE 配方表

（2）纤溶酶的质谱测序及鉴定：将跑完SDS-PAGE的蛋白条带染色脱色后切下置于干净的1.5 mL离心管中，进行二级质谱测序鉴定。所用质谱为Q-Exactive（ThermoSceientific），二级质谱数据分析用软件Mascot和Proteome Discoverer进行搜库鉴定，所用蛋白数据库为uniprot-捕蝇草。

通过蛋白电泳得到目的蛋白的条带后用胰蛋白酶对其进行酶解后得到分子量较小的肽段混合物，对其进行质谱分析，得到二级质谱及片段信息后，通过蛋白数据库比对，得到的Score最大的为Cordyceps militaris CM01号菌株中的碱性丝氨酸蛋白酶Alp1（NCBI Protein id= EGX91264.1），数据库打分9232.55（Score>100即可认为鉴定成功，得分越大越可信）。对其二级肽端谱图进行序列分析所得的序列如表3所示，将所读得的氨基酸序列片段分别与数据库进行比对，拼接后发现其顺序与Alp1的第126-298及369-395位氨基酸完全一致。至此，可以认为蛹虫草中具有纤溶活性的蛋白酶很有可能与此碱性丝氨酸蛋白酶具有很高的同源性及序列相似性。

表3 蛋白序列质谱鉴定结果

实施例3：重组蛹虫草纤维蛋白溶解酶的诱导表达与分离纯化

将含有重组质粒的大肠杆菌细胞在含有50mL补充有100μg/ mL氨苄青霉素的LB肉汤的250mL摇瓶中培养，并在37℃和200rpm下生长直至在600nm处达到0.6的光密度。然后将培养物加入到50μg/ mL的IPTG中以诱导酶的产生，并在20℃下继续培养20h。培养后，将培养物在4℃下以10000rpm离心10min。然后将细胞重新悬浮于细胞培养液中。裂解缓冲液（50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM Tris，20mM咪唑，pH8.0）并通过超声破碎。然后将粗提物在4℃下以10000rpm离心20min。由于pEASY Blunt E2载体C端自带6×His标签，因此选用镍柱亲和层析法进行表达产物的纯化。菌液发酵离心后取沉淀，用无菌水洗涤两遍后用平衡缓冲液（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM Tris，20mM咪唑，pH8.0）洗涤，之后定容到原体积的1/5。利用超声破碎机进行破壁提取蛋白，超声参数同上，超声结束，10000rpm、4℃离心10min取上清。上样预先平衡好的Ni-NTA（5mL）柱，流速5mL/min。上样结束继续冲洗20个柱体积，之后利用洗脱缓冲液（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM Tris，500mM咪唑，pH8.0）线性洗脱10个柱体积。利用自动收集器进行收集，每管收集2mL，根据出峰位置进行酶活检测及电泳检测。最终优化后的纤维蛋白溶解酶大肠表达量为91.14mg/L，单位酶活1779U/mL，比天然菌株直接发酵表达量提高32.7倍，单位酶活提高35%，发酵时间大大缩短，产酶效率获得较大提升。将破壁后的细菌裂解液离心得到的上清液上样Ni-NTA柱，电泳检测发现能特异性吸附目标蛋白，得到的纯度较高，如图4所示。

实施例4：重组酶的体外溶栓活性的测定

健康SD大鼠心脏取血，分装1.5mL离心管，每管0.6mL左右，离心管事先编号并称取空管质量记录，记为m1。血液自然放置凝固后，3000rpm离心10min去除上清血清，用滤纸吸干液体，称取剩余血块及离心管质量，记为m2。设置5组，每组三管，组一加入200μL 1×PBS缓冲液作为阴性对照，组二组三分别加入10μg尿激酶和10μg链激酶200μL作为阳性对照，组四加入200μL，10μg纯化的蛹虫草纤维蛋白溶解酶，组五加入200μL、30μg纯化的蛹虫草纤维蛋白溶解酶。在37℃分别孵育3h，6h，9h，12h，24h后微型离心机简短离心取出上清到另一个干净的离心管中，称取剩余血块质量及空管质量，记为m3。称取完毕后再将液体重新加入血块中继续孵育。最后血块溶解率按照下式进行计算：

血栓溶解率（%）=[（m2-m3）/（m2-m1）] ×100%

记录不同时间间隔下剩余血块质量，结果如图5所示。以尿激酶和链激酶做阳性对照，在反应前6h内，本方法表达的重组纤维蛋白溶解酶具有与尿激酶相当的溶栓活性，且高于链激酶的溶栓率。在12h内，尿激酶和链激酶均达到他们最高的溶栓活性，尿激酶溶栓率达24%，链激酶只有12%，与24h后的溶栓率并无明显差异。但本方法表达的重组纤维蛋白溶解酶从反应9 h，一直到24 h，表现出了较明显的溶栓活性，且一直在增高，24h后溶栓率明显高于尿激酶和链激酶，两个剂量组溶栓率都达到40%以上。

实施例5重组酶的体内溶栓活性的测定——对大鼠尾静脉血栓的影响

（1）k-角叉莱胶诱导浓度的优化：利用大鼠尾静脉血栓模型来研究蛹虫草纤维蛋白溶解酶体内溶栓活性。选择wistar雄性大鼠，首先进行一个k-角叉莱胶诱导浓度的优化，用1×PBS溶解不同浓度k-角叉莱胶（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/kg）注射大鼠尾静脉诱发血栓形成。每组六只平行，24h后观察尾部血栓形成情况,测量形成的酒红色血栓长度。做显著性分析，选择最适宜的诱导浓度。

（2）重组纤维蛋白溶解酶体内溶栓活性：根据上步优化的k-角叉莱胶诱导浓度进行大鼠尾静脉血栓模型试验。将42只雄性小鼠分成7组，每组6只。组a为阴性对照组，注射1×PBS。组b，c，d，e为实验组，分别注射200、600、1800、3000μg/kg（1×PBS溶解）蛹虫草纤维蛋白溶解酶。组f和组g为实验阳性对照组，分别注射600μg/kg剂量尿激酶、600μg/kg剂量链激酶。注射上述酶液30min后，结扎小鼠尾部静脉，利用上步优化的k-角叉莱胶浓度静脉注射诱导血栓形成。15min后移除结扎，24h后测量血栓形成长度并拍照，按照下式进行体内溶栓率的计算：

注射不同剂量浓度的纯化纤维蛋白溶解酶与各对照药剂后诱导大鼠尾静脉血栓形成，24h后测量各组尾静脉形成血栓长度，结果如图6所示。以血栓单位长度酶活溶栓率计，本方法纯化的重组纤溶酶不同剂量组单位酶活溶栓率从83-289 U/cm不等，而尿激酶高达1883U/cm，溶解同等长度的尾静脉血栓需要更多的酶活，链激酶则为131U/cm，因此本方法纯化的重组纤溶酶体内溶栓效果是要大于尿激酶的，而次于链激酶，但基本相当。而且按照所设置的剂量关系可以看出，蛹纤酶的溶栓率有一个明显的剂量依赖型关系。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 395

<212> PRT

<213> 蛹虫草(Cordyceps militaris )

<400> 1

Met Val Gly Phe Lys Ser Phe Ala Ala Leu Phe Leu Ala Ala Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ala Ala Pro Ala Pro Ser Gly Gly Lys Tyr Ile Val Thr Leu Lys

20 25 30

Asp Gly Ala Thr Ala Ser Lys Val Glu Ser His Leu Gln Trp Val Asn

35 40 45

Asp Val His Ala Arg Ser Val Gly Arg Arg Asp Leu Asn Leu Asn Gly

50 55 60

Val Glu Lys Thr Tyr Gly Ile Gly Ser Phe Asn Gly Tyr Ala Gly Asn

65 70 75 80

Phe Asp Ala Ala Thr Ile Glu Glu Ile Lys Asn Ser Pro Glu Val Ala

85 90 95

Ala Val Glu Leu Asp Gln Lys Trp Thr Leu Tyr Ala Leu Thr Thr Gln

100 105 110

Ser Asn Val Pro His Gly Leu Ala Thr Ile Ser His Arg Gln Ser Gly

115 120 125

Ala Ser Asn Tyr Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Gly Gln Gly Ala Tyr Ala

130 135 140

Tyr Val Val Asp Ser Gly Val Asn Ile Gly His Val Glu Phe Glu Gly

145 150 155 160

Arg Ala Thr Arg Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Glu Asp Val Asp Thr

165 170 175

Leu Gly His Gly Thr His Val Ser Gly Thr Ile Ala Ser Lys Ser Tyr

180 185 190

Gly Val Ala Lys Lys Ala Ser Ile Val Ser Val Lys Val Phe Ser Gly

195 200 205

Arg Thr Ala Asp Thr Ser Val Ile Leu Asp Gly Tyr Asn Trp Ala Val

210 215 220

Asn Asp Ile Val Ala Lys Arg Arg Gln Thr Arg Ser Val Ile Asn Leu

225 230 235 240

Ser Leu Gly Gly Pro Ala Ser Thr Ala Phe Asp Ser Ala Val Ala Ser

245 250 255

Ala Tyr Asn Gln Gly Val Leu Thr Val Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn

260 265 270

Gln Asp Ser Arg Asn Val Ser Pro Ala Arg Ala Pro Gln Ala Ile Thr

275 280 285

Val Ala Ala Val Gly Ala Thr Trp Ala Arg Trp Val Trp Asn Ala Gln

290 295 300

Gln Gly Ser Asn Tyr Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Ala Pro Gly Glu

305 310 315 320

Asp Val Leu Ser Thr Trp Ile Gly Ser Thr Thr Ala Thr Asn Thr Ile

325 330 335

Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Ile Ala Gly Leu Ala Ile Tyr

340 345 350

Leu Ala Val Leu Glu Asn Leu Asn Thr Pro Ala Ala Val Thr Asn Arg

355 360 365

Ile Lys Ala Leu Gly Thr Ala Asn Lys Val Thr Gly Asn Val Gly Ser

370 375 380

Thr Val Asn Leu Leu Ser Tyr Asn Gly Asn Gln

385 390 395

<210> 2

<211> 1188

<212> DNA

<213> 蛹虫草(Cordyceps militaris )

<400> 2

atggtcggct tcaaaagctt cgccgctctc ttcctcgcgg cccttggcac cgctgcccct 60

gctccttctg gcggcaagta cattgtcacg ctcaaggacg gtgccactgc cagcaaggtt 120

gagtctcact tgcagtgggt aaacgatgtc cacgctcgca gcgtcggtcg tcgcgatctc 180

aacctcaacg gtgtcgaaaa gacctacggc attggtagct tcaacggcta cgctggcaac 240

tttgacgctg ccaccattga ggagatcaag aacagccccg aggttgcggc cgtcgagctt 300

gaccagaagt ggactctgta tgccctgacc acgcagtcca acgtccccca cggactggcc 360

accatctcgc accgtcagtc cggtgccagc aactacatct acgacagcac cgcaggccag 420

ggcgcctacg cctacgtcgt cgactcaggt gtcaacattg gacacgtcga gttcgagggc 480

cgtgctaccc gcggctacaa cgcggccggc ggcgaggacg tcgacaccct cggccacggc 540

actcacgtct ctggcaccat tgcttccaag agctacggcg tggccaagaa ggccagcatc 600

gtctccgtca aggttttcag cggccgcacc gccgacacct ccgtcatcct cgatggctac 660

aactgggccg tcaacgacat cgtcgccaag cgccgccaga ctcgctccgt cattaacctg 720

tccctcggtg gtcccgcctc gaccgctttc gacagcgcag ttgccagtgc ctacaaccag 780

ggtgttctga ccgtcgtcgc cgccggcaac gagaaccagg acagcagaaa cgtctccccc 840

gcccgcgccc cccaggccat caccgtcgcc gctgtcggcg ccacctgggc tcgctgggtc 900

tggaacgcgc agcagggctc caactacggc actcccgtcg acatctacgc tcccggtgag 960

gatgttctgt ccacctggat tggctcgacc actgccacca acaccattac tggcacctcc 1020

atggcctctc cccacattgc tggtctggcc atttaccttg ccgttctcga gaacctcaac 1080

acccctgccg ctgtcaccaa ccgcatcaag gcgcttggca ccgcgaacaa ggtgactggc 1140

aacgttggca gcactgtcaa cttgctctcg tacaacggta accagtaa 1188

Claims

1.一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其mRNA序列如SEQID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述蛹虫草纤维蛋白溶解酶，其特征在于：该酶最适温度60℃，最适反应pH为7.0-11.0，在pH范围5.0-11.0内保持稳定；保存温度为30℃以下。

3.权利要求1所述蛹虫草纤维蛋白溶解酶的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）根据蛋白N端测序及质谱鉴定的结果，通过对NCBI数据库中Alp1蛋白的编码基因序列进行分析，设计上游引物P2和下游引物P4；

（2）进行蛹虫草RNA的提取和反转录，以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）纯化的扩增产物连接到pEASY-Blunt E2载体中，转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR验证及提取质粒验证，将重组质粒转移到大肠杆菌BL21/DE3中，然后通过测序确认，得到含有重组质粒的大肠杆菌；

（4）将步骤（3）所得含有重组质粒的大肠杆菌细胞转移至含50~100μg/mL氨苄的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇瓶中过夜培养得到一级种子液；按照1%~10%接种量转接至50mL含氨苄的LB液体培养基中，相同培养条件，监测菌液OD600为0.1~1范围时，加入IPTG至终浓度为10~50μg/mL以诱导酶的产生，继续培养10~20h；诱导后菌液离心后用无菌水洗涤，每50mL原菌液离心后定容到10mL，利用超声破碎提取机进行破壁处理，破壁处理之后的样品离心取上清在4℃下以5000~10000rpm离心20min，并利用亲和层析的方法对重组表达酶进行再次纯化，得到蛹虫草纤维蛋白溶解酶，用于后续酶学性质研究及溶栓活性分析。

4.根据权利要求3所述蛹虫草纤维蛋白溶解酶的制备方法，其特征在于： P2、P4扩增产物为含前导肽和成熟肽的酶原基因g2。

5.根据权利要求4所述蛹虫草纤维蛋白溶解酶的制备方法，其特征在于：所述上游引物P2序列为5'-AAGTACATTG TCACGCTCAA-3'，扩增长度为1133bp；下游引物P4序列为5'-CTGGTTACCG TTGTACGAGA GCA-3'。

6.权利要求1所述蛹虫草纤维蛋白溶解酶的应用，其特征在于：将其应用于溶栓。