CN109652592A - 基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法 - Google Patents

基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法 Download PDF

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王华南
丛潇
杨忠艳
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Abstract

本发明公开了基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,包括如下实验步骤:提取病毒RNA;设计Real‑time RT‑RPA引物与探针;建立Real‑time RT‑RPA反应体系,对病毒RNA进行Real‑time RT‑RPA反应,实时荧光检测结果。本发明的优点包括:简单、快速、低成本地检测出SVCV,Real‑time RT‑RPA检测方法与Real time RT‑PCR检测方法灵敏度一致,都是102copies/μL;特异性好,重复性好,稳定。

Description

基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症 病毒检测方法
技术领域
本发明涉及病毒的检测技术领域,尤其涉及鲤春病毒血症病毒的检测技术。
背景技术
鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia ofcarp virus(SVCV))属于水疱病毒属,弹状病毒科,有一层囊膜,病毒大小为180×70nm,含单链RNA和依赖于RNA 的RNA聚合酶,它可引起鲤鱼类大规模鲤春病毒血症爆发。SVC是一种急性出血性性传播疾病,它是鲤科鱼类最严重的病毒性疾病之一,被国际动物卫生组织(OIE)列为法定报告病。主要的临床症状包括发炎的发泄,皮肤瘀斑和腹胀。当水温在10到17℃之间,病毒潜伏约20天后会发生疾病。SVCV首次在欧洲被发现并广泛传播,但近年来,在美国和中国已经发生,这对水产养殖业构成了巨大威胁。到目前为止,SVCV已在欧洲,俄罗斯,北美洲和南美洲以及亚洲广泛传播。然而,到目前为止,还没有开发出有效的药物或疫苗来预防由 SVCV引起的疾病。阻止其流通的唯一有效方法是在有效识别并杀死所感染的鱼。因此,快速可靠的诊断方法对SVCV的预防和控制具有重要意义。
已经开发了几种用于诊断SVCV的方法,其包括间接荧光抗体测试,酶联免疫吸附测定(ELISA),细胞培养中的病毒分离和病毒中和,半巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)。但这些方法的拥有一定的缺点:ELISA方法依赖于特异性抗血清,针对欧洲分离株的单克隆抗体通常不能与亚洲分离株反应;LAMP方法需要多个复杂的引物;对于巢式PCR 方法,它通常需要几个小时,并需要昂贵的仪器。
重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种很有前途的等温核酸扩增技术,它依赖于重组酶,单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶的组合,在37到42℃的恒定温度下进行20-30min的DNA扩增。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物;该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合启动DNA复制;重组酶从复合体释放后DNA聚合酶与引物结合促进新链合成;ssDNA结合蛋白可以使非模板链和置换链稳定,扩增产物以指数级增长。。RPA引物比一般PCR引物长,通常需要达到30-35个碱基,扩增产物在300bp以内,目前基于RPA扩增产物进行检测的方法主要有三种形式:RPA与琼脂糖凝胶检测技术相结合(基础型RPA)、 RPA与荧光检测技术相结合(Real-time RPA)、RPA与侧向流动免疫技术相结合 (RPA-LFD)。基础型RPA不需要探针,但在扩增完成后需要对产物进行纯化,操作相对于其他两种检测方法较为复杂,RPA-LFD是利用荧光素标记的特异探针与生物素(Biotin)标记的核酸扩增产物特异性结合,将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗荧光素的抗体结合,但不能进行实时检测。Real-time RPA的对探针要求较高,探针长度46-52bp,同时标记荧光基团和相应的淬灭基团,标记为点在探针的中间或者两端,两基团中间同时引物THF酶切位点,探针的3` 端进行block。
研发一种简单、快速检测SVCV方法在诊断意义上具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测方法,能够简单、快速、低成本地检测出 SVCV。
为了达到上述目的,本研究结合实时荧光检测与反转录重组酶聚合酶扩增 (RT-RPA)技术,研发出实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(Real-time RT-RPA) 技术,建立了一种现场可检测SVCV的快速检测体系,开发并评价了一种特异、灵敏的检测平台。本研究使用的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(Real-time RT-RPA)技术无需配套检测卡,无需电泳跑胶,只需要一台带有恒温模块的荧光信号收集仪器即可。
本发明采用如下技术方案:
基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,包括如下实验步骤:
(1)提取病毒RNA,作为模板RNA;
(2)设计Real-time RT-RPA引物与探针;
(3)建立Real-time RT-RPA反应体系,对病毒RNA进行Real-time RT-RPA 反应,实时荧光检测结果。
进一步地,Real-time RT-RPA的引物长度为30-35个碱基,探针长度为46-52 个碱基,探针共有4个修饰基团,分别为荧光基团、相应的淬灭基团、四氢呋喃和C3-spacer;探针中部有两个胸腺嘧啶,两个胸腺嘧啶之间间隔1-4个碱基,所述两个胸腺嘧啶之间任一碱基由所述四氢呋喃取代,形成空碱基位;
荧光基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶上,淬灭基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶上;或者荧光基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶上,淬灭基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶上;从5’端到荧光基团之间至少有30个碱基,从淬灭基团到3’端之间至少有15个碱基;C3-spacer 标记在3’端末端。
进一步地,所述Real-time RT-RPA引物和探针如下:
SVCV-Real-time RT-RPA-F:
5`~TACTCTAAGAAAGCTCTTTGGAATCAAGAA-3`(2381-2410);
SVCV-Real-time RT-RPA-R:
5`~TGTAATCTACATCCCAATTTTTCAAGAGTC-3`(2572-2601);
SVCV-Real-time RT-RPA-P:TGAGGTACCATGTTGAATTGGACATACAAT (FAM-dT)C(THF)AC(BHQ1-dT)CGCCCTTGAAGACGA(C3-spacer)。
进一步地,所述Real-time RT-RPA反应体系为:Rehydration Buffer 29.5μL;420nM上游引物;420nM下游引物;120nm探针,2μL模板RNA,1μL反转录酶,ddH2O补齐至47.5μL;再加入2.5μL的醋酸镁溶液。
进一步地,所述Real-time RT-RPA反应过程:将Rehydration Buffer 29.5μL;420nM上游引物;420nM下游引物;120nm探针,2μL模板RNA,1μL反转录酶,ddH2O的混合液轻微震荡后离心数秒;再加入2.5μL的醋酸镁溶液;放置 39℃金属浴中反应,时间为20min。
进一步地,还包括制备dsRNA阳性标准品,以进行灵敏度、特异性、重复性测试;
制备dsRNA阳性标准品的过程:提取病毒RNA,设计RT-PCR引物,RT-PCR 扩增基因获得DNA,DNA与载体连接,得到重组子,转化重组子,扩大培养;提取质粒;转录出dsRNA阳性标准品。
进一步地,提取病毒RNA的过程是:病料加1mL 1xPBS进行研磨,3000rpm 离心10min,吸取200μL的上清液,加600μL的TRIZOL试剂,震荡混匀后静置5min;加入140μL的氯仿试剂,手动快速颠倒2min混匀,放置2min;4℃下 12000rpm离心15min,取水相至EP1.5mL离心管后加等量的异丙醇,放置10min;在4℃下12000rpm下离心10min,倒掉上清液留下沉淀;加入600μL75%的乙醇洗涤沉淀,轻微震荡至沉淀悬起;4℃下12000rpm离心5min,倒出液体,打开 EP管放置2min挥发酒精;加50μL RNase-free ddH2O溶解沉淀,反复吹打直至沉淀溶解,溶解后的溶液就是病毒RNA,放-80℃保存。
进一步地,根据SVCV公布的M序列,设计RT-PCR引物如下:
上游引物:5`~CCACTTACGAGGAGACAC~3`;
下游引物:5`~GAACAGGGAAGGAACACG~3`。
进一步地,所述RT-PCR反应体系是:2×1Step Buffer 25μL,PrimeScript 1 StepEnzyme Mix 2μL,上游引物2μL,下游引物2μL,模板RNA2μL,用dH2O 17μL;
扩增程序为:50℃反转录30min;95℃灭活2min;95℃预变性5min;95℃变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸2min,共35个循环;72℃再延伸10min; 4℃保存。
进一步地,所述DNA与载体连接的过程是:RT-PCR扩增产物跑凝胶电泳、回收RT-PCR目的基因产物,RT-PCR目的基因产物与pGEM-T vector、2*buffer、 T4DNA酶1μL混匀,放4℃连接过夜,得到重组子;
重组子转化大肠杆菌感受态细胞中,扩大培养,操作是:将10μL重组子加入100μLDH5a大肠杆菌感受态细胞中轻轻混匀,冰浴30min;金属浴42℃热激 90Sec后冰浴5min;加入1mL LB培养基后在200rpm、37℃的摇床上摇1h;涂布含有氨苄抗性的平板,挑取阳性菌落扩大培养。
本发明的优点有:简单、快速、低成本地检测出SVCV,Real-time RT-RPA 检测方法与Real-time RT-PCR检测方法灵敏度一致,都是102copies/μL;特异性好,重复性好,稳定。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本申请的一部分,并不构成对本发明的不当限定,在附图中:
图1是RT-PCR扩增产物实验结果图;
图2是Real-time RT-RPA灵敏度试验结果图;
图3是特异性试验结果图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明,在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明,但并不作为对本发明的限定。
材料与方法
1.病毒RNA的提取
病料加1mL 1xPBS进行研磨,3000rpm离心10min,吸取200μL的上清液,加600μL的TRIZOL试剂,震荡混匀后静置5min;加入140μL的氯仿试剂,手动快速颠倒2min混匀,放置2min;4℃下12000rpm离心15min,取水相至 EP1.5mL离心管后加等量的异丙醇,放置10min;在4℃下12000rpm下离心 10min,倒掉上清液留下沉淀;加入600μL75%的乙醇洗涤沉淀,轻微震荡至沉淀悬起;4℃下12000rpm离心5min,倒出液体,打开EP管放置2min挥发酒精;加50μL RNase-free ddH2O溶解沉淀,反复吹打直至沉淀溶解。溶解后的溶液就是病毒的RNA,作为模板RNA,放-80℃保存。
2.引物的设计
根据GenBank中SVCV公布的M序列,设计RT-PCR引物,
上游引物:5`~CCACTTACGAGGAGACAC~3`;
下游引物:5`~GAACAGGGAAGGAACACG~3`,
利用该引物扩增基因,反应体系为:2×1Step Buffer 25μL,PrimeScript 1StepEnzyme Mix 2μL,上游引物2μL,下游引物2μL,模板RNA 2μL,dH2O 17μL。扩增程序为:50℃反转录30min;95℃灭活2min;95℃预变性5min;95℃变性 30sec,55℃退火30sec,72℃延伸2min,共35个循环;72℃再延伸10min;4℃保存。
采用凝胶核酸电泳后,如图1,扩增出608bp的目的基因。
按照OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒说明书回收RT-PCR 目的基因产物,回收步骤如下:
在紫外灯的照射下,用刀片切下与目的片段大小的胶;加入与胶等体积的Binding Buffer约400μL,在55℃金属浴下溶胶,直至胶完全溶解;将混合液移至HB离心柱,放置2min;10000rpm下离心1min,倒掉废液;加入300μL的 Binding Buffer,12000rpm下离心1min,弃滤液;加入700μL SPW Buffer,12000rpm下离心1min,弃滤液;重复上一步;12000rpm下空管离心2min;打开盖子,室温下放置2min,充分挥发酒精;加入30μL ElutionBuffer,放置2min;将离心柱移至1.5mL的离心管在12000rpm下离心2min,离心后的液体就是纯化好的DNA,得到RT-PCR目的基因产物。
3.目的基因的克隆
将3μL回收产物与1μLpGEM-T vector、5μL 2*buffer、T4DNA酶1μL总体积共10μL混匀,放4℃连接过夜,获得重组子。
将10μL重组子转化DH5a大肠杆菌感受态细胞中:将10μL重组子加入 100μLDH5a大肠杆菌感受态细胞中轻轻混匀,冰浴30min;金属浴42℃热激 90Sec后冰浴5min;加入1mLLB培养基后在200rpm、37℃的摇床上摇1h;涂布含有氨苄抗性的平板,挑取阳性菌落扩大培养。
提取质粒:按照OMEGA公司的Plasmid Mini Kit I试剂盒说明书进行提取。将提取后的质粒送至上海生工生物股份有限公司广州分公司测序。
按照RiboMAXTM Large Scale RNAProduction Systems说明书将提取后的质粒转录为SVCV dsRNA阳性标准品。
4.Real-time RT-RPA引物与探针的设计
我们基于SVCV的M基因序列设计了Real-time RT-RPA引物和探针,以扩增特定的片段。Real-time RT-RPA引物的长度为30-35个碱基。探针长度为46-52 个碱基,探针共有4个修饰基团,分别为荧光基团(FAM)、相应的淬灭基团 (BHQ1)、四氢呋喃(THF)和C3-spacer。探针中部有两个胸腺嘧啶(T),两个胸腺嘧啶(T)之间间隔1-4个碱基,所述两个胸腺嘧啶(T)之间任一碱基由所述四氢呋喃取代,形成空碱基位;
荧光基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶(T)上,淬灭基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶(T)上;或者荧光基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶(T)上,淬灭基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶(T)上;从5’端到荧光基团之间至少有30个碱基,从淬灭基团到3’端之间至少有15个碱基;C3-spacer标记在3’端末端。
以下是Real-time RT-RPA引物、探针的序列:
SVCV-Real-time RT-RPA-F:
5`~TACTCTAAGAAAGCTCTTTGGAATCAAGAA~3`(2381-2410);
SVCV-Real-time RT-RPA-R:5`~TGTAATCTACATCCCAATTTTTCAAGAGTC~3` (2572-2601);
SVCV-Real-time RT-RPA-P:5`~TGAGGTACCATGTTGAATTGGACATACAAT (FAM-dT)C(THF)AC(BHQ1-dT)CGCCCTTGAAGACGA(C3-spacer) ~3`。
5.Real-time RT-RPA反应体系的建立
Real-time RT-RPA反应用TwistAmp RT-exo试剂盒(TwistDX,Cambridge,UnitedKingdom)进行扩增,在50μl的体积内进行,体系为:Rehydration Buffer 29.5μL; 420nM上游引物;420nM下游引物;120nm探针,2μL模板RNA,1μL反转录酶,ddH2O补齐至47.5μL,将以上混合液轻微震荡后离心数秒;再加入2.5μL 的醋酸镁溶液;放置39℃金属浴中反应,时间为20min。结果可以使用一台带有恒温模块的荧光信号收集仪器实时进行监测。
6.灵敏度试验
把制备好的SVCV dsRNA阳性标准品10倍比例稀释用做模板进行 Real-time RT-RPA检测,模板浓度从106copies/μL~1copies/μL,共7个梯度, ddH2O做空白对照,重复三次Real-time RT-RPA实验。以确定建立的方法的灵敏度,结果见图2,可知灵敏性为102copies/μL。
7.特异性试验
通过检测SVCV阳性核酸以及其它病原病毒:锦鲤疱疹病毒Koi herpesvirus,KHV;鲤鱼浮肿病病毒carp edema virus,CEV;鲤疱疹病毒Ι型Carp pox cyprinidherpesvirus 1,CyHV-1;鲤疱疹病毒Ⅱ型Carp pox cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2;鱼传染性造血器官坏死病,nfectious haematopoietic necrosis offish,INTV,检测 Real-time RT-RPA反应的特异性,ddH2O做空白对照,结果见图3。特异性良好,与其他病原没有交叉反应。
8.重复性试验
在3个不同的时间段进行重复性试验,分别用106copies/μL、104copies/μL、103copies/μL的dsRNA阳性标准品为模板进行扩增,结果见表1。
表1 SVCV Real-time RT-RPA的重复性试验
结果如表1所示,106copies/μL在6分钟内即可出现扩增,样品浓度越高检测所需时间越短,变异系数在4.7%内。说明所建立的方法重复性好,稳定。
9.临床样品检测
用建立的Real time RT-RPA方法与Real time RT-PCR临床检测方法对实验室保存的25份临床样品进行检测对比,从而评价方法的准确性,见表2。
表2 Real-time RT-RPA与Real time RT-PCR临床检测对比
用本实验室检测的Real-time RT-RPA方法与Real time RT-PCR方法做对比,从表2结果显示,在25份样品中,Real-time RT-RPA方法检测结果阳性率为 52.38%,与Realtime RT-PCR检测结果阳性率52.38%一致。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明实施例,在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 广州动佰生物科技有限公司、浙江大学
<120> 基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法
<130> 2018
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ccacttacga ggagacac 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gaacagggaa ggaacacg 18
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tactctaaga aagctctttg gaatcaagaa 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tgtaatctac atcccaattt ttcaagagtc 30
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> 荧光基团FAM
<222> (31)..(31)
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n =THF
<220>
<221> 淬灭基团BHQ1
<222> (36)..(36)
<220>
<221> C3 spacer
<222> (51)..(51)
<400> 5
tgaggtacca tgttgaattg gacatacaat tcnactcgcc cttgaagacg a 51

Claims (10)

1.基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
包括如下实验步骤:
(1)提取病毒RNA,作为模板RNA;
(2)设计Real-time RT-RPA引物与探针;
(3)建立Real-time RT-RPA反应体系,对病毒RNA进行Real-time RT-RPA反应,实时荧光检测结果。
2.根据权利要求1所述的基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
所述Real-time RT-RPA的引物长度为30-35个碱基,探针长度为46-52个碱基,探针共有4个修饰基团,分别为荧光基团、相应的淬灭基团、四氢呋喃和C3-spacer;探针中部有两个胸腺嘧啶,两个胸腺嘧啶之间间隔1-4个碱基,所述两个胸腺嘧啶之间任一碱基由所述四氢呋喃取代,形成空碱基位;
荧光基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶上,淬灭基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶上;或者荧光基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶上,淬灭基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶上;从5’端到荧光基团之间至少有30个碱基,从淬灭基团到3’端之间至少有15个碱基;C3-spacer标记在3’端末端。
3.根据权利要求1所述的.基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
所述Real-time RT-RPA引物和探针如下:
SVCV-Real-time RT-RPA-F:
5`~TACTCTAAGAAAGCTCTTTGGAATCAAGAA-3`;
SVCV-Real-time RT-RPA-R:
5`~TGTAATCTACATCCCAATTTTTCAAGAGTC-3`;
SVCV-Real-time RT-RPA-P:
TGAGGTACCATGTTGAATTGGACATACAAT(FAM-dT)C(THF)AC(BHQ1-dT)CGCCCTTGAAGACGA(C3-spacer)。
4.根据权利要求1所述的基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
所述Real-time RT-RPA反应体系为:Rehydration Buffer 29.5μL;420nM上游引物;420nM下游引物;120nm探针,2μL模板RNA,1μL反转录酶,ddH2O补齐至47.5μL;再加入2.5μL的醋酸镁溶液。
5.根据权利要求1所述的.基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
所述Real-time RT-RPA反应过程:将Rehydration Buffer 29.5μL;420nM上游引物;420nM下游引物;120nm探针,2μL模板RNA,1μL反转录酶,ddH2O的混合液轻微震荡后离心数秒;再加入2.5μL的醋酸镁溶液;放置39℃金属浴中反应,时间为20min。
6.根据权利要求1所述的基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
还包括制备dsRNA阳性标准品,以进行灵敏度、特异性、重复性测试;
制备dsRNA阳性标准品的过程:提取病毒RNA,设计RT-PCR引物,RT-PCR扩增基因获得DNA,DNA与载体连接,得到重组子,转化重组子,扩大培养;提取质粒;转录出dsRNA阳性标准品。
7.根据权利要求6所述的.基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
提取病毒RNA的过程是:病料加1mL 1xPBS进行研磨,3000rpm离心10min,吸取200μL的上清液,加600μL的TRIZOL试剂,震荡混匀后静置5min;加入140μL的氯仿试剂,手动快速颠倒2min混匀,放置2min;4℃下12000rpm离心15min,取水相至EP1.5mL离心管后加等量的异丙醇,放置10min;在4℃下12000rpm下离心10min,倒掉上清液留下沉淀;加入600μL75%的乙醇洗涤沉淀,轻微震荡至沉淀悬起;4℃下12000rpm离心5min,倒出液体,打开EP管放置2min挥发酒精;加50μL RNase-free ddH2O溶解沉淀,反复吹打直至沉淀溶解,溶解后的溶液就是病毒RNA,放-80℃保存。
8.根据权利要求6所述的基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
根据SVCV公布的M序列,设计RT-PCR引物如下:
上游引物:5`~CCACTTACGAGGAGACAC~3`;
下游引物:5`~GAACAGGGAAGGAACACG~3`。
9.根据权利要求6所述的.基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
所述RT-PCR反应体系是:2×1Step Buffer 25μL,PrimeScript 1Step Enzyme Mix 2μL,上游引物2μL,下游引物2μL,模板RNA 2μL,用dH2O 17μL;
扩增程序为:50℃反转录30min;95℃灭活2min;95℃预变性5min;95℃变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸2min,共35个循环;72℃再延伸10min;4℃保存。
10.根据权利要求6所述的.基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法,其特征在于:
所述DNA与载体连接的过程是:RT-PCR扩增产物跑凝胶电泳、回收RT-PCR目的基因产物,RT-PCR目的基因产物与pGEM-T vector、2*buffer、T4DNA酶1μL混匀,放4℃连接过夜,得到重组子;
重组子转化大肠杆菌感受态细胞中,挑取阳性菌落扩大培养,操作是:将10μL重组子加入100μLDH5a大肠杆菌感受态细胞中轻轻混匀,冰浴30min;金属浴42℃热激90Sec后冰浴5min;加入1mL LB培养基后在200rpm、37℃的摇床上摇1h;涂布含有氨苄抗性的平板,挑取阳性菌落扩大培养。
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CN108998576A (zh) * 2018-09-13 2018-12-14 江苏省渔业技术推广中心 用于检测鲤春病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒

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