CN109652513B

CN109652513B - 基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN109652513B
Application number: CN201910136422.4A
Authority: CN
Inventors: 郎继东; 田埂
Original assignee: Geneis Beijing Co ltd
Current assignee: Geneis Beijing Co ltd
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-02-25
Also published as: CN109652513A

Abstract

本发明公开一种基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法，其包括(1)根据从受试者采集的液体样品中的细胞游离DNA的长度对细胞游离DNA进行分类，得到两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组；(2)从两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组中选择所需的细胞游离DNA组，并分析所需的细胞游离DNA组中的基因突变情形；(3)根据步骤(2)中得到的基因突变情形检测液体活检个体的突变。本发明的方法不仅提高了检测ctDNA突变的准确度，降低了常规实验方法检测的假阳性率及假阴性率，并且对于肿瘤早期筛查或者早期癌症患者的突变监测和监控提供了更为有效的手段。

Description

基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法和试剂盒。

背景技术

细胞游离DNA(Cell free DNA，缩写为cfDNA)通常是指长度为峰值约为167bp的双链DNA小片段，常出现在外周血或其它组织液中，主要来源于自身正常细胞的凋亡降解。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，缩写为ctDNA)是指人体血液循环***中不断流动的肿瘤来源的DNA片段，这些片段携带了很多关于肿瘤的信息，包括基因突变、缺失、***、重排、拷贝数异常及甲基化等。这些信息可用于检测肿瘤早期诊断、进展过程、预后判断及个性化用药指导，可见检测ctDNA的信息对于临床的重要性。

现有检测ctDNA突变的方法有很多，但基于二代测序的方法应用最多，检测手段也最为丰富。在基于二代测序的方法中最为主要的技术实现手段有两种：一种为高深度测序的目标区域捕获或扩增方法，另一种为加分子条形码或分子标签的建库测序方法。这两种方法在实验上依据常规二代测序建库方法，不仅可以有效的检测到样本ctDNA的高频突变，而且还能有效地检测到低频甚至超低频突变(>＝0.1％)。尽管如此，在基于此类结果的实际应用时仍然存在较大问题。因此，仍然需要更精确的基于二代测序的检测方法。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明发现在疾病的不同阶段ctDNA的变化存在一定规律，至少部分地基于此规律完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法，其包括以下步骤：

(1)根据从受试者采集的液体样品中的细胞游离DNA的长度对所述细胞游离DNA进行分类，得到两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组；

(2)从所述两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组中选择所需的细胞游离DNA组，并分析所需的细胞游离DNA组中的基因突变情形；

(3)根据步骤(2)中得到的基因突变情形检测所述液体活检个体的突变。

在某些实施方案中，步骤(1)中的所述液体样品选自血液、唾液、尿液、组织液以及它们的分离物。

在某些实施方案中，步骤(1)中利用凝胶电泳对所述细胞游离DNA进行分类，或者通过测序得到序列长度，并根据所得长度进行分类。

在某些实施方案中，在步骤(1)中，根据从受试者采集的液体样品中的细胞游离DNA的长度对所述细胞游离DNA进行分类，得到具有第一长度范围的细胞游离DNA组和具有第二长度范围的细胞游离DNA组，且第一长度范围小于第二长度范围。

在某些实施方案中，在步骤(2)中：

如果液体样品来自疾病早期的受试者，则将具有第二长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组；

如果液体样品来自疾病晚期受试者，则将具有第一长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组。

在某些实施方案中，在步骤(2)中：

如果检测目的在于为受试者进行早筛早诊，则将具有第二长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组；

如果检测目的在于提供用药指导或者耐药分析，则将具有第一长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组；

如果检测目的在于提供突变的动态监控，则将具有第一长度范围的细胞游离DNA和具有第二长度范围的细胞游离DNA组两者作为所需的细胞游离DNA组，且分别单独分析这两组细胞游离DNA组中的基因突变情形。

在某些实施方案中，所述第一长度范围为130-160bp，且所述第二长度范围为161-230bp。

在某些实施方案中，步骤(1)包括：

(1-1)提取液体样品中的细胞游离DNA；

(1-2)利用所述细胞游离DNA构建基因文库；

(1-3)通过凝胶电泳对得到的基因文库中的细胞游离DNA进行分类。

本发明的第二方面，提供一种基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的试剂盒，其包括：

(1)从来自受试者的液体样品中提取细胞游离DNA的试剂；

(2)将所述细胞游离DNA分离为两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组的试剂；

(3)分析细胞游离DNA的基因突变的试剂；和

(4)使用说明书，其中教导了实施根据权利要求1-8任一项所述方法的指引。

优选地，本发明的试剂盒进一步包括构建基因文库的试剂。

本发明建立了一种基于二代测序技术精确检测ctDNA突变的方法，不仅提高了检测ctDNA突变的准确度，降低了常规实验方法检测的假阳性率及假阴性率，并且对于肿瘤早期筛查或者早期癌症患者的突变监测和监控提供了更为有效的检测方法。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本发明所述的术语“细胞游离DNA”(Cell free DNA，缩写cfDNA)是指在体液(例如，血液)中以游离形式存在的短片段双链DNA。通常情况下，cfDNA从机体的细胞(包括正常细胞，如白血球；病变细胞，如肿瘤细胞；或衰老细胞)释放得到。cfDNA的长度一般为400bp以下，其中主要分布于130至180bp之间，并且一般情况下其峰值约为167bp。

本发明所述的术语“循环肿瘤DNA”(circulating tumor DNA，缩写ctDNA)是指体液如血液中存在的肿瘤来源的DNA片段，这些片段携带了很多关于肿瘤的信息，包括基因突变、缺失、***、重排、拷贝数异常及甲基化等。这些信息可用于检测肿瘤早期诊断、进展过程、预后判断及个性化用药指导。一般情况下，循环肿瘤DNA的长度范围400bp以下。

通过检测ctDNA来诊断或预测肿瘤等疾病的研究已得到越来越多的关注。然而，目前的研究多侧重于检测灵敏度的提高。例如，通过现有的二代测序技术可以有效地检测到低至>＝0.1％频率的突变，虽然高灵敏度有利于得到低浓度的突变，但是机体内ctDNA的含量及形态分布随着疾病的进展而不断发生变化，这种变化不利于得到更加符合实际情况的诊断或检测结果，甚至对疾病诊断产生假阴性或假阳性。

本发明的发明人研究发现，超低频突变(<～0.6％)的ctDNA片段长度整体要比对应的野生型cfDNA的片段长度要长。这与之前的研究结果不尽相同。例如，Jay Shendure在2016年的研究中指出，突变的ctDNA的片段长度(132～145bp)要比野生型的cfDNA的片段长度(165bp)短(Fragment Length of Circulating Tumor DNA.PLoS Genet.2016Jul 18；12(7))，并且利用数字微滴PCR(digital droplet PCR)验证了不同文库大小对突变的频率有一定的影响，比如文库大小为361bp，345bp，335bp，320bp，307bp及292bp，其对应的突变频率分别为0％，0.03％，1.6％，3.0％，0.09％及0％。再例如2018年Mouliere F发表的文章中(Enhanced detection of circulating tumor DNA by fragment size analysis.SciTransl Med.2018Nov 7；10(466).)也再次印证了这个观点。基于这些结论，发明人提出了基于片段大小的分析来增强ctDNA的检测的方案，从而可以补充或提供cfDNA的一些更深层次的研究方法。具体地，本发明包括以下内容。

[基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法]

本发明的第一方面，提供一种基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法，本发明的方法根据不同的情形来选择性检测特定长度的ctDNA，从而提高或增强检测的精确性。具体地，本发明的方法至少包括以下步骤：

(1)根据从受试者采集的液体样品中的细胞游离DNA的长度对所述细胞游离DNA进行分类，得到两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组。

(2)从两上以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组中选择所需的细胞游离DNA组，并分析所需的细胞游离DNA组中的基因突变情形。

(3)根据所述基因突变情形检测所述液体活检个体的突变。

步骤(1)

本发明的步骤(1)为根据从受试者采集的液体样品中的细胞游离DNA的长度对所述细胞游离DNA进行分类，得到两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组。

本发明的受试者可以是任何待检测的对象，包括哺乳动物以及人类。受试者可以是健康个体，也可以是疑似患有或确诊患有待诊断疾病的个体，例如，作为筛查对象的个体、早期诊断对象、疾病中期或晚期个体等。

本发明的液体样品可以是来自个体的任何体液，其实例包括但不限于血液、唾液、尿液和组织液，以及来自这些体液的分离物。分离物可以是分离后得到的单纯的一种物质，也可以是多种物质的混合物。例如，在体液为血液的情况下，其分离物包括血浆或血清等。

本发明的分类方法可采用本领域已知的任何方法，其实例包括但不限于凝胶电泳，或基于测序结果的分类方法。作为凝胶电泳包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或琼脂糖凝胶电泳等。凝胶电泳的条件及具体步骤在本领域是已知的，具体可参见例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物。作为基于测序结果的分类方法包括提取体液中的ctDNA的步骤、构建ctDNA文库的步骤、对文库进行测序的步骤以及基于测序得到的长度对片段进行分类的步骤等。

本发明中，通过分类可得到两个以上具有不同长度的细胞游离DNA组。具有不同长度的细胞游离DNA组的个数不特别限定，可以是2-50，优选2-10个，更优选2-5个。在某些实施方案中，通过分类得到两个细胞游离DNA组，即具有第一长度范围的细胞游离DNA组和具有第二长度范围的细胞游离DNA组，且第一长度范围小于第二长度范围。在某些实施方案中，通过分类得到三个细胞游离DNA组，即具有第一长度范围的细胞游离DNA组、具有第二长度范围的细胞游离DNA组和具有第三长度范围的细胞游离DNA组，且第一长度范围小于第二长度范围，第二长度范围小于第三长度范围。

本发明中，长度范围的跨度(长度范围的上限值与下限值之差)不特别特定，可根据不同体液类型、疾病类型、个体类型而由本领域技术人员自行设定。通常情况下，长度范围的跨度1-350，优选1-300，更优选1-200。不同的细胞游离DNA组中，长度范围的跨度可以相同，也可以不同。例如，在第一长度范围的跨度为1的情况下，第二长度范围的跨度可以是1，也可以是除1之外的任何长度，例如5、8、10等。本发明的长度范围也不特别限定，通常情况下为50-400bp，优选60-350bp，更优选80-300bp，进一步优选100-250bp等。在某些实施方案中，本发明的长度范围为130-160bp或161-230bp。

为了提高分类效果，步骤(1)中可包括多个子步骤。例如可包括以下三个子步骤：

(1-1)提取液体样品中的细胞游离DNA；

(1-2)利用细胞游离DNA构建测序文库；

(1-3)通过凝胶电泳对文库中的细胞游离DNA进行分类。

这些子步骤的操作条件在本领域内是已知的，具体可参见例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物。

步骤(2)

本发明的步骤(2)为从两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组中选择所需的细胞游离DNA组，并分析所需的细胞游离DNA组中的基因突变情形。

本发明中，所需的细胞游离DNA组为从分类得到的结果中选择/筛选/挑选的用于进一步分析或检测的细胞游离DNA组。即，通过分类后根据需要选择特定长度的部分，并将对后续分析或检测带来不利影响的特定长度的片段排除在检测外。这种分类并非传统的ctDNA纯化。根据不同的检测目的或根据不同的检测对象类型，所需的细胞游离DNA组也不同。一般而言，在突变发生的可能性大的情况下，选择具有较小长度的细胞游离DNA组。相反，在突变发生的可能性小的情况下，选择具有较大长度的细胞游离DNA组。例如，在通过分类得到具有第一长度范围的细胞游离DNA组和具有第二长度范围的细胞游离DNA组，且第一长度范围小于第二长度范围的情况下，如果液体样品来自疾病早期的受试者，则将具有第二长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组；如果液体样品来自疾病晚期受试者，则将具有第一长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组。在相同的情况下，如果检测目的在于为受试者进行早筛早诊，则将具有第二长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组；如果检测目的在于提供用药指导或者耐药分析，则将具有第一长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组；如果检测目的在于提供突变的动态监控，则将具有第一长度范围的细胞游离DNA和具有第二长度范围的细胞游离DNA组两者作为所需的细胞游离DNA组。

本发明的步骤(2)进一步包括在所需的细胞游离DNA组的范围内分析基因突变情形。其中基因突变情形包括但不限于基因突变的类型(例如，SNP突变，缺失突变Indel，或两者的组合等)、基因突变的频率(例如，30％、1％等)。具体分析方法不特别限定，例如可包括将测序结果与参考序列比对的步骤。在某些实施方案中，分析基因突变的方法包括将测序序列与已知序列，例如人类基因组序列(Hg19：http://hgdownload.soe.ucsc.edu/ goldenPath/hg19/bigZips/)进行比对的步骤。

步骤(3)

本发明的步骤(3)为根据步骤(2)中得到的基因突变情形检测所述液体活检个体(也可称作受试者)的突变。本发明中，可将步骤(2)中得到的基因突变情形例如基因突变频率直接作为检测液体活检个体的突变的结果，也可根据步骤(2)中得到的基因突变情形来预测或判断液体活检个体的突变。

本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，上述步骤的顺序并不特别限定。此外，在上述步骤(1)-(3)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。

在示例性实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：

1.收集液体活检样本，比如外周血、唾液、尿液等；

2.提取样本中的游离DNA；

3.利用建库试剂盒进行文库构建；

4.通过琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，选择但不限于选择130-160bp及161-230bp的目的条带的文库；

5.杂交捕获或直接按第6步直接测序；

6.利用但不限于利用Illumina测序仪进行双端测序，得到测序数据；

7.将原始测序数据进行去低质量及去接头污染序列，得到处理后的待分析数据；

8.将7中得到的数据比对到人类参考基因组(Hg19：http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/)；

9.提取双端测序序列均比对上的结果，并且分别按照双端测序序列的比对距离位置130-160bp及161-230bp进行分类，得到集合A、B；

10.分别对集合A、B的序列集合进行突变检测；

11.比较集合A、B的突变结果，并且根据样本类型或者检测目的进行筛选结果：如果样本类型为早期患者(例如疾病进展I期或者进展II期)或者检测目的为健康人的早筛早诊，那么选择集合B的突变结果来进行预判；如果样本类型为晚期患者(例如疾病进展III期及以上)或者检测目的为用药指导或者耐药分析等，那么选择集合A的突变结果进行预判；如果检测目的为突变的动态监控或其它，那么集合A、B的结果要进行结合预判。

[基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的试剂盒]

本发明的第二方面，提供基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的试剂盒。本发明的试剂盒至少包括以下几种成分：

(1)从来自受试者的液体样品中提取细胞游离DNA的试剂；

(2)将细胞游离DNA分离为两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组的试剂；

(3)分析细胞游离DNA的基因突变的试剂；和

(4)使用说明书，其中教导了实施本发明第一方面所述方法的指引。

试剂(1)

本发明的试剂盒中，试剂(1)用于从来自受试者的液体样品中提取细胞游离DNA。试剂(1)一般情况下为多种试剂成分的组合，每种试剂可以是单独一种成分，也可以是多种不同成分的混合物。在示例性实施方案中，本发明的试剂(1)包括缓冲液、蛋白酶K等。缓冲液的实例包括缓冲液ACL、缓冲液ACB、缓冲液ACW、缓冲液AVE等。这些缓冲液在本领域是已知的。

试剂(2)

本发明的试剂盒中，试剂(2)用于将细胞游离DNA分离为两个以上具有不同长度范围的细胞游离DNA组。在某些实施方案中，本发明的试剂(2)包括用于构建测序文库的试剂。在某些实施方案中，本发明的试剂(2)包括用于凝胶电泳的试剂。优选地，凝胶电泳中的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。电泳时凝胶的浓度不特别限定，通常在0.5-3重量％之间。本领域技术人员可根据需要和各种因素(低浓度胶易碎，而高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象)而自由选择所需的浓度。例如，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳。高浓度凝胶一般用来进行小片段分析。

试剂(3)

本发明的试剂盒中，试剂(3)用于分析细胞游离DNA的基因突变。试剂(3)可使用本领域已知的试剂，或多种试剂的组合。优选地，试剂(3)包括二代测序时使用的试剂，其实例包括用于进行PCR所需的DNA聚合酶、各类dNTP和离子如Mg²⁺等。

使用说明书

本发明中的试剂盒进一步包含使用说明书。其中在使用说明书中给出或教导了实施本发明第一方面所述方法或使用本发明所述试剂盒的指导、指引或教导。

需要说明的是，本发明所述的各种试剂或成分均可以是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。

实施例

选取11例已知阳性突变的血液样本(样本情况参见下表1)通过本发明的实验及数据分析方法来检测点突变。

具体以1例实施例Sample1(KRAS:p.G12C)举例，其余实施例重复步骤1-11，如下：

1.收集Sample1的外周血样本；

2.利用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取Sample1外周血中的cellfree DNA；

3.以20ng DNA起始，使用AB clonal的Rapid DNA Lib Prep Kit建库试剂盒进行文库构建；

4.通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，取1.2mg使用Qiagen的胶纯化试剂盒QIA quick Gel Extraction Kit纯化，切胶回收130-160bp及161-230bp的目的条带的文库；

5.利用Integrated DNA technologies设计的目标区域捕获探针对4所得文库进行杂交捕获；

6.利用Illumina Nextseq500测序仪进行双端读长150bp测序，得到Sample1的原始测序数据fastq格式文件；

7.将6中得到的原始测序数据利用cutadapt软件进行去低质量及去接头污染序列，得到处理后的待分析数据fastq格式文件；

8.将7中得到的待分析数据fastq序列利用BWA软件的aln方法比对到人类参考基因组，得到Sam格式的文件；

9.利用Samtools软件对Sam格式进行排序去重复处理，得到Bam文件，并且利用Samtools软件在Bam文件中提取出双端测序序列均比对上的所有序列结果，分别按照双端测序序列的比对距离位置130-160bp及161-230bp进行分类，得到集合A、B；

10.利用Freebayes软件分别对集合A、B的序列集合进行突变(SNP+Indel)检测；

11.比较集合A、B的突变结果，集合A中检测到的KRAS的p.G12C的突变频率为13.3％，集合B中检测到的KRAS的p.G12C的突变频率为6.5％。已知Sample1样本为肺癌IV期患者，所以选择集合A的突变结果进行预判，及该样本的KRAS的p.G12C的突变频率为13.3％。将该样本进行数字微滴PCR(Digital Droplet PCR)绝对定量验证，发现该位点的突变频率为17.26％，即与集合A中的突变频率更为接近一致。

所有6个样本检测结果详细信息如表1所示。可见对于Sample4及Sample5，如果用常规方法检测会出现假阴性的结果，由此更加体现了本发明方法的精确性。

表1.6个样本的检测频率结果统计

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

Claims

1.一种基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据从受试者采集的液体样品中的细胞游离DNA的长度对所述细胞游离DNA进行分类，得到具有第一长度范围和第二长度范围的两个细胞游离DNA组；

(2)从具有不同长度范围的细胞游离DNA组中选择所需的细胞游离DNA组，并分析所需的细胞游离DNA组中的基因突变情形；

(3)根据步骤(2)中得到的基因突变情形检测所述液体活检个体的突变，

其中，在步骤(2)中：

如果液体样品来自疾病晚期受试者，则将具有第一长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组；

其中，所述方法为非诊断目的方法，所述疾病为肺癌，所述第一长度范围为130-160bp，所述第二长度范围为161-230bp，所述细胞游离DNA包含KRAS、EFGR和/或PIK3CA基因。

2.根据权利要求1所述的基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法，其特征在于，步骤(1)中的所述液体样品选自血液、唾液、尿液、组织液以及它们的分离物。

3.根据权利要求1所述的基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法，其特征在于，步骤(1)中利用凝胶电泳对所述细胞游离DNA进行分类，或者通过测序得到序列长度，并根据所得长度进行分类。

4.根据权利要求1所述的基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法，其特征在于，在步骤(1)中，根据从受试者采集的液体样品中的细胞游离DNA的长度对所述细胞游离DNA进行分类，得到具有所述第一长度范围的细胞游离DNA组和具有所述第二长度范围的细胞游离DNA组，且所述第一长度范围小于所述第二长度范围。

5.根据权利要求1所述的基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法，其特征在于，步骤(1)包括：

(1-1)提取液体样品中的细胞游离DNA；

(1-2)利用所述细胞游离DNA构建基因文库；

6.试剂在制备基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂包括：

(1)从来自受试者的液体样品中提取细胞游离DNA的试剂；

(2)将所述细胞游离DNA分离为具有第一长度范围和第二长度范围的两个细胞游离DNA组的试剂；和

(3)分析包含KRAS、EFGR和/或PIK3CA的细胞游离DNA的基因突变的试剂；

所述基于二代测序技术精确检测液体活检个体突变的方法包括：

其中，在步骤(2)中：

如果检测目的在于为受试者进行疾病早筛早诊，则将具有第二长度范围的细胞游离DNA组作为所需的细胞游离DNA组；

其中，所述疾病为肺癌，所述第一长度范围为130-160bp，所述第二长度范围为161-230bp。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂进一步包括构建基因文库的试剂。