CN109652493B - 颤杆菌克属在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种微生物标志物在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用，所述的微生物标志物为颤杆菌克属。

Description

颤杆菌克属在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用
技术领域
本发明属于生物鉴别和/或区分领域，具体涉及颤杆菌克属在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用。
背景技术
人体肠道中存在大量的共生菌群，其数量超过 1000万亿个，大约是人体细胞总数的 10 倍。同时肠道内微生物基因的数量约为 300 万个，大约是人类基因组基因数量的100 多倍，如此海量的基因能够帮助微生物适应多变的环境，形成了与人体密不可分的共生关系。不同遗传背景和生活习惯的居民其肠道菌群组成存在较大差异，例如拟杆菌属是西方居民肠道中相对含量最多且个体间差异最大的细菌属，韩国居民是栖粪杆菌属。目前我国不同民族肠道菌群结构差异对比的研究数据尚不足。
孜白旦·阿不来提在硕士学位论文《汉族、维吾尔族乳腺癌患者与健康对照肠道菌群差异性研究》中研究表明健康汉族与健康组吾尔族妇女肠道菌群在结构比例上存在着显著的差异,这种结果可能与基因型及饮食结构的不同有所关联。
颤杆菌克属属细菌硬壁菌门，喜树科。既往研究表明颤杆菌克属在健康人群肠道中的相对丰度显著高于克罗恩病的人群。迄今为止，尚未见粪便中颤杆菌克属相对丰度检测应用于鉴别和/或区分人群民族的报道。
发明内容
第一方面，本发明提供一种微生物标志物在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用，所述的微生物标志物为颤杆菌克属。
所述的颤杆菌克属包括颤杆菌（Oscillibacter valericigenes）。
所述不同民族为藏族和汉族，优选为高原上的藏族和汉族。
所述的高原为海拔2000m以上，具有低压、缺氧的条件。
进一步优选的，所述的高原环境为海拔2700m以上，具有低压、缺氧的条件下。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的高原环境为海拔3500m以上，具有低压、缺氧的条件下。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的高原环境为海拔5500m以上，具有低压、缺氧的条件下。
第二方面，本发明提供一种鉴别和/或区分不同民族个体的方法，所述的方法的步骤包括：
（1）确定所述的个体的粪便或肠道内容物中的微生物标志物的丰度；
（2）将微生物标志物的丰度值与阈值比较，得知个体的民族。
优选的，所述的步骤（1）中利用测序法测定微生物标志物的丰度。
更优选的，所述的步骤（1）中包括：
1）收集待检测个体的粪便或肠道内容物，并提取粪便或肠道内容物中微生物的DNA；
2）目的片段的扩增；
3）测序；
4）计算微生物标志物的丰度。
所述的步骤1）中粪便或肠道内容物中微生物的DNA的提取方法选自：CTAB法、GITC法或利用商业化的试剂盒进行。
优选的，利用CTAB法提取粪便或肠道内容物中微生物的DNA。
具体的，将收集到的粪便或肠道内容物用CTAB、溶菌酶和裂解液处理后，用苯酚 、氯仿和异戊醇处理使DNA游离及去除杂蛋白、利用异丙醇使DNA析出，用乙醇纯化DNA后得到粪便或肠道内容物中微生物的DNA。
更具体的，收集待检测个体的粪便，吸取500- 1000ul CTAB裂解液至EP管里，加入溶菌酶，将200-500ul左右的样品加入裂解液中，50-70℃水浴条件下反应，离心取上清， 加苯酚 （pH8.0）：氯仿：异戊醇 （20-30：18-28：1），颠倒混匀，10000-12000rpm离心10-15min。取上清，加氯仿：异戊醇（20-30:1），颠倒混匀，10000-12000rpm离心10-15min。取上清，加入异丙醇，上下摇晃，-20℃沉淀。10000-12000rpm离心10-15min，将沉淀用乙醇洗涤2-5次，将沉淀晾干，加入水溶解沉淀，加 RNase A消化RNA后既得粪便或肠道内容物中微生物的DNA。
所述的步骤2）中使用带 Barcode的特异引物515F和806R对步骤（1）中获得的DNA进行扩增，所述的515F的序列为5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’（SEQ ID NO：1），所述的806R的序列为5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（SEQ ID NO：2）。
所述的步骤3）中是利用高通量测序法对步骤（2）中获得的产物进行测序。
所述的步骤4）中将测序得到的数据聚类成为OTUs（Operational TaxonomicUnits），对物种注释分析后，计算微生物标志物的丰度。
具体的，所述的步骤4）中将步骤3）中测序得到的数据进行处理，利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/）对有效数据进行聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），用Mothur方法与SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库对OTUs序列进行物种注释分析，以（微生物标志物OTU值）/（检测样本检测到的所有菌属OTU值）表示微生物标志物相对丰度。
所述的步骤（2）中将测得的微生物标志物的丰度与阈值比较，大于阈值为一个民族，小于阈值为另一个民族。
所述的阈值是通过对已知民族的人群进行微生物标志物的丰度的检测后所建立的受试者工作特征曲线的约登指数为最大值时得到的微生物标志物的丰度。
优选的，本发明提供一种鉴别和/或区分个体为藏族或汉族的方法，所述的方法的步骤包括：
（1）确定所述的个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的丰度；
（2）将颤杆菌克属的丰度与阈值比较，所述的阈值为1.51×10-3，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的丰度大于1.51×10-3，则该个体为藏族，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的丰度小于1.51×10-3，则该个体为汉族。
所述的步骤（1）中包括：
1）收集待检测个体的粪便或肠道内容物，并提取粪便或肠道内容物中微生物的DNA；
2）目的片段的扩增；
3）测序；
4）计算颤杆菌克属的丰度。
所述的步骤1）中粪便或肠道内容物中微生物的DNA的提取方法选自：CTAB法、GITC法或利用商业化的试剂盒进行。
优选的，利用CTAB法提取粪便或肠道内容物中微生物的DNA。
具体的，将收集到的粪便或肠道内容物用CTAB、溶菌酶和裂解液处理后，用苯酚 、氯仿和异戊醇处理使DNA游离及去除杂蛋白、利用异丙醇使DNA析出，用乙醇纯化DNA后得到粪便或肠道内容物中微生物的DNA。
更具体的，收集待检测个体的粪便，吸取500- 1000ul CTAB裂解液至EP管里，加入溶菌酶，将200-500ul左右的样品加入裂解液中，50-70℃水浴条件下反应，离心取上清， 加苯酚 （pH8.0）：氯仿：异戊醇 （20-30：18-28：1），颠倒混匀，10000-12000rpm离心10-15min。取上清，加氯仿：异戊醇（20-30:1），颠倒混匀，10000-12000rpm离心10-15min。取上清，加入异丙醇，上下摇晃，-20℃沉淀。10000-12000rpm离心10-15min，将沉淀用乙醇洗涤2-5次，将沉淀晾干，加入水溶解沉淀，加 RNase A消化RNA后既得粪便或肠道内容物中微生物的DNA。
所述的步骤2）中使用带 Barcode的特异引物515F和806R对步骤（1）中获得的DNA进行扩增，所述的515F的序列为5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’（SEQ ID NO：1），所述的806R的序列为5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（SEQ ID NO：2）。
所述的步骤3）中是利用高通量测序法对步骤（2）中获得的产物进行测序。
所述的步骤4）中将测序得到的数据聚类成为OTUs（Operational TaxonomicUnits），对物种注释分析后，计算颤杆菌克属的丰度。
具体的，所述的步骤4）中将步骤3）中测序得到的数据进行处理，利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/）对有效数据进行聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），用Mothur方法与SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库对OTUs序列进行物种注释分析，以（颤杆菌克属OTU值）/（检测样本检测到的所有菌属OTU值）表示颤杆菌克属相对丰度。
所述的颤杆菌克属包括颤杆菌（Oscillibacter valericigenes）。
第三方面，本发明提供检测微生物标志物丰度的产品在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用。
所述的检测微生物标志物丰度的产品包括用于检测微生物标志物丰度的试剂、仪器或装置。
优选的，所述的检测微生物标志物丰度的产品为检测颤杆菌克属丰度的产品。
所述的颤杆菌克属包括颤杆菌（Oscillibacter valericigenes）。
优选的，所述的鉴别和/或区分不同民族个体是指鉴别和/或区分个体为藏族或汉族。
第四方面，本发明提供一种用于鉴别和/或区分不同民族个体的产品，所述的产品中含有用于检测微生物标志物丰度的试剂、仪器或装置。
优选的，所述的鉴别和/或区分不同民族个体的产品为鉴别和/或区分个体为藏族或汉族的产品。
优选的，所述的产品中含有检测颤杆菌克属丰度的试剂、仪器或装置。
所述的颤杆菌克属包括颤杆菌（Oscillibacter valericigenes）。
本发明中所述的微生物丰度指在某一微生物群体中该种微生物的丰度程度，例如，在肠道微生物群体中该种微生物的丰富程度，可表示为该种微生物在该群体中的含量。
附图说明
图1：所示为箱式图显示的汉藏族肠道群中颤杆菌克属的相对丰度的差异；
图2：所示为ROC曲线显示颤杆菌克属相对丰度鉴别诊断高原人群汉藏来源的敏感性和特异性。
图3：为藏族士兵组（Zang）粪便中群落组成。
图4：汉族士兵（Han）组粪便中群落组成。
具体实施方式
实施例1利用个体粪便中颤杆菌克属的相对丰度鉴别受试者为藏族或汉族
（1）确定所述的个体的粪便样本中的所述的微生物标志物的丰度：
1）收集待检测个体的粪便，并提取粪便中微生物的DNA：
收集待检测个体的粪便，吸取 1000ul CTAB裂解液至2.0ml EP管里，加入溶菌酶，将500ul左右的样品加入裂解液中，65℃水浴，期间颠倒混匀数次，以使样品充***解。离心取上清，加苯酚 （pH8.0）：氯仿：异戊醇 （25：24：1），颠倒混匀，12000rpm离心10min。取上清，加氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000rpm 离心10min。吸取上清至1.5mL离心管里，加入异丙醇，上下摇晃，-20℃沉淀。12000rpm离心10 分钟，倒出液体，注意不要倒出沉淀。用1ml 75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出。超净工作台吹干或者室温晾干。加入 ddH2O溶解 DNA 样品，加 RNase A 1ul消化RNA，37℃放置15min。之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。
2）目的片段的扩增：
以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据测序区域16S V3-V4，选择使用带 Barcode的特异引物：
515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’（SEQ ID NO：1），
806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（SEQ ID NO：2），
New England Biolabs 公司的 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mixwith GC Buffer，和高效高保真酶（TransFast® Taq DNA Polymerase）进行PCR，确保扩增效率和准确性。
PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用1×TAE 浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，剪切回收目标条带。产物纯化试剂盒使用的是Thermo Scientific 公司GeneJET 胶回收试剂盒回收产物。
3）测序：
使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序。
4）计算颤杆菌克属的丰度：
①测序数据处理：使用Cutadapt（V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先对reads进行低质量部分剪切，再根据Barcode从得到的reads中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据，经过以上处理后得到的Reads需要进行去除嵌合体序列的处理，Reads序列通过与物种注释数据库进行比对 检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。
②OTU聚类和物种注释：利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/）对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。 对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8~1），获得分类学信息并分别在属水平统计汉族士兵、藏族士兵的群落组成（见图3、4）。颤杆菌克属相对丰度用（颤杆菌克属OTU值）/（检测样本检测到的所有菌属OTU值）表示。
（2）将待检测个体粪便中颤杆菌克属的丰度与1.51×10-3比较，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的丰度大于1.51×10-3，则该个体为藏族，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的丰度小于1.51×10-3，则该个体为汉族。
实施例2利用颤杆菌克属的相对丰度鉴别受试者的民族的可行性鉴定
研究人群：
受试者为中国服役男性士兵，实验组为128个***原汉族士兵。严格控制两组人群的进行相同的中国部队混合饮食，保持相同的海拔3500米训练环境和训练强度，戒烟、酒，持续3个月。排除有慢性炎性疾病、口服抗生素、急性感染和胃肠道疾病的士兵。
方法：
（1）确定所述的个体的粪便样本中的所述的微生物标志物的丰度：
1）收集待检测个体的粪便，并提取粪便中微生物的DNA：
收集待检测个体的粪便，吸取 1000ul CTAB裂解液至2.0ml EP管里，加入溶菌酶，将500ul左右的样品加入裂解液中，65℃水浴，期间颠倒混匀数次，以使样品充***解。离心取上清， 加苯酚 （pH8.0）：氯仿：异戊醇 （25：24：1），颠倒混匀，12000rpm离心10min。取上清，加氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000rpm 离心10min。吸取上清至1.5mL离心管里，加入异丙醇，上下摇晃，-20℃沉淀。12000rpm离心10 分钟，倒出液体，注意不要倒出沉淀。用1ml 75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出。超净工作台吹干或者室温晾干。加入 ddH2O溶解 DNA 样品，加 RNase A 1ul消化RNA，37℃放置15min。之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。
2）目的片段的扩增：
以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据测序区域16S V3-V4，选择使用带 Barcode的特异引物：
515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’（SEQ ID NO：1），
806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（SEQ ID NO：2），
New England Biolabs 公司的 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mixwith GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。
PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用1×TAE 浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，剪切回收目标条带。产物纯化试剂盒使用的是Thermo Scientific 公司GeneJET 胶回收试剂盒回收产物。
3）测序：
使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序。
4）计算颤杆菌克属的丰度：
①测序数据处理：使用Cutadapt（V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先对reads进行低质量部分剪切，再根据Barcode从得到的reads中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据，经过以上处理后得到的Reads需要进行去除嵌合体序列的处理，Reads序列通过与物种注释数据库进行比对 检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。
②OTU聚类和物种注释：利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/）对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。 对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8~1），获得分类学信息并分别在属水平统计汉族士兵、藏族士兵的群落组成（见图3、4）。颤杆菌克属相对丰度用（颤杆菌克属OTU值）/（检测样本检测到的所有菌属OTU值）表示。
结果：
图1所示为汉藏族肠道群中颤杆菌克属的相对丰度的差异的箱式图，由图1所示，高原汉族人群中颤杆菌克属相对丰度为9.50×10-4，高原藏族人群中颤杆菌克属的相对丰度为1.63×10-3，藏族人群颤杆菌克属相对丰度显著高于汉族人群。
通过上述验证试验说明可以利用本发明提供的利用个体粪便中的颤杆菌克属相对丰度鉴别个体的民族。
实施例3构建ROC曲线比较评估菌属相对丰度鉴别高原汉族人群和藏族人群的能力
采用受试者工作曲线（ROC）法进行验证，通过受试者粪便中的颤杆菌克属相对丰度判断其用于鉴别高原汉族人群和藏族人群的能力。差异比较因为样本非正态分布采用Mann-Whitney检验。绘制ROC曲线评估菌属相对丰度对高原汉族人群和藏族人群的鉴别诊断敏感性和特异性，计算界值，P＜0.05为差异有统计学意义，采用SPSS22.0软件包进行统计学处理。
结果如图2所示，由图2的结果表明，ROC曲线显示颤杆菌克属相对丰度鉴别诊断高原人群汉藏来源的AUC（ROC曲线下面积）值为0.647，说明颤杆菌克属相对丰度判断其用于鉴别高原汉族人群和藏族人群，在菌属相对丰度为1.51×10-3时，可得到最大的约登指数0.312，敏感度和特异性分别为0.768和0.544，正确率为0.699，F1分数为0.699，说明利用16SrRNA测序检测粪便标本颤杆菌克属相对丰度，可以鉴别高原人群来源是藏族还是汉族，当颤杆菌克属相对丰度大于1.51×10-3可判定为藏族。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 颤杆菌克属在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgccagcmg ccgcggtaa 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (6)

1.一种微生物标志物在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用，所述的微生物标志物为颤杆菌克属，所述不同民族为高原上的藏族和高原上的汉族，所述的高原为海拔3500m以上，其中，将颤杆菌克属的相对丰度与阈值比较，所述的阈值为1.51×10-3，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的相对丰度大于1.51×10-3，则该个体为藏族，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的相对丰度小于1.51×10-3，则该个体为汉族，所述的相对丰度用“颤杆菌克属OTU（Operational Taxonomic Unit）值”/“检测样本检测到的所有菌属OTU值”表示。
2.根据权利要求1所述的微生物标志物在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用，其特征在于，所述的颤杆菌克属包括颤杆菌(Oscillibactervalericigenes)。
3.一种鉴别和/或区分个体为藏族或汉族的方法，所述的方法的步骤包括：
(1)确定所述的个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的相对丰度；
(2)将颤杆菌克属的相对丰度与阈值比较，所述的阈值为1.51×10-3，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的相对丰度大于1.51×10-3，则该个体为藏族，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的相对丰度小于1.51×10-3，则该个体为汉族；
其中，藏族或汉族为高原上的藏族或高原上的汉族，所述的高原为海拔3500m以上，所述的相对丰度用“颤杆菌克属OTU（Operational Taxonomic Unit）值”/“检测样本检测到的所有菌属OTU值”表示。
4.根据权利要求3所述的鉴别和/或区分个体为藏族或汉族的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中包括：
1)收集待检测个体的粪便或肠道内容物，并提取粪便或肠道内容物中微生物的DNA；
2)目的片段的扩增；
3)测序；
4)计算颤杆菌克属的相对丰度。
5.检测微生物标志物相对丰度的产品在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用，所述的微生物标志物为颤杆菌克属，所述不同民族为高原上的藏族和高原上的汉族，所述的高原为海拔3500m以上，其中，将颤杆菌克属的相对丰度与阈值比较，所述的阈值为1.51×10-3，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的相对丰度大于1.51×10-3，则该个体为藏族，当个体的粪便或肠道内容物中的颤杆菌克属的相对丰度小于1.51×10-3，则该个体为汉族，所述的相对丰度用“颤杆菌克属OTU（Operational Taxonomic Unit）值”/“检测样本检测到的所有菌属OTU值”表示。
6.根据权利要求5所述的检测微生物标志物相对丰度的产品在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用，其特征在于，所述的检测微生物标志物相对丰度的产品包括用于检测微生物标志物相对丰度的试剂、仪器或装置。
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