CN109646441A - Shp-2抑制剂在制备靶向前神经元型胶质瘤的药物中的应用 - Google Patents

Shp-2抑制剂在制备靶向前神经元型胶质瘤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了SHP‑2抑制剂在制备治疗前神经元型胶质瘤的药物中的应用。本发明还提供了一种治疗前神经元型胶质瘤的药物，为以SHP‑2抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。实验结果表明，SHP‑2抑制剂(SHP099)对正常细胞的毒性小，而对前神经元型胶质瘤细胞株的增殖及克隆形成能力的抑制作用均显著强于对照组细胞株。SHP099还能特异性诱导前神经元型胶质瘤细胞株的细胞周期阻滞。因此使用SHP099诱导细胞周期阻滞的同时联用TMZ或放疗，能够进一步增强前神经元型胶质瘤的治疗反应性。SHP099口服后血脑屏障通透性高，使其具备常见SHP‑2抑制剂难以达到的最佳成药性。本发明提供了SHP099特异性靶向前神经元型胶质瘤的新颖治疗策略，临床应用前景良好。

Description

SHP-2抑制剂在制备靶向前神经元型胶质瘤的药物中的应用
技术领域
本发明涉及SHP099靶向前神经元型胶质瘤的新颖治疗策略。
背景技术
最新的中国癌症统计数据显示，脑肿瘤发病率在中国高发肿瘤中列第八位，其死亡率居第九位。其中，胶质瘤是成人最常见的原发恶性脑肿瘤，呈浸润性生长，手术难以彻底切除，恶性程度最高。目前胶质瘤的常规治疗方案是术后替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)同步放化疗加TMZ辅助治疗。然而，即使再联合使用生物免疫疗法等诸多治疗方案，胶质瘤患者的平均生存期仍然不足两年。因此，亟需依据不同分子特征的胶质瘤的发生发展分子机制探寻针对性、个体化新颖治疗药物，从而为胶质瘤患者的“个体化精准医疗”提供理论依据和治疗策略。
后基因组时代的发展推进人们的胶质瘤的分子特征的深入认知。在转录水平，Phillips等将高度恶性胶质瘤对应于不同阶段神经发生过程中的细胞类型，区分为前神经元型、增殖(Proliferative,Prolif)型以及MES型三种亚型。Brennan和Verhaak在蛋白质组学和基因组水平上再现了这些亚型。这些研究均提示亟需对不同分型高度恶性胶质瘤患者研发个体化治疗新策略，从而为“个体化精准医疗”奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种前神经元型胶质瘤的新颖治疗策略。
为了解决上述技术问题，本发明提供了SHP-2抑制剂在制备治疗前神经元型胶质瘤的药物中的应用。
本发明还提供了SHP-2抑制剂联合替莫唑胺在制备治疗前神经元型胶质瘤的药物中的应用。
优选地，所述SHP-2抑制剂为SHP099。
一种治疗前神经元型胶质瘤的药物，其特征在于，为以包含SHP-2抑制剂的活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
优选地，所述SHP-2抑制剂为降低SHP-2活性的药物。
优选地，所述SHP-2抑制剂为SHP099。
优选地，所述前神经元型胶质瘤的药物的活性成分还包含替莫唑胺。
本发明的原理如下：
非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2，在生长因子受体信号转导通路下游发挥重要作用，是最早证实的致癌酪氨酸磷酸酶。SHP-2的活化突变与发育病理学(例如Noonan综合征)和多种癌症(包括白血病、肺癌、乳腺癌和前神经元型胶质瘤等)相关。SHP-2主要通过激活RAS-ERK信号传导通路促进细胞增殖、存活。因此，国内外研究者相继研发出NSC-87877、PHPS-1、Fumosorinone等SHP-2选择性抑制剂，并验证了其在乳腺癌、胶质瘤等肿瘤的治疗效应。值得注意的是，研究表明SHP-2在表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)激活的胶质瘤中同时具有驱动ERK1/2和拮抗STAT3通路活性的能力，因此SHP-2抑制剂在抑制该亚型胶质瘤细胞增殖的同时又增加了其对EGFR和c-MET共抑制的抗性，成为“双刃剑”。而SHP-2抑制剂对前神经元型胶质瘤的治疗效应目前并未引起广泛关注。
我们的实验结果表明，SHP-2抑制剂(SHP099)对LN229、U87MG等胶质瘤细胞株的增殖抑制作用显著强于正常对照胶质细胞(NHA)，选择性好。更为突出的是SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株LN444/PDGF-A、Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A的增殖及克隆形成能力的抑制作用均显著强于对照组细胞株LN444、Ink4a/Arf-/-mAst，使前神经元型胶质瘤细胞株对SHP099更敏感。深入研究发现SHP099还能特异性诱导前神经元型胶质瘤细胞株的细胞周期阻滞。因此使用SHP099诱导细胞周期阻滞的同时联用TMZ或放疗，有望进一步增强前神经元型胶质瘤的治疗反应性。SHP099口服后血脑屏障通透性高。在裸鼠和免疫健全的正常C57BL/6小鼠，SHP099单独给药或者与TMZ、放疗联用均能显著延长小鼠生存期。因此，本专利侧重在SHP099及其与TMZ或放疗联用提高前神经元型胶质瘤的治疗反应性，探讨SHP-2抑制剂及其与TMZ或放疗联用对前神经元型胶质瘤个体化治疗的特异性增敏效应。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了SHP099特异性靶向前神经元型胶质瘤的新颖治疗策略。SHP099在抑制SHP-2活性的同时，还能特异性诱导前神经元型胶质瘤的细胞周期阻滞，这种双重作用促使前神经元型胶质瘤对SHP099，尤其是当SHP099与TMZ或放疗联用时，有更敏感的治疗反应性。SHP099口服血脑屏障通透性高，对正常细胞的毒性小，选择性高。临床应用前景良好。
附图说明
图1A.SHP-2抑制剂(SHP099)对U87、LN229、LN18、T98G、LN444等胶质瘤细胞株的增殖抑制作用显著强于正常对照胶质细胞NHA(Normal human astrocytes)。
图1B.集落形成试验检测细胞系的生长抑制率结果显示，梯度浓度SHP099(0、5、10μM)对U87、LN229组的生长抑制作用显著强于正常对照胶质细胞NHA组。
图2A.SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株(过表达PDGF-A的LN444)的增殖抑制作用显著强于亲本对照组细胞株LN444。
图2B.SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株(LN444/PDGF-A)的集落形成能力的抑制作用显著强于亲本对照组细胞株LN444。
图2C.SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A的增殖抑制作用也显著强于亲本对照组细胞株Ink4a/Arf-/-mAst。
图2D.SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A的克隆形成能力的抑制作用显著强于亲本对照组细胞株Ink4a/Arf-/-mAst。
图3.SHP099还能特异性诱导前神经元型细胞株的细胞周期阻滞。
图4.在普通C57BL/6小鼠口服给药后，血浆和脑组织中均能检测出SHP099。SHP099的口服血脑屏障通透性高。
图5A.在裸鼠Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠模型，裸鼠颅内注射细胞5天起，梯度剂量SHP099(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg，灌胃)给药10天。注射细胞后20天小鼠成像。持续观察小鼠生存期。
图5B.活体成像实验结果提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099单独给药能显著抑制胶质瘤生长。
图5C.Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099单独给药能显著延长小鼠生存期。
图6A.在裸鼠Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠模型，裸鼠颅内注射细胞5天起，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与替莫唑胺(8mg/kg，腹腔注射)联合给药10天。注射细胞后20天小鼠成像。持续观察小鼠生存期。
图6B.活体成像实验提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著抑制胶质瘤生长。
图6C.活体成像实验的荧光素酶活性值提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著抑制胶质瘤生长。
图6D.Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著延长小鼠生存期。
图7A.在正常C57BL/6原位移植小鼠模型，颅内注射GL261细胞5天起，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与放疗(2Gy/天)联合治疗10天。注射细胞后26天取材冰冻切片HE染色衡量肿瘤大小。持续观察小鼠生存期。
图7B.HE染色显示原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与放疗(2Gy/天)联合治疗10天均能显著抑制胶质瘤生长。
图7C.HE染色统计结果显示原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与放疗(2Gy/天，共5天)联合治疗10天均能显著抑制胶质瘤生长。
图7D.在正常C57BL/6原位移植小鼠模型颅内注射GL261细胞，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与放疗(2Gy/天)联合治疗均能显著延长小鼠生存期。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：胶质瘤细胞株与对照的正常胶质细胞相比，对SHP099更敏感
(1)SHP-2抑制剂SHP099(MCE，HY-100388)对U87、LN229、LN18、T98G、LN444胶质瘤细胞株的增殖抑制作用显著强于正常对照胶质细胞NHA(Normal human astrocytes)。
U87(ATCC，CVCL_0022，USA)、LN229(ATCC，CVCL_0393，USA)、LN18(ATCC，CVCL_0392，USA)、T98G(ATCC，CVCL_0556，USA)、LN444(ATCC，CVCL_3961，USA)胶质瘤细胞株以及正常对照胶质细胞NHA(Normal human astrocytes，#1811，ScienCell ResearchLaboratories，USA)。
第一天，取对数生长末期的各株细胞，吸掉培养基。加入2ml DPBS(Invitrogen，14190250)在培养皿轻轻晃匀，轻轻吸掉DPBS(注意不要吹散细胞)。加入1ml 0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用10ml新鲜DMEM培养基终止消化。计数，铺到96孔板(Corning，3599)，细胞数为5×103/孔，让其生长24h。
SHP099(MCE，HY-100388)使用双蒸水溶解为10mM母液后，使用新鲜DMEM培养基--含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM培养液(Gibco，10564011)稀释为梯度浓度(0，1，10，20，30，50，70，100μM)后加入贴壁生长的细胞中，继续培养48h。
使用WST-1试剂盒(购自Roche，05015944001)按照说明书检测SHP099给药组及溶剂对照组各胶质瘤细胞株以及正常对照胶质细胞的体外增殖能力。
以SHP099的摩尔浓度取负对数，与梯度浓度给药组细胞增殖抑制百分比，使用Graphpad prism5.0软件绘制非线性回归分析，求得SHP099抑制各细胞株增殖的IC50值，结果如图1A所示，SHP-2抑制剂(SHP099)对U87、LN229、LN18、T98G、LN444胶质瘤细胞株的增殖抑制作用显著强于正常对照胶质细胞NHA(Normal human astrocytes)。
(2)集落形成试验检测细胞株的生长抑制率结果显示，梯度浓度SHP099(0、5、10μM)对U87、LN229组的生长抑制作用显著强于正常对照胶质细胞NHA组。
以U87、LN229、NHA三株细胞研究SHP099对胶质瘤细胞的生长抑制作用。取对数生长期细胞，按照5×103/孔的浓度铺到6孔板(Corning，3516)。24h后，加入梯度浓度SHP099(0、5、10μM)，连续培养7天(更换给药72h更换一次含梯度浓度SHP099的新鲜培养基)。7天后，计数每孔的大于50个细胞的集落数目。集落形成率(％)＝(集落数/接种细胞数)X100，结果如图1B所示，梯度浓度SHP099(0、5、10μM)对U87、LN229组的生长抑制作用显著强于正常对照胶质细胞NHA组。
实施例2：前神经元型胶质瘤细胞株与亲本对照胶质瘤细胞株相比，对SHP099更敏感
(1)SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株(过表达PDGF-A的LN444)的增殖抑制作用显著强于亲本对照组细胞株LN444。
1.1 293T细胞包装慢病毒：
293T细胞(购自ATCC，ATCC编号为CRL-3216TM)培养于DMEM培养基：含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM培养液(Gibco，10564011)。
第一天，取对数生长末期的293T细胞(细胞数约为5×106)，吸掉培养基。加入2mlDPBS(Invitrogen，14190250)在培养皿轻轻晃匀，轻轻吸掉DPBS(注意不要吹散细胞)。加入1ml 0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用10ml新鲜DMEM培养基终止消化。计数293T，铺到六孔板(Corning，3516)，细胞数约为5×105，让其生长24h，转化前的细胞汇合度应该在80-90％。
第二天，按照fugen-6试剂盒的说明书操作。将PDGF-A的过表达质粒(sinobiological，HG13081-UT)、psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid 12260)、pMD2G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染293T细胞。单个孔分别需要过表达质粒1ug、psPAX20.75ug、pMD2G 0.25ug，即4:3:1。同样方法将对照质粒、psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid 12260)、pMD2G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染293T细胞。
第三天，转染后的24h，更换成每孔3ml新鲜DMEM培养基，开始富集病毒。
第四天，转染后的48h收集病毒上清，即48h组分。用5ml注射器收集病毒上清后，经由0.45μm滤器(Millipore公司，SLHV013SL)过滤后，分装于1.5ml离心管，在4℃保存3-7天，应尽快使用。将转染病毒的293T继续更换为3ml新鲜DMEM培养基，再过24h，即为转染后72h，收集72h组分，按照48h组分相同的操作步骤，富集过表达PDGF-A的慢病毒上清。
1.2过表达PDGF-A的慢病毒转染LN444实验方法：
1)慢病毒转染前18-24h，将LN444以1×105/孔铺到24孔板中，加入新鲜DMEM培养基进行培养，使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。LN444的新鲜DMEM培养基成分为含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)的DMEM培养液(Gibco，10564011)。
2)第二天，用含有6μg/ml polybrene(Sigma，H9628)的2ml新鲜DMEM培养基替换原培养基，加入100微升48h或者72h病毒悬液(即为上文的过表达PDGF-A的慢病毒上清)。37℃孵育。
3)24小时后，用新鲜DMEM培养基替换含有病毒的培养基。
4)继续培养。由于该慢病毒含有GFP荧光蛋白，一般转染48h后可见明显荧光表达，72h后更加明显。该慢病毒含有潮霉素抗性基因，转染3天后开始加潮霉素(Thermo，10687010，终浓度为50ng/ml)，细胞长满即可传代。期间每3天更换一次含有相同浓度潮霉素的新鲜培养基，连续筛选2星期后，即在显微镜下观察到80-90％GFP阳性细胞(即代表过表达成功细胞)(即为下文的LN444/PDGF-A)。
1.3免疫印迹法验证PDGF-A过表达的效率及其对PDGFRα、p-PDGFRα表达的影响：
1)收集蛋白样品
使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)裂解LN444。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0009)测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
2)电泳
a、SDS-PAGE凝胶配制
使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
b、样品处理
在收集的蛋白样品中按比例加入浓缩的5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)，P0015)。沸水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
c、上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，使用预染蛋白质分子量标准(P0066)判断蛋白分子量大小。
电泳时使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A)。
电泳时在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。
3)转膜
选用碧云天生产PVDF膜(FFP36/FFP39)。
使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为60分钟。在转膜过程中会有非常严重的发热现象，因此把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
4)封闭
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(碧云天，P0023C)中，漂洗2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液(碧云天，P0023B)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。
5)一抗孵育
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(碧云天，P0023A)稀释一抗。PDGFRα抗体(SANTA cruze，sc-398206，1:500)、p-PDGFRα抗体(SANTA cruze，c-12911，1:500)、PDGF-A抗体(SANTA cruze，sc-390392，1:500)和β-actin(I19，Santa CruzBiotechnology，1:2000)。用滴管吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液(碧云天，P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6)二抗孵育
参考二抗-碧云天辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L(A0216)、山羊抗兔IgG(H+L)(A0217)的说明书，按照1:1000的比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用滴管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7)蛋白检测
参考相关说明书，使用BeyoECL Plus(P0018)ECL试剂来检测蛋白。使用X光片自动洗片机洗片。
结果如图2A所示，与对照质粒相比，PDGF-A过表达能够显著提高LN444细胞中PDGF-A以及PDGFRα、p-PDGFRα的表达水平。
1.4WST法检测SHP099对LN444(ATCC，CVCL_3961，USA)和LN444/PDGF-A(即过表达PDGF-A的LN444)的增殖抑制作用的差异：
第一天，取对数生长末期的LN444和LN444/PDGF-A，吸掉培养基。加入2ml DPBS(Invitrogen，14190250)在培养皿轻轻晃匀，轻轻吸掉DPBS(注意不要吹散细胞)。加入1ml0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用10ml新鲜DMEM培养基终止消化。计数，铺到96孔板(Corning，3599)，细胞数为5×103/孔，让其生长24h。
SHP099(MCE，HY-100388)使用双蒸水溶解为10mM母液后，使用新鲜DMEM培养基--含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM培养液(Gibco，10564011)稀释为梯度浓度(0，1，10，20，30，50，70，100μM)后加入贴壁生长的细胞中，继续培养48h。
使用WST-1试剂盒(购自Roche，05015944001)按照说明书检测SHP099给药组及溶剂对照组LN444和LN444/PDGF-A的体外增殖能力。
以SHP099的摩尔浓度取负对数，与梯度浓度给药组细胞增殖抑制百分比，使用Graphpad prism5.0软件绘制非线性回归分析，求得SHP099抑制LN444和LN444/PDGF-A增殖的IC50值，结果如图2A所示，SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株(过表达PDGF-A的LN444)的增殖抑制作用显著强于亲本对照组细胞株LN444。
(2)SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株(LN444/PDGF-A)的集落形成能力的抑制作用显著强于亲本对照组细胞株LN444。
以LN444和LN444/PDGF-A研究SHP099对胶质瘤细胞的生长抑制作用。取对数生长期细胞，按照5×103/孔的浓度铺到6孔板(Corning，3516)。24h后，加入梯度浓度SHP099(0、5、10μM)，连续培养7天(更换给药72h更换一次含梯度浓度SHP099的新鲜培养基)。7天后，计数每孔的大于50个细胞的集落数目。集落形成率(％)＝(集落数/接种细胞数)X100，结果如图2B所示，SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株(LN444/PDGF-A)的集落形成能力的抑制作用显著强于亲本对照组细胞株LN444。
(3)SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A的增殖抑制作用也显著强于亲本对照组细胞株Ink4a/Arf-/-mAst。
4.1原代Ink4a/Arf–/–mAst培养：
STOCK Tg(NES-TVA)J12Ech/J小鼠(购自Jackson，003529)出生后2天小鼠(雌雄不限)在75％酒精擦拭消毒后用颈动脉放血法处死动物。快速分离脑组织后置于预冷的DPBS(Invitrogen，14190250)洗净血污，取皮层部分尽可能剥净脑膜及脑表血管，并剔除海马组织，将分离出的皮层组织用DPBS(Invitrogen，14190250)清洗2次，用眼科弯剪将其剪成1mm3小块，并将组织小块转入到离心管中，37℃复温30min。0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用新鲜DMEM培养基--含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM培养液(Gibco，10564011)终止消化。自然沉降10分钟后，吸取上清，弃组织团块。以1000r/min离心5min，弃上清，加入2ml新鲜DMEM培养基轻柔吹打，静置1min后，取中下2/3上清以1000r/min离心5min，弃上清，加入新鲜DMEM培养基，调整细胞浓度以5x105/mL接种于六孔板(Corning，3516)37℃、5％CO2饱和湿度静置培养，48h首次换液，以后每2-3d换液。细胞融合度达到70–80％时传代。
4.2慢病毒转染Ink4a/Arf–/–mAst实验方法：
1)按照实施例二(1)1.1-1.3的实验步骤，将PDGF-A的过表达质粒(sinobiological，HG13081-UT)、PDGFRα的过表达质粒(sinobiological，HG10556-M)、psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid 12260)、pMD2G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染293T细胞。包装慢病毒获得上清，侵染Ink4a/Arf–/–mAst，潮霉素筛选纯化后免疫印迹法验证PDGF-A过表达的效率及其对PDGFRα、p-PDGFRα表达的影响。
结果如图2D所示，与对照质粒相比，PDGF-A以及PDGFRα过表达能够显著提高Ink4a/Arf–/–mAst中PDGF-A以及PDGFRα、p-PDGFRα的表达水平。
4.3WST法检测SHP099对Ink4a/Arf–/–胶质细胞和Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A细胞的增殖抑制作用的差异：
按照实施例二(1)1.4的实验步骤，取对数生长末期的Ink4a/Arf–/–mAst和Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A细胞，使用WST-1试剂盒(购自Roche，05015944001)按照说明书检测SHP099给药组及溶剂对照组Ink4a/Arf–/–mAst和Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A细胞的体外增殖能力。以SHP099的摩尔浓度取负对数，与梯度浓度给药组细胞增殖抑制百分比，使用Graphpad prism5.0软件绘制非线性回归分析，求得SHP099抑制Ink4a/Arf–/–mAst和Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A细胞增殖的IC50值，结果如图2C所示,SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A的增殖抑制作用也显著强于亲本对照组细胞株Ink4a/Arf-/-mAst。
(4)集落形成试验检测细胞系的生长抑制率结果显示，梯度浓度SHP099(0、5、10μM)对前神经元型胶质瘤细胞株(Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A)的生长抑制作用显著强于亲本对照组细胞株Ink4a/Arf–/–mAst。
按照实施例二(2)的实验步骤，以Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A细胞和Ink4a/Arf–/–mAst研究SHP099对胶质瘤细胞的生长抑制作用。结果如图2D所示，SHP099对前神经元型胶质瘤细胞株Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A的克隆形成能力的抑制作用显著强于亲本对照组细胞株Ink4a/Arf-/-mAst。
实施例3：SHP099还能特异性诱导前神经元型细胞株的细胞周期阻滞
第一天，取对数生长末期的Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A和Ink4a/Arf–/–mAst细胞，吸掉培养基。加入2ml DPBS(Invitrogen，14190250)在培养皿轻轻晃匀，轻轻吸掉DPBS(注意不要吹散细胞)。加入1ml 0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用10ml新鲜DMEM培养基终止消化。计数，铺到96孔板(Corning，3599)，细胞数为5×104/孔，让其生长24h。
SHP099(MCE，HY-100388)使用双蒸水溶解为10mM母液后，使用新鲜DMEM培养基--含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM培养液(Gibco，10564011)稀释为梯度浓度(0、5、10μM)后加入贴壁生长的细胞中，继续培养48h。
使用Cycle Test Plus DNA Reagent Kit试剂盒(购自BD Biosciences，340242)按照说明书检测梯度浓度SHP099(0、5、10μM)对Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A和Ink4a/Arf–/–mAst的细胞周期的影响。结果如图3所示，SHP099通过特异性诱导前神经元型细胞株的细胞周期阻滞，实现其对前神经元型细胞株的特异性增敏效应。
实施例4：在C57BL/6小鼠口服给药后，血浆和脑组织中均能检测出SHP099,SHP099口服血脑屏障通透性高乙腈：甲醇：水＝3/5/2用于抽提脑组织。
乙腈/水＝4/1用于抽提血
1.6-8周龄雌C57BL/6小鼠，SHP099(100mg/kg)口服灌胃给药后4h取抗凝血和脑组织。
2.肝素抗凝血3000rpm 20分钟离心后，取上清血浆。60微升血浆加入1.2毫升抽提液。4摄氏度混匀抽提20分钟，最大转速离心(10,000rpm，10分钟，4摄氏度离心)取上清-80摄氏度冻存。其中50微升以950微升抽提液稀释20倍加入内标(Sigma，13535-13-2，1000纳克/毫升)7.5微升混匀，使用高效液相色谱质谱仪(UPLC-MS，Thermo UPLC with QEtractive plus mass spectrometer)检测。
3.半个小鼠脑组织与1000微升抽提液混合，4摄氏度混匀抽提20分钟，最大转速离心(10,000rpm，10分钟，4摄氏度离心)取上清-80摄氏度冻存。其中50微升以950微升抽提液稀释20倍加入内标7.5微升混匀，使用高效液相色谱质谱仪检测。结果如图4所示，在普通C57BL/6小鼠口服给药后，血浆和脑组织中均能检测出SHP099,SHP099口服血脑屏障通透性高。
实施例5：在裸鼠Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠模型，SHP099单独给药能显著延长小鼠生存期
(1)如图5A所示，在裸鼠Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠模型，裸鼠颅内注射细胞第5天起，梯度剂量SHP099(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg，灌胃)给药10天。注射细胞后20天小鼠成像。持续观察小鼠生存期。
(2)活体成像实验结果提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099单独给药能显著抑制胶质瘤生长。
2.1构建表达Luciferase的Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A细胞株
按照实施例二(1)1.2的实验步骤将UBC-GFP-Luciferase Virus(SystemBiosciences，BLIV530VA-1)慢病毒颗粒转染Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A细胞株。
2.2裸鼠脑内成瘤实验：
每组6只裸鼠经1％戊巴比妥钠麻醉，固定于脑立体定位仪上，消毒皮肤，头顶部正中切口，暴露前囟，按小鼠脑立位图谱，于前囟后1.5mm，中线右侧0.8mm处，Hamilton微量注射器(701-N)自脑表面垂直进针2.8mm，向单侧脑实质缓慢注入5μl细胞(共5×105细胞，重悬于DPBS中)，注射时间5min,留针2min，缓慢退针。所有操作均在无菌条件下进行，缝合伤口。将裸鼠放回SPF层流架饲养。裸鼠颅内注射细胞第5天起，梯度剂量SHP099(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg，灌胃)给药10天。
2.2荧光活体成像在体检测裸鼠脑内肿瘤大小
注射细胞后第20天，裸鼠经1％戊巴比妥钠麻醉，腹腔注射荧光素(YEASON，40902ES01，终浓度15mg/ml)，10分钟后使用活体成像仪成像(PerkinElmer，LuminaSeries III)。结果如图5B所示，活体成像实验结果提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099单独给药能显著抑制胶质瘤生长。
(3)Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099单独给药能显著延长小鼠生存期。
小鼠成像后持续观察记录各组小鼠生存期。使用Graphpad prism5.0软件绘图。结果如图5C所示，Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099单独给药能显著延长小鼠生存期。
实施例6：在裸鼠Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠模型，SHP099单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著延长小鼠生存期
(1)在裸鼠Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠模型，裸鼠颅内注射细胞第5天起，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与替莫唑胺(Selleck，S1237，8mg/kg，腹腔注射)联合给药10天。注射细胞后20天小鼠成像。持续观察小鼠生存期。
(2)活体成像实验提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著抑制胶质瘤生长。
如图6A所示，按照实施例五(2)2.2裸鼠颅内注射Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A细胞5天起，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与替莫唑胺(Selleck，S1237，8mg/kg，腹腔注射)联合给药10天。
2.2荧光活体成像在体检测裸鼠脑内肿瘤大小
注射细胞后20天，裸鼠经1％戊巴比妥钠麻醉，腹腔注射荧光素(YEASON，40902ES01，终浓度15mg/ml)，10分钟后使用活体成像仪成像(PerkinElmer，LuminaSeries III)。结果如图6B所示，活体成像实验提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著抑制胶质瘤生长。
(3)活体成像实验的荧光素酶活性值提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著抑制胶质瘤生长。
使用活体成像仪配套软件(IVIS 4.4.17504)，测量每只裸鼠肿瘤区域的荧光素酶的信号值，使用Graphpad prism5.0软件绘图。结果如图6C所示，活体成像实验的荧光素酶活性值提示Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著抑制胶质瘤生长。
(4)Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著延长小鼠生存期。
小鼠成像后持续观察记录各组小鼠生存期。使用Graphpad prism5.0软件绘图。结果如图6D所示，Ink4a/Arf-/-mAst PDGFRα/PDGF-A原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与替莫唑胺联合给药均能显著延长小鼠生存期。
实施例7：在正常C57BL/6原位移植GL261细胞的小鼠模型，SHP099单独给药或者与放疗联合治疗能显著延长小鼠生存期
(1)在正常C57BL/6原位移植小鼠模型，颅内注射GL261细胞第5天起，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与放疗(2Gy/天)联合治疗10天。注射细胞后26天小鼠切片衡量肿瘤大小。持续观察小鼠生存期。
(2)HE染色显示原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与放疗(2Gy/天，共5天)联合治疗10天均能显著抑制胶质瘤生长。
如图7A所示，依据实施例五(2)2.2的小鼠颅内成瘤模型的实验操作，将GL261(ATCC，CVCL_Y003，培养条件同LN444等胶质瘤细胞株)，注射到免疫健全的正常C57BL/6小鼠颅内。颅内注射GL261细胞5天起，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与放疗(2Gy/天，共5天)联合治疗10天。
2.1裸鼠脑取材、OCT包埋、冰冻切片：
注射细胞26天，每组取3只小鼠使用干冰麻醉裸鼠。迅速断颈。剪开头顶部皮肤，剥离颅骨及软脑膜，暴露出整个鼠脑。轻轻地将鼠脑移出，切除嗅球及小脑后，包埋于OCT(Sakura，14-373-65)，迅速置于-80℃冰箱。次日，将包埋块经冰冻切片机切片，厚度为7微米。切片放置于-80℃冰箱保存。
2.2冰冻切片HE染色：
将切片自-80℃冰箱取出，室温平衡至水滴干燥，使用碧云天生产的HE染色试剂盒染色切片。
结果如图6B所示，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与放疗(2Gy/天)联合治疗10天均能显著抑制胶质瘤生长。
(3)采用Olympus BX53显微镜(Olympus DP72数码相机)采集图片。使用软件测量脑肿瘤最大面的长、宽。肿瘤体积＝长*宽2/2。使用Graphpad prism5.0软件，通过单因素方差分析比较各组肿瘤体积。结果如图7C所示，HE染色统计结果显示原位移植小鼠，SHP099(100mg/kg)单独给药或者与放疗(2Gy/天)联合治疗10天均能显著抑制胶质瘤生长。
(4)原位移植小鼠模型颅内注射GL261细胞，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与放疗(2Gy/天)联合治疗均能显著延长小鼠生存期。
每组剩余5只小鼠，持续观察生存期，使用Graphpad prism5.0软件绘图。结果如图7D所示，在正常C57BL/6原位移植小鼠模型颅内注射GL261细胞，SHP099(100mg/kg，灌胃)单独给药或者与放疗(2Gy/天)联合治疗均能显著延长小鼠生存期。

Claims (6)

1.SHP-2抑制剂在制备治疗前神经元型胶质瘤的药物中的应用。
2.SHP-2抑制剂联合替莫唑胺在制备治疗前神经元型胶质瘤的药物中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述SHP-2抑制剂为SHP099。
4.一种治疗前神经元型胶质瘤的药物，其特征在于，为以包含SHP-2抑制剂的活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
5.如权利要求4所述的治疗前神经元型胶质瘤的药物，其特征在于，所述SHP-2抑制剂为SHP099。
6.如权利要求4或5所述的治疗前神经元型胶质瘤的药物，其特征在于，所述的活性成分还包括替莫唑胺。
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