CN109642227A - 来自非人类生物体的核酸对照分子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在DNA处理和核酸测试方法中用作方法对照的合成DNA链。特别地，本文提供在例如从非鱼样品诸如人类样品中分离的DNA的突变和/或甲基化的DNA测试中用作对照分子的具有已知组成的合成的甲基化DNA链。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月19日提交的美国临时专利申请62/364,049的优先权益，所述申请全部以引用方式并入本文。
技术领域
本发明提供在DNA处理和核酸测试方法中用作对照的DNA组合物。具体地，本文提供在例如从人类样品分离的DNA的突变和/或甲基化的人类DNA处理和测试中用作对照分子的DNA组合物。
背景技术
针对与疾病或疾病的风险相关联的突变的存在和/或甲基化状况进行分析的来自人类样品的核酸通常在分析期间经过许多方法步骤。这些步骤可包括例如过滤、沉淀、捕获、洗涤、洗脱和/或化学修饰。为了分析DNA序列[或仅“DNA”]以确定甲基化状况，处理通常包括用亚硫酸氢盐处理以将未甲基化dC碱基转化成dU残基，这使得它们可更容易与受到保护免于亚硫酸氢盐转化影响的甲基化-C残基区分。
可通过使用具有已知组成的对照DNA来评价样品处理步骤的效率和功效。例如，来自体液的核酸提取通常需要添加外源性核酸作为可在提取后测量的方法对照以评定所述方法的效率并且能够确定成功或失败模式。
所使用的方法对照核酸的性质通常取决于测定类型和正在测量的材料。例如，如果正在使用的测定用于检测和/或定量双链DNA或其中的突变，那么双链DNA方法对照通常掺加到提取前样品中。类似地，对于监测mRNA或微小RNA的测定，所使用的方法对照通常为RNA转录物或合成的微小RNA。
在方法对照的情况下，测定被配置用于检测和定量两种方法对照，以评定提取方法的效率和目标分析物。如果来自方法对照的信号满足用于回收的测定规格(例如，在处理之后回收的添加材料的百分比的截止值)，那么分析物特异性信号被认为是有效的并且然后进行调用。或者，如果来自方法对照的信号处于用于回收的规格之外，那么分析物特异性信号被认为是无效的。
通常，方法对照材料被选择为类似于正在测定的核酸的类型。如果对组合DNA、RNA、甲基化DNA和微小RNA进行测试，那么单个方法对照需要用于每种类型的测定。例如，对于DNA测试(突变检测或DNA定量)，通常采用具有与正在测试的分析物类似的％GC含量的质粒或合成DNA，并且对于mRNA测试和定量，也使用类似％GC的转录物RNA。一些测试使用装甲RNA技术，其中RNA方法对照被包装到大肠杆菌噬菌体MS2的衣壳蛋白中，这防止RNA降解受到RNA酶影响。装甲RNA方法对照通常用于靶向病毒RNA诸如HIV和HCV的测定。对于微小RNA测试和定量，通常使用来自与正在测试的微小RNA不同的外源性微小RNA。例如，原产自秀丽隐杆线虫的微小RNA有时用作人类微小RNA测试的外源性对照。
对于甲基化DNA(meDNA)在检测和定量之前经历亚硫酸氢盐处理的meDNA测试，期望具有也甲基化的对照分子，使得提取和亚硫酸氢盐转化方法可以得到验证，但是所述分子不会与来自有待分析的样品，例如来自人类受试者的样品的DNA共享任何交叉反应性序列。
发明概要
本发明提供来自非人类物种的核酸，所述核酸具有类似于人类核酸的特性(例如，DNA甲基化百分比)并且经历正常测试和处理以对照并提供人类核酸检测测定的正常结果范围。另外，这些非人类核酸具有人类核酸中不可见的序列并且因此提供不与设计来检测人类核酸靶标分子的检测测定交叉反应的对照核酸。
这些非人类对照被称为运行对照并且它们用作每个方法步骤的测定性能和有效性的指示。运行对照也提供对测定性能的理解，使得可以检测例如运算符、***性和/或器械误差。本文所提供的运行对照核酸用作经历整个测定方法的靶标，例如从分离/捕获到亚硫酸氢盐转化、到设置、反应和检测测定。
在一些实施方案中，本技术提供包含合成的甲基化DNA的组合物，所述甲基化DNA与哺乳动物DNA不具有显著同源性并且与哺乳动物DNA处于混合物中。在一些实施方案中，所述混合物包含额外组分，例如包含与合成的甲基化DNA互补的区域的寡核苷酸；以及包含与哺乳动物DNA互补的区域的寡核苷酸；细菌、噬菌体、病毒、古细菌或非鱼真核生物核酸聚合酶；和/或细菌、噬菌体、古细菌或非鱼真核生物DNA修饰酶。在某些实施方案中，合成的甲基化DNA包括斑马鱼DNA。在优选的实施方案中，斑马鱼DNA包含斑马鱼rassf1基因的至少一部分。在特别优选的实施方案中，合成的甲基化DNA包含SEQ ID NO:1或其互补序列、优选SEQ ID NO:2或其互补序列的至少一部分。
在一些实施方案中，组合物包含已用亚硫酸氢盐试剂处理的DNA并且合成的甲基化DNA已用如下文所述的亚硫酸氢盐试剂转化。在优选的实施方案中，转化的甲基化DNA包含SEQ ID NO:3或其互补序列的至少一部分。
本技术的一些实施方案提供一种组合物，所述组合物在混合物中包含分离的甲基化斑马鱼DNA和第二组分，其中所述第二组分选自非鱼DNA；非鱼真核细胞；和/或非鱼生物样品。在一些实施方案中，非鱼DNA为哺乳动物的，优选地为人类的。类似地，在一些实施方案中，非鱼真核细胞为哺乳动物的，并且在优选的实施方案中为人类的。在一些实施方案中，非鱼生物样品为哺乳动物的，并且在优选的实施方案中为人类的。在特别优选的实施方案中，来自人类的生物样品包括血液、血清、血浆、组织、粪便或痰中的一种或多种。
在优选的实施方案中，斑马鱼DNA为合成的。如上所述，在优选的实施方案中，斑马鱼DNA包含斑马鱼rassf1基因的至少一部分，优选地为SEQ ID NO:1或其互补序列、优选SEQID NO:2或其补体的至少一部分。在一些实施方案中，DNA被亚硫酸氢盐处理并且包含SEQID NO:3或其互补序列的至少一部分。
以上所述的组合物可包含另外的组分。例如，以上所述的混合物中的一种或多种可包含细菌、噬菌体、病毒、古细菌或非鱼真核生物核酸聚合酶和/或细菌、噬菌体、古细菌或非鱼真核生物DNA修饰酶。在一些实施方案中，核酸聚合酶为DNA聚合酶并且在优选的实施方案中，其为热稳定性DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶，如下文中详细描述的。在一些实施方案中，DNA修饰酶包括连接酶、核酸外切酶和/或核酸内切酶。在优选的实施方案中，核酸内切酶为瓣状核酸内切酶，例如FEN-1核酸内切酶。在特别优选的实施方案中，FEN-1核酸内切酶来自嗜热性古细菌生物体。
在优选的实施方案中，甲基化斑马鱼DNA为合成的并且包含具有序列SEQ ID NO:11的寡核苷酸和/或具有序列SEQ ID NO:12的寡核苷酸，如图6所示，所述寡核苷酸可退火以形成合成的甲基化斑马鱼DNA的双链区段。
本技术进一步提供处理样品的方法。例如，在一些实施方案中，本技术提供一种处理含有来自非斑马鱼受试者的DNA的样品的方法，所述方法包括a)将分离的甲基化斑马鱼DNA与所述样品组合在混合物中；以及b)处理所述混合物以从所述混合物纯化DNA以产生例如包含非斑马鱼DNA和甲基化斑马鱼DNA的DNA样品。
在其他实施方案中，所述方法包括处理含有来自哺乳动物的DNA的样品，包括a)将与哺乳动物DNA不具有显著同源物的合成的甲基化DNA与来自哺乳动物的DNA组合在混合物中；以及b)处理所述混合物以从所述混合物纯化DNA，以产生例如包含哺乳动物DNA和合成的甲基化DNA的DNA样品。
本技术不限于从以上所述的混合物纯化或分离DNA的任何特定方法。例如，在一些实施方案中，如上所述的方法包括在离液剂存在下使DNA结合支持体，优选二氧化硅或二氧化硅涂覆的颗粒。在一些实施方案中，所述方法还包括用亚硫酸氢盐试剂处理由所述混合物纯化的DNA。在优选的实施方案中，所述方法还包括用核酸检测测定，例如聚合酶链反应、QuARTS瓣状测定等检测从混合物纯化的DNA。
在优选的实施方案中，核酸检测测定包括检测来自细胞或样品的DNA(例如，哺乳动物DNA)和与哺乳动物DNA不具有显著同源性的甲基化斑马鱼DNA或甲基化DNA。
如上所述，在优选的实施方案中，斑马鱼DNA包含斑马鱼rassf1基因的至少一部分，优选地为SEQ ID NO:1或其互补序列、优选SEQ ID NO:2或其互补序列的至少一部分。在一些实施方案中，DNA被亚硫酸氢盐处理并且包含SEQ ID NO:3或其互补序列的至少一部分。
本技术进一步涵盖用于提供或产生组合物和/或用于进行上文所述的方法的试剂盒。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括分离的甲基化斑马鱼DNA和/或与哺乳动物DNA不具有显著同源性的合成的甲基化DNA以及额外组分，所述额外组分包括但不限于例如与非鱼靶标DNA例如哺乳动物DNA互补的寡核苷酸诸如引物或探针、亚硫酸氢盐试剂、二氧化硅或二氧化硅涂覆的颗粒、离液剂(例如，硫氰酸胍、盐酸胍)、缓冲液、核酸聚合酶和/或DNA修饰酶、FRET盒等。在优选的实施方案中，其中合成的甲基化DNA包含SEQ ID NO:1或其互补序列或者SEQ ID NO:2或其互补序列的至少一部分。
在一些实施方案中，合成的甲基化DNA包含具有序列SEQ ID NO:11的寡核苷酸和/或具有序列SEQ ID NO:12的寡核苷酸，并且在某些优选的实施方案中，两种寡核苷酸一起提高，并且互补链的至少一些一起退火。
基于本文中所包含的教义，其他实施方案对于相关领域技术人员将是显而易见的。
图式简单说明
参照以下附图，本技术的这些和其他特征、方面和优点将变得更加容易理解：
图1示出斑马鱼(zebrafish/Danio rerio)的rassf1基因的靶标区段。DNA序列以未处理形式(UT)示出，具有天然DNA序列，并且以计算的亚硫酸氢盐处理的形式(BT)计算，其中不处于CpG二核苷酸内的每个胞嘧啶被转化成T核苷酸。还示出用于扩增和瓣状核酸内切酶测定检测未处理和亚硫酸氢盐处理的靶标序列的测定寡核苷酸。
图2示出具有源自斑马鱼的rassf1基因的互补序列的寡核苷酸。“iMe-dC”表示内部甲基化胞嘧啶并且在所示序列中，每个CpG基因座具有甲基化胞嘧啶。有义和反义寡核苷酸可被退火以形成rassf1的双链区段，如实施例2所述。
图3示出比较在定量扩增反应中使用图2所示合成斑马鱼DNA的系列稀释液产生的荧光信号的图表，如实施例2所述。
图4比较平均Cp与来自图3所示的结果的log输入链，如实施例2所述。
图5示出人类β-肌动蛋白基因的靶标区段。DNA序列以未处理形式(UT)示出，具有天然序列，并且以计算的亚硫酸氢盐处理的形式(BT)计算，其中不处于CpG二核苷酸内的每个胞嘧啶被转化成T核苷酸。还示出用于扩增和瓣状核酸内切酶测定检测未处理和亚硫酸氢盐处理的靶标序列的测定寡核苷酸。
图6示出本文所述的核酸序列的表格。
定义
为了有助于理解本技术，在下文中定义了大量术语和短语。附加的定义在整个详细描述中阐述。
如本文所用的短语“在一个实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管它可能指相同的实施方案。此外，如本文所用的短语“在另一个实施方案中”不一定指不同的实施方案，尽管它可能指不同的实施方案。因此，如下文所述，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，本发明的各种实施方案可容易地组合。
如本文所用的，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或多于一个。例如，“一个”小部件可意指一个小部件或多个小部件。
如在本申请的权利要求书中所用的过渡短语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为指定材料或步骤“和不实质改变要求保护的发明的一种或多种基本和新颖特征的那些”，如In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA 1976)中所讨论的。例如，“基本上由所陈述元素组成”的组合物可以含有一定水平的未陈述污染物，使得尽管存在，但是所述污染物不会改变所陈述组合物与纯组合物，即“基本上由所陈述组分组成”的组合物相比的功能。
如本文所用，术语“分析物”应广泛理解为有待检测、鉴别或表征的任何目标化合物、分子、元素、离子或其他物质。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指经历由本技术提供的各种测试的生物体，其中生物体或受试者不是斑马鱼。术语“受试者”包括动物，优选哺乳动物，包括人类。在一个优选实施方案中，受试者为灵长类动物。在甚至更优选的实施方案中，受试者是人类。此外，关于诊断方法，优选受试者是脊椎动物受试者。优选的脊椎动物是温血的；优选的温血脊椎动物是哺乳动物。优选的哺乳动物最优选地是人类。如本文所用，术语“受试者”包括人类和动物受试者二者。因此，本文中提供兽医治疗用途。因此，本技术提供了哺乳动物的诊断，诸如人类以及那些由于濒危而对人类具有重要意义的哺乳动物(诸如西伯利亚虎)；对人类具有经济价值的哺乳动物(诸如农场饲养的用于人类消费的动物)；和/或对人类具有社会价值的动物(诸如宠物或动物园中的动物)。这类动物的实例包括但不限于：食肉动物，诸如猫和狗；猪类，包括猪(pig)、猪(hog)和野猪；反刍动物和/或有蹄动物，诸如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；鳍足类动物；以及马。因此，还提供了家畜的诊断和治疗，包括但不限于驯养的猪类、反刍动物、有蹄动物、马(包括赛马)等等。目前公开的主题进一步包括一种用于诊断受试者中的肺癌的***。所述***可以例如作为商用试剂盒提供，所述商用试剂盒可用于在已收集生物样品的受试者中筛选肺癌的风险或诊断肺癌。根据本技术提供的示例性***包括评定本文所述的标记的甲基化状态。
如本文所用的术语“样品”以其最广泛的意义使用。例如，样品涉及含有一种或多种目标分析物的材料或材料的混合物，通常尽管不一定为液体形式。样品可从生物来源、环境来源或合成来源获得。在特定实施方案中，样品疑似含有与人类染色体相关联的人类基因或染色体或序列(例如片段)。样品可含有细胞、从细胞分离的染色体(例如，中期染色体的展开)、基因组DNA(例如，在溶液中或结合固体支持体)、RNA(例如，在溶液中或结合固体支持体)、cDNA(例如，在溶液中或结合固体支持体)等。样品可含有污染物(例如，非靶标核酸、蛋白质、小分子、生物或环境物质等)或者可呈纯化或半纯化的形式。
术语“靶标”当参考本文中的核酸检测或分析方法使用时是指具有有待检测或分析的特定核苷酸序列的核酸，例如在疑似含有靶标核酸的样品或反应混合物中。在一些实施方案中，靶标为具有特定非野生型序列(例如，突变体序列(例如，相对于野生型的点突变))或希望确定甲基化状况的序列的核酸。当参考聚合酶链反应使用时，“靶标”通常是指由用于聚合酶链反应的引物结合的核酸的区域。因此，“靶标”争取从可存在于样品中的其他核酸序列中分选出来。“靶标扩增子”为通过扩增(例如，PCR扩增)靶标序列来生成的核酸。术语“样品模板”是指来源于对靶标的存在进行分析的样品的核酸。
如本文所用的术语“对照”是指具有已知特性(例如，已知序列(例如，野生型、突变体、等位基因等))、已知浓度、已知制剂、已知修饰(例如，甲基化)，以供用于与实验靶标(例如，未知序列的核酸(例如，野生型、突变体、等位基因等)、未知浓度、未知制剂、未知修饰(例如，甲基化)相比较)的核酸。
如本文所用，术语“基因座”是指核酸限定区域或区段，诸如染色体或RNA分子上的基因或任何其他表征的序列内的特定位置(例如，突变、多态性或CpG二核苷酸内的C残基等的位置)。基因座不限于任何特定尺寸或长度并且可以是指染色体、基因、功能性遗传元件或单个核苷酸或碱基对的一部分。如本文参考可甲基化的CpG位点所用的，基因座是指CpG二核苷酸中的C残基。如本文参考可为突变的位置(例如，KRAS G35T等)所用的，基因座是指可呈野生型或突变体形式的核苷酸(或多个核苷酸)或碱基对(或多个碱基对)。
如本文所用，如参考例如CpG二核苷酸基因座中的胞嘧啶的甲基化状态所使用的“甲基化”或“甲基化的”通常是指甲基在胞嘧啶残基的位置5处的存在或不存在(即，指示特定胞嘧啶是否为5-甲基胞嘧啶)。甲基化可例如通过确定经由用亚硫酸氢盐处理来将特定C残基转化成尿嘧啶的敏感性(或其不存在)来直接确定，例如，如通过用于分析胞嘧啶的甲基化状况的常规方法所证明的。例如，当样品以预期在未甲基化时(例如，在其中样品中的大部分或全部未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶的条件下)转化胞嘧啶残基的方式用亚硫酸氢盐处理时样品中未转化成尿嘧啶的胞嘧啶残基通常可被认为是“甲基化的”。
如本文所用，具有100％甲基化百分比的核酸指示核酸具有附接到每个CpG二核苷酸的C的甲基，例如核酸为“完全甲基化的”。另外，如本文在一些上下文中所用的，100％甲基化指示特定核酸的全部情况和/或拷贝为完全甲基化的，例如核酸的每种情况和/或拷贝具有附接到每个CpG二核苷酸的C的甲基化基团。应当理解，在一些实施方案中，用于产生具有100％甲基化的核酸的实验和/或其他反应条件可以产生在每条核酸链的CpG二核苷酸的甲基化程度和/或具有100％甲基化的每种核酸的情况和/或拷贝的数目方面具有基本上100％甲基化的核酸，例如低于100％和/或大约100％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％、99％、99.5％或99.9％甲基化的甲基化量。
如本文所用，“甲基化特异性试剂”是指随着核酸分子甲基化状态的变化而修饰核酸分子的核苷酸的试剂，或者甲基化特异性试剂是指可以反映核酸分子的甲基化状态的方式改变核酸分子的核苷酸序列的化合物或组合物或其他试剂。用此试剂处理核酸分子的方法可包括将核酸分子与试剂接触，根据需要与额外步骤结合以实现核苷酸序列的所需改变。此类方法可以未甲基化核苷酸(例如，每个未甲基化胞嘧啶)被修饰成不同核苷酸的方式应用。例如，在一些实施方案中，此试剂可以使未甲基化胞嘧啶核苷酸脱氨基以产生脱氧尿嘧啶残基。示例性试剂是亚硫酸氢盐试剂。
术语“亚硫酸氢盐试剂”是指包含亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂，如本文所公开的，适用于区分甲基化与未甲基化CpG二核苷酸序列。所述处理的方法在本领域中是已知的(例如，PCT/EP2004/011715和WO 2013/116375，其各自全文以引用方式并入)。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐处理在变性试剂(诸如但不限于正亚烷基二醇或二乙二醇二甲基醚(DME))存在下进行或在二氧杂环己烷或二氧杂环己烷衍生物存在下进行。在一些实施方案中，变性试剂以1％与35％(v/v)之间的浓度使用。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，所述清除剂诸如但不限于苯并二氢吡喃衍生物，例如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基苯并二氢吡喃2-羧酸或三羟基苯甲酸以及其衍生物，例如没食子酸(参见：PCT/EP2004/011715，其全文以引用方式并入)。在某些优选的实施方案中，亚硫酸氢盐反应包括用亚硫酸氢铵处理，例如，如WO 2013/116375所述的。
通过甲基化特异性试剂进行的核酸核苷酸序列的改变也产生每个甲基化核苷酸被修饰成不同核苷酸的核酸分子。
术语“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
如本文所用，如参考诊断测定，例如甲基化测定所用的“敏感性”是指临床敏感性。临床敏感性是指使用诊断测定产生阳性结果的阳性样品的比例。敏感性通常计算为由所述测定鉴别的真阳性数目除以真阳性数目和由所述测定对已知阳性样品确定的假阴性数目之和。类似地，术语“特异性”是指由所述测定鉴别的真阴性数目除以真阴性数目和由所述测定对一种或多种已知阴性样品确定的假阴性数目之和的比例。
术语“野生型”是指一种基因、基因产物或其片段，其当从天然存在来源分离时具有该基因或基因产物的特征并具有群体中最频繁观察到的序列和/或形式。相反，术语“修饰的”、“突变体”和/或“变体”是指与野生型相比展示序列和或功能性质变化(即，改变特性)的基因、基因产物或其片段。应注意天然存在的突变体可予以分离；这些突变体通过以下事实来识别：与野生型基因或基因产物相比，其具有改变的特性。
如本文所用的术语“肿瘤”是指任何新的和异常的组织生长。因此，肿瘤可以是恶化前的肿瘤或恶性肿瘤。
如本文所用的术语“肿瘤特异性标记”是指可以用于指示肿瘤的存在的任何生物材料或元素。生物材料的实例包括但不限于核酸、多肽、碳水化合物、脂肪酸、细胞组分(例如细胞膜和线粒体)以及全细胞。在一些情况下，标记是特别的核酸区域(例如基因、基因间区域、特定基因座等)。核酸的作为标记的区域可以称为例如“标记基因”、“标记区域”、“标记序列”、“标记基因座”等。
术语“引物”是指下述寡核苷酸：所述寡核苷酸无论是作为例如来自限制性消化的核酸片段天然存在还是以合成方式产生，当置于其中诱导与核酸模板链互补的引物延伸产物的合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶存在下并且在适合的温度和pH下)时能够用作合成起始点。为了获得扩增中的最大效率，引物优选地是单链，但是可替代地是双链。如果为双链的，则引物首先进行处理来将其链分开，然后用于制备延伸产物。优选地，引物为寡脱氧核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。
术语“探针”是指下述寡核苷酸(例如核苷酸的序列)：所述寡核苷酸无论是在纯化的限制性消化中天然存在或合成、重组或通过PCR扩增产生，能够与另一种目标寡核苷酸杂交。探针可为单链或双链。探针适用于检测、鉴别和分离特定基因序列(例如“捕获探针”)。预期在一些实施方案中，本发明中所用的任何探针可以用任何“报告分子”标记，使得在任何检测***中可检测，所述检测***包括但不限于酶(例如ELISA以及酶基组织化学测定)、荧光、放射性和发光***。不希望本发明限于任何特定***或标签。当参考瓣状测定使用时，所述术语是指与靶标核酸相互作用以在侵入性寡核苷酸存在下形成裂解结构的寡核苷酸。如参考瓣状测定所用，术语“瓣状探针”和“瓣状寡核苷酸”可互换使用。
如本文所用的术语“靶标”是指旨在从其他核酸中分选出来的核酸，例如通过探针结合、扩增、分离、捕获等。例如，当参考聚合酶链反应使用时，“靶标”是指核酸的由用于聚合酶链反应的引物结合的区域，而当用于靶标DNA未扩增的测定中时，例如在侵入性裂解测定的一些实施方案中，靶标包含探针和侵入性寡核苷酸(例如INVADER寡核苷酸)结合以形成侵入性裂解结构，使得可以检测靶标核酸的存在的位点。“区段”被定义为在靶标序列内的核酸区域。
如本文所用的术语“标记”是指可以用于例如基于标记物质的存在、不存在或状况(例如甲基化状态)区分非正常细胞(例如癌细胞)与正常细胞的物质(例如核酸或核酸的区域或蛋白质)。
如本文所用，术语“鱼DNA”不同于斑马鱼DNA并且是指从鱼类分离的外源性非靶标DNA。如参考非靶标DNA所用的术语“外源性”是指从除含有靶标DNA的来源或样品之外的来源分离和纯化的非靶标DNA。此类外源性DNA被选择为通过配置成检测和/或定量添加了外源性DNA的反应物中的靶标核酸的测定未能检测到。例如，纯化的鱼DNA为相对于包含人类靶标DNA的样品的外源性DNA，例如，如美国专利号9,212,392所述的，所述专利以引用的方式并入本文。大量纯化的鱼DNA为可商购获得的，例如以鳕鱼和/或鲱鱼精DNA(RocheApplied Science,Mannheim,Germany)或鲑鱼DNA(USB/Affymetrix)形式提供。
如本文所用，术语“斑马鱼DNA”不同于鱼DNA并且是指从斑马鱼中分离的DNA或者在体外形成(例如，酶促、合成)以具有来自斑马鱼的DNA中可见的核苷酸序列的DNA。在优选的实施方案中，斑马鱼DNA为作为可检测对照DNA，例如用于验证通过样品处理步骤进行的DNA回收的方法对照添加的甲基化DNA。
在核酸背景下术语“扩增(amplifying/amplification)”是指多核苷酸或所述多核苷酸的一部分的多个拷贝的产生，其通常由少量多核苷酸(例如单一多核苷酸分子)开始，其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增涵盖多种化学和酶促过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR；参见例如美国专利号5,494,810；全文以引用方式并入本文中)期间由靶标或模板DNA分子的一个或几个拷贝生成多个DNA拷贝是扩增的形式。另外的扩增类型包括但不限于等位基因特异性PCR(参见例如美国专利号5,639,611；全文以引用的方式并入本文)、装配PCR(参见例如美国专利号5,965,408；全文以引用的方式并入本文)、解旋酶依赖性扩增(参见例如美国专利号7,662,594；全文以引用的方式并入本文)、热启动PCR(参见例如美国专利号5,773,258和5,338,671；其各自全文以引用的方式并入本文)、序列间特异性PCR、反向PCR(参见例如Triglia等人(1988)Nucleic Acids Res.,16:8186；全文以引用的方式并入本文)、连接介导的PCR(参见例如Guilfoyle,R.等人,Nucleic Acids Research,25:1854-1858(1997)；美国专利号5,508,169；其各自全文以引用的方式并入本文),methylation-specific PCR(参见例如Herman等人,(1996)PNAS 93(13)9821-9826；全文以引用的方式并入本文)、微型引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(参见例如Schouten等人,(2002)Nucleic Acids Research 30(12):e57；全文以引用的方式并入本文)、多重PCR(参见例如Chamberlain等人,(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156；Ballabio等人,(1990)Human Genetics 84(6)571-573；Hayden等人,(2008)BMC Genetics 9:80；其各自全文以引用的方式并入本文)、嵌套式PCR、重叠延伸PCR(参见例如Higuchi等人,(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367；全文以引用的方式并入本文)、实时PCR(参见例如Higuchi等人,(1992)Biotechnology 10:413-417；Higuchi等人,(1993)Biotechnology 11:1026-1030；其各自全文以引用的方式并入本文)、逆转录PCR(参见例如Bustin,S.A.(2000)J.Molecular Endocrinology 25:169-193；全文以引用的方式并入本文)、固相PCR、热不对称交错PCR以及递降PCR(参见例如Don等人,NucleicAcids Research(1991)19(14)4008；Roux,K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814；Hecker等人,(1996)Biotechniques 20(3)478-485；其各自全文以引用的方式并入本文)。多核苷酸扩增也使用数字PCR实现(参见例如Kalinina等人,Nucleic Acids Research.25；1999-2004,(1997)；Vogelstein和Kinzler,Proc Natl Acad Sci USA.96；9236-41,(1999)；国际专利公布号WO05023091A2；美国专利公布号20070202525；其各自全文以引用的方式并入本文)。5′
术语“聚合酶链反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，所述文献描述了一种用于在未克隆或扩增的情况下增加基因组或其他DNA或RNA的混合物中靶标序列区段的浓度的方法。这种用于扩增靶标序列的方法由以下各项组成：将大量的两种寡核苷酸引物引入到含有所需靶标序列的DNA混合物中，接着在DNA聚合酶存在下引入热循环的精确序列。两种引物与双链靶标序列的相应链互补。为了实现扩增，使混合物变性并且然后使引物退火到其在靶标分子内的互补序列上。在退火后，使用聚合酶延伸所述引物以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可重复许多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可存在许多个“循环”)，以获得高浓度的所需靶标序列的扩增区段。所需靶标序列的扩增区段的长度通过所述引物相对于彼此的相对位置来确定，并且因此，此长度为可控制的参数。通过重复所述过程的方面，所述方法被称为“聚合酶链反应”(“PCR”)。因为靶标序列的所需扩增区段在混合物中变成主要序列(就浓度而言)，所以它们被称为“PCR扩增的”并且是“PCR产物”或“扩增子”。本领域技术人员将理解，术语“PCR”涵盖最初描述的使用例如实时PCR、嵌套式PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、单一引物和任意引物PCR等的方法的许多变体。
如本文所用，术语“核酸检测测定”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性裂解测定(例如，INVADER测定，(Hologic,Inc.)并且描述于例如美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816；Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall等人,PNAS,USA,97:8272(2000),以及US 2009/0253142，其各自出于所有目的全文以引用的方式并入本文)；酶错配裂解方法(例如，Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，其全文以引用的方式并入本文)；以上所述的聚合酶链反应(PCR)；分支杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，其全文以引用的方式并入本文)；滚环式复制(例如，美国专利号6,210,884、6,183,960和6,235,502，其全文以引用的方式并入本文)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，其全文以引用的方式并入本文)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，其全文以引用的方式并入本文)；E-传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，其全文以引用的方式并入本文)；环状探针技术(例如美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，其全文以引用的方式并入本文)；Dade Behring信号扩增方法(例如美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，其全文以引用的方式并入本文)；连接酶链反应(例如，Baranay Proc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))；以及夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，其全文以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，靶标核酸被扩增(例如，通过PCR)并且扩增的核酸同时使用侵入性裂解测定来检测。配置用于执行检测测定(例如侵入性裂解测定)的测定与扩增测定的组合描述于美国专利号9,096,893中，所述专利出于所有目的全文以引用的方式并入本文。额外扩增加上侵入性裂解检测配置(称为QuARTS方法)描述于例如美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；以及9,212,392，所述专利各自出于所有目的以引用的方式并入本文。如本文所用的术语“侵入性裂解结构”是指包含以下各项的裂解结构：i)靶标核酸、ii)上游核酸(例如，侵入性或“INVADER”寡核苷酸)以及iii)下游核酸(例如，探针)，其中所述上游和下游核酸退火至靶标核酸的连续区域，并且其中重叠在上游核酸的3′部分与介于下游核酸与靶标核酸之间形成的双链体之间形成。在以下情况下发生重叠：来自上游和下游核酸的一个或多个碱基占据与靶标核酸碱基相同的位置，无论所述上游核酸的一个或多个重叠碱基是否与靶标核酸互补，并且无论那些碱基是否是天然碱基或非天然碱基。在一些实施方案中，上游核酸的与下游双链体重叠的3′部分是非碱基化学部分，诸如芳族环结构，例如，如美国专利号6,090,543所公开的，所述专利全文以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，核酸中的一个或多个可彼此附接，例如通过共价键诸如核酸茎环，或者通过非核酸化学键(例如多碳链)。如本文所用，术语“瓣状核酸内切酶测定”包括如以上所述的“INVADER”侵入性裂解测定和QuARTS测定。
术语“侵入性寡核苷酸”是指在与探针和靶标核酸之间的杂交区域相邻的位置处与靶标核酸杂交的寡核苷酸，其中侵入性寡核苷酸的3'端包含与探针和靶标之间的杂交区域重叠的部分(例如化学部分或一个或多个核苷酸)。侵入性寡核苷酸的3'端核苷酸可以或可以不与靶标中的核苷酸碱基配对。在一些实施方案中，侵入性寡核苷酸在其3'端含有与位于探针寡核苷酸的退火至靶链的部分的5'端处的序列基本上相同的序列。
如本文所用的术语“瓣状核酸内切酶”或“FEN”是指在具有含有单链5'突出部的双链体或在由核酸另一条链置换(例如，使得在单链和双链DNA之间的接合处存在重叠核苷酸)的一条链上具有瓣状物的DNA结构上用作结构特异性核酸内切酶的一类溶核酶，通常为5'核酸酶。FEN催化磷酸二酯键在单链和双链DNA的接点处水解裂解，从而释放突出部或瓣状物。瓣状核酸内切酶由Ceska和Savers(Trends Biochem.Sci.1998 23:331-336)和Liu等人(Annu.Rev.Biochem.2004 73:589-615；所述文献全文以引用方式并入本文)审查。FEN可为单个酶、多亚基酶，或者可作为另一种酶或蛋白质复合物(例如，DNA聚合酶)的活性而存在。
瓣状核酸内切酶可为热稳定性的。例如，来自古细菌嗜热生物体的FEN-1瓣状核酸内切酶是典型热稳定性的。如本文所用，术语“FEN-1”是指来自真核生物或古细菌生物体的非聚合酶瓣状核酸内切酶。参见例如WO 02/070755和Kaiser M.W.等人(1999)J.Biol.Chem.,274:21387，所述文献出于所有目的全文以引用方式并入本文中。
如本文所用，术语“裂解瓣状物”是指为瓣状测定的裂解产物的单链寡核苷酸。
术语“盒”当参考瓣状裂解反应使用时是指配置成响应于瓣状物或探针寡核苷酸的裂解(例如在瓣状裂解测定中形成的初级结构或第一裂解结构)而生成可检测信号的寡核苷酸或寡核苷酸组合。在优选的实施方案中，所述盒与通过裂解瓣状寡核苷酸产生的非靶标裂解产物杂交以形成二级重叠裂解结构，使得所述盒然后可由同一酶例如FEN-1核酸内切酶裂解。
在一些实施方案中，所述盒是包含发夹部分的单一寡核苷酸(即，其中盒寡核苷酸的一个部分与同一寡核苷酸的第二部分在反应条件下杂交以形成双链体的区域)。在其他实施方案中，盒包含至少两个寡核苷酸，其包含可在反应条件下形成双链体的互补部分。在优选的实施方案中，盒包含标签，例如荧光团。在特别优选的实施方案中，盒包含产生FRET效应的标记部分。
如本文所用，术语“FRET”是指荧光共振能量转移，这是其中部分(例如荧光团)例如在其本身中或从荧光团到非荧光团(例如淬灭剂分子)转移能量的过程。在一些情况下，FRET涉及经由短范围(例如约10nm或更小)偶极-偶极相互作用将能量转移到低能量受体荧光团的激发的供体荧光团。在其他情况下，FRET涉及来自供体的荧光能量的损失和受体荧光团中的荧光增加。还在其他形式的FRET中，能量可以从激发的供体荧光团交换至非荧光分子(例如，“黑暗”淬火分子)。FRET为本领域技术人员已知的并且已得到描述(参见例如Stryer等人,1978,Ann.Rev.Biochem.,47:819；Selvin,1995,Methods Enzymol.,246:300；Orpana,2004Biomol Eng 21,45-50；Olivier,2005 Mutant Res 573,103-110，所述文献各自全文以引用方式并入本文)。
在示例性瓣状检测测定中，侵入性寡核苷酸和瓣状寡核苷酸与靶标核酸杂交以产生具有如上所述的重叠的第一复合物。在瓣状寡核苷酸的5'端上包含未配对“瓣状物”或“臂”。第一复合物为瓣状核酸内切酶例如FEN-1核酸内切酶的底物，所述核酸内切酶裂解瓣状寡核苷酸以释放5'瓣状部分。在次级反应中，释放的5'瓣状产物用作FRET盒上的侵入性寡核苷酸，以再次形成由瓣状核酸内切酶识别的结构，使得FRET盒得到切割。当荧光团和淬灭剂通过裂解FRET盒来分离时，产生高于背景荧光的可检测荧光信号。
如本文所用的术语“实时”是指通过检测或测量在反应进行中时，例如在孵育或热循环期间反应中的产物或信号积累来检测核酸扩增或信号扩增。此检测或测量可同时发生，或者其可在扩增反应过程期间的多个离散点时发生，或者其可为组合。例如，在聚合酶链反应中，可在全部或部分热循环期间同时发生检测(例如荧光检测)，或者可在一个或多个循环期间的一个或多个点时瞬时发生检测。在一些实施方案中，PCR或QuARTS反应的实时检测通过确定在多个循环中的每个循环中或在每个循环中的同一点(例如循环中的时间点或循环中的温度步骤)时的荧光水平来实现。扩增的实时检测也可称为在扩增反应“期间”的检测。
如本文所用，术语“定量扩增数据集”是指在靶标样品例如靶标DNA的定量扩增期间获得的数据。在定量PCR或QuARTS测定的情况下，定量扩增数据集为在扩增期间，例如在多个热循环或全部热循环期间获得的荧光值的集合。定量扩增的数据不限于在反应的任何特定点时收集的数据，并且应该可在每个循环的离散点时测量或贯穿每个循环连续测量。
如本文参考值实时PCR和PCR+INVADER测定期间收集的数据使用的缩写“Ct”和“Cp”是指跨越预定阈值的信号(例如荧光信号)指示正信号的循环。已使用各种方法计算用作信号对比浓度的决定因素的阈值，并且所述值通常表示为“跨越阈值”(Ct)或“跨越点”(Cp)。Cp值或Ct值可用于本文呈现的用于分析实时信号以确定测定或样品中变体和/或非变体组成的百分比的方法的实施方案中。
如本文所用，术语“试剂盒”是指递送材料的任何递送***。在反应测定的情况下，这类输送***包括允许存储、运输反应试剂(例如，适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲剂、执行测定的书面指令等)或将其从一个位置输送至另一个位置的***。举例来说，试剂盒包括一个或多个套罩(例如，盒)，其含有相关反应试剂和/或支持材料。如本文使用，术语“零散试剂盒”是指包括两个或更多个单独容器的输送***，每个容器含有全部试剂盒组分的子部分。这些容器可共同或单独输送至预定接受者。举例来说，第一容器可含有用于测定的酶，而第二容器含有寡核苷酸。
如本文所用的术语“***”是指出于特定目的使用的物品的集合。在一些实施方案中，物品包括使用说明书，作为例如物品、纸或可记录介质(例如DVD、CD、闪存驱动器等)上供应的信息。在一些实施方案中，说明书引导使用者到在线位置，例如网站。
如本文所用，术语“信息”是指事实或数据的任何集合。参考使用一个或多个计算机***(包括但不限于因特网)储存或加工的信息，所述术语是指以任何格式(例如对话、数字、光等)存储的任何数据。如本文所用，术语“与受试者相关的信息”是指关于受试者(例如人类、植物或动物)的事实或数据。术语“基因组信息”是指关于基因组的信息，包括但不限于核酸序列、基因、甲基化百分比、等位基因频率、RNA表达水平、蛋白质表达、与基因型相关的表型等。“等位基因频率信息”是指关于等位基因频率的事实或数据，包括但不限于等位基因身份、等位基因的存在与受试者(例如人类受试者)的特征之间的统计相关性、个体或群体中等位基因的存在或不存在、等位基因存在于具有一种或多种特定特征的个体中的可能性百分比等。
具体实施方案
本发明提供来自非人类物种的核酸，所述核酸具有与人类核酸类似的特性(例如，微小RNA、DNA甲基化百分比)并经历正常测试和处理以对照并提供用于人类核酸检测测定的正常范围的结果。另外，这些非人类核酸具有人类核酸中不可见的序列并且因此提供不与设计来检测人类核酸靶标分子的检测测定交叉反应也不干扰所述检测测定的对照核酸。
在各种实施方案的该详细描述中，出于解释的目的，阐述了大量具体的细节，以提供对所公开的实施方案的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解，可利用或无需这些具体的细节来实践这些各种实施方案。在其他情况下，结构和设备以框图的形式示出。另外，本领域的技术人员能够容易地理解，方法呈现和执行的特定顺序是说明性的，并且可以设想所述顺序可以改变且仍保持在本文公开的各种实施方案的精神和范围内。
本文所公开的技术提供来自非哺乳动物生物体诸如蜜蜂(西方蜜蜂(Apismellifera))和斑马鱼的核酸，例如DNA、甲基化DNA和微小RNA。在一些实施方案中，核酸从这些生物体中分离，而在其他实施方案中，核酸从来源于这些生物体的培养的细胞中分离。还在其他实施方案中，核酸为这些生物体中可见的核酸的合成拷贝。又在其他实施方案中，这些核酸为这些生物体中可见的核酸的合成拷贝，如在用亚硫酸氢盐试剂处理时它们将如此。
在一些优选的实施方案中，核酸来自斑马鱼。斑马鱼在某些基因或基因区域中显示高度甲基化，例如rassf1、tert、c-jun、c-myca(参见，例如Fang等人,Comp BiochemPhysiol B Biochem Mol Biol 166:99–108(2013))。基因rassf1和tert与人类核酸序列具有特别低的同源性。例如，rassf1使用BLAST程序进行的计算机辅助比较当针对人类DNA进行比较时仅显示少量序列比对，全部为约27个或更少碱基。
本技术提供由来自非人类生物体的序列信息产生的合成核酸。例如，在一些实施方案中，本技术提供合成的双链甲基化DNA。“靶标”是指包含具有有待在检测测定期间检测或测量的序列和/或一个或多个甲基化状态的部分、基因座、区域等的核酸或基因(“基因靶标”)。在一些类型的样品，例如血液、血浆和粪便样品中，DNA通常作为包含100至1000bp(例如100至500，例如100至200，例如150bp)的片段出现，核酸的有待在基于样品的测定期间检测或测量的区域通常可见于靶标核酸的片段中。因此，如本文所用，“片段”、“靶标片段”或“靶标基因片段”是指100至1000bp(例如100至500，例如100至200，例如150bp)的DNA，其包含具有有待在涉及评定该尺寸的DNA的技术的实施方案中(例如，用于直肠癌的基于粪便样品和/或粪便物质的测定)在检测测定期间检测或测量的序列和/或一种或多种甲基化状态的部分、基因座、区域等。如在本文所述的运行对照的实施方案中所用，所述片段可从天然来源分离或者所述片段可为合成的。例如，一些实施方案提供100至500bp(例如100至250，例如100至200，例如150bp)的合成寡核苷酸，其包含用于校准、控制、验证、评定、评价等用于测量和/或检测与疾病状态例如直肠癌相关的基因靶标的测定(例如，用于评定从正在针对直肠癌的存在进行测试的受试者获得的样品中的基因靶标的序列和/或甲基化状态的测定)的基因靶标部分(例如靶标片段)。所述片段也可为重组和/或半合成的，例如包含天然和合成部分。
在一些实施方案中，核酸包含野生型序列，并且在一些实施方案中，核酸包含突变体序列。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个甲基化胞嘧啶(me-C)，并且在一些实施方案中，核酸包含一个或多个未甲基化胞嘧啶(C)。优选的实施方案提供具有限定的序列(例如，野生型和突变体序列)和/或限定的甲基化模式(例如，在核酸内的胞嘧啶碱基根据限定的模式或序列为甲基化或未甲基化)的核酸。例如，在一些实施方案中，混合物中100％的分子具有相同的胞嘧啶部分甲基化的模式。在一些实施方案中，单个核酸分子内的每个CpG二核苷酸内的每个胞嘧啶具有附接的甲基(例如，核酸分子的100％甲基化)。在与甲基化核酸相关的一些实施方案中，根据限定的甲基化模式产生的每个(例如每一个)单独的核酸分子具有限定的序列和/或甲基化模式(例如，所有核酸分子的100％甲基化)。在与核酸分子或分子集合内的每个分子的100％甲基化相关的一些实施方案中，甲基化基本上、有效地或实质上为100％，例如，样品被处理为和/或作用为具有100％甲基化的样品，无论实际精确的甲基化状态如何，例如实际上可小于100％的甲基化。在其他实施方案中，具有不同甲基化模式(例如，100％甲基化、未甲基化、或甲基化和未甲基化位点的特定模式)的链以限定的量混合以产生在对照序列的一个或多个CpG二核苷酸处具有预先限定的甲基化比例和模式的运行对照。在特别优选的实施方案中，合成运行对照以在所述序列内表现出100％甲基化CpG二核苷酸。
在优选的实施方案中，运行对照包含双链核酸，例如，如通过将两个互补合成寡核苷酸退火所提供的。在一些实施方案中，对照根据一种方法如下产生(并且如实施例2所述)：根据所需序列和甲基-C位置合成DNA(例如，单链DNA)。例如通过自动化DNA合成器和四种标准A、T、C和G碱基的储备溶液以及5′-甲基-C的储备溶液提供DNA合成。然后，在一些实施方案，将单链寡核苷酸退火(例如通过混合、加热(例如熔化)和冷却，例如以可控速率，在适当缓冲液中进行)以提供类似天然的双链靶标。然后，在一些实施方案中，对照制剂(例如，DNA对照试剂)通过将双链靶标以所需浓度混合来产生以在具有或不具有稀释的鱼DNA的缓冲液(例如，80％DNA稳定缓冲液(500mM Tris、150mM EDTA和10mM NaCl，pH 9)中产生所需信号(例如，参见上文)。
本技术不限于用于产生对照的缓冲液。例如，缓冲液可为HEPES、PIPES、SSC、MES、MOPS、磷酸盐缓冲液、基于柠檬酸(柠檬酸盐)的缓冲液、其他Tris缓冲液等，并且可具有任何适合的pH(通常为5.5至10)。
在一些实施方案中，运行对照包括源自质粒的核酸。例如，在一些实施方案中，运行对照片段被克隆到质粒载体中。在一些实施方案中，载体包含质粒载体(例如，pUC质粒等)和一种或多种运行对照片段的序列，所述运行对照片段例如通过限制性位点串联连接(直接连接或通过接头分开)和分开，例如，如共同待决的申请序列号15/033,803、PCT/US14/71460和15/105,178所述的，所述申请以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，运行对照例如使用甲基化酶在体外甲基化。
在一些实施方案中，运行对照片段用于评价、校准、评定和/或验证用于来自样品的靶标DNA和/或用于鉴别、检测和/或表征疾病、疾病前状况或受试者(例如人类)疾病易感性的测定的提取程序。
运行对照诸如斑马鱼DNA被选择为模拟从用于分析的样品中提取的靶标核酸，例如来自生物样品的疾病标记DNA，使得运行对照可添加到样品中并携带着通过与靶标DNA平行的提取、亚硫酸氢盐转化和核酸检测的全部步骤。
在一些实施方案中，运行对照包含合成DNA片段和缓冲液。例如，在一些实施方案中，运行对照包含DNA稳定缓冲液(500mM Tris、150mM EDTA和10mM NaCl，pH 9)，例如50％至100％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％DNA稳定缓冲液)和鱼DNA(例如，鱼(例如，鲑鱼)精DNA，如美国专利号9,212,392所述，其以引用的方式并入本文，例如，为10至100ng/mL，例如20至80ng/mL，例如30至60ng/mL，例如50ng/mL)。
在一些实施方案中，运行对照以用于对照反应中的多个浓度提供，例如以提供运行对照的浓缩储备溶液(例如，2×、3×、4×、5×、10×、20×、25×、50×、100×、1000×)，其在使用之前稀释(例如，使用缓冲液)。在一些实施方案中，运行对照作为试剂提供在试剂盒中，例如用于纯化和/或亚硫酸氢盐处理和/或检测靶标核酸，例如甲基化人类DNA。
在一些实施方案中，利用本发明的运行对照的示例性测定进行如下。运行对照添加到来自生物或环境来源的样品(例如，体液样品)中并且然后从样品中提取核酸。在一些实施方案中，用结合试剂(例如，二氧化硅磁性颗粒)处理核酸，以将来自非核酸物质的核酸浓缩、分离和/或纯化。在一些实施方案中，含有所添加的运行对照的样品和/或核酸从生物或环境来源(例如粪便样品)中分离，在用捕获试剂捕获之前或之后用抑制剂去除试剂处理。
在一些实施方案中，具有添加的运行对照的分离的样品核酸用亚硫酸氢盐试剂处理以将未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶。在一些实施方案中，运行对照组合物包含甲基化的合成核酸，使得可以监测使用亚硫酸氢盐转化的效率。
在一些实施方案中，例如通过QuARTS测定来测定包含添加的运行对照的提取的核酸。运行对照和分离的核酸经历相同的反应和测定条件(例如，扩增条件)，并且对于靶标和运行对照例如实时检测反应的结果。然后，相对于运行对照的预期结果评定使用运行对照的测定的结果(例如，确定运行对照结果是否处于预先限定的可接受范围内)，以提供测试来自生物样品的靶标核酸的测定为有效或无效的指示，以评定测定性能、使用者误差、器械误差、试剂品质等。
以与测试样品(例如，来自生物样品、环境样品等的核酸)相同的方式处理运行对照能够评定所述程序和测定对测试样品的性能，并且因此提供关于测定结果的有效性和/或置信区间的信息。
在某些实施方案中，从患者样品分离的核酸和/或运行对照被添加到反应混合物(反应混合物(reaction mix))中，例如用于PCR和/或QuART测定。通常，这些反应混合物含有用于聚合酶链反应(PCR)扩增的试剂，尽管拥有其他扩增和/或分析的方法的反应混合物也处于本发明的范围内。在一些实施方案中，反应混合物包含用于扩增核酸靶标序列的PCR试剂。所述方法中所采用的反应混合物可因此包含：一个或多个引物对、适合的PCR缓冲液(例如，pH缓冲的，包含盐(例如KCl)和二价阳离子来源(例如MgCl2)等)、脱氧核苷三磷酸酯(例如，dGTP、dATP、dTTP和dCTP)以及热稳定性DNA聚合酶。根据应用，反应混合物还可包含用于进一步分析、操纵和/或检测其中的多核苷酸或靶标序列，例如一个或多个侵入性寡核苷酸、一个或多个瓣状寡核苷酸、瓣状核酸内切酶(例如热稳定性FEN-1)、一个或多个FRET盒等的额外组分。
存在于反应混合物中的试剂的精确身份和浓度可类似于所述领域所采用的那些或者与其相同。在一些实施方案中，反应混合物含有浓度在约1.8mM与3mM、4mM与10mM、6mM与9mM等之间的Mg2+。在本发明反应混合物中可采用的示例性反应缓冲液和DNA聚合酶包括不同出版物中(例如，Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons 1995；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,2001Cold Spring Harbor,N.Y.；其全文以引用的方式并入本文中)所述的那些。适用于PCR的反应缓冲液和DNA聚会骂我可购自不同供应商，例如Invitrogen(Carlsbad,Calif.)、Qiagen(Valencia,Calif.)和Stratagene(La Jolla,Calif.)。示例性聚合酶包括Taq、Pfu、Pwo、UlTma和Vent以及其变体，尽管在某些实施方案中可采用许多其他聚合酶。示例性瓣状核酸内切酶包括Afu FEN-1、Pfu FEN-1和Ave FEN-1(参见例如，WO 02/070755和KaiserM.W.等人(1999)J.Biol.Chem.,274:21387)。
适用于与聚合酶一起使用的反应组分及其使用的适合条件的指导可见于供应有聚合酶的文献中。引物设计描述于各种出版物中(例如，Diffenbach和Dveksler,PCRPrimer,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press 1995；R.Rapley,The NucleicAcid Protocols Handbook(2000),Humana Press,Totowa,N.J.；Schena和Kwok等人,Nucl.Acid Res.1990 18:999-1005；其全文以引用的方式并入本文中)。引物和探针设计软件程序也为可商购获得的，包括但不限于Primer Detective(ClonTech,Palo Alto,Calif.)、Lasergene,(DNASTAR,Inc.,Madison,Wis.)、OLIGO(National Biosciences,Inc.,Plymouth,Minn.)和iOligo(Caesar Software,Portsmouth,N.H.)。
在特定实施方案中，反应混合物含有用于平行测定多个不同靶标序列的试剂(例如，至少2、3、4…10或更多)。在这些情况下，反应混合物可含有多个PCR引物对。在某些实施方案中，用于所述方法中的不同寡核苷酸被设计为不会彼此干扰。在一个多重反应中，引物可被设计为具有类似的热力学性质(例如，类似的Tms、G/C含量、发夹稳定性，并且在某些实施方案可全部具有类似长度(例如，18至30nt(例如，20至25nt)。在一些实施方案中，用于反应混合物中的其他试剂为Tm匹配的，以在与其他组分相同的一个或多个温度下或在所选择的所使用的温度子集合期间，例如在热循环反应期间起作用。
在一些实施方案中，反应混合物存在于容器中，所述容器包括但不限于管；多孔板(例如，96孔、384孔、1536孔)、微流体装置等。在某些实施方案中，多个多重反应在相同反应容器中进行。根据反应进行的方式，反应混合物可具有任何体积，例如0.1μl至5μl、5μl至200μl(例如，10μl至100μl)，尽管设想了此范围之外的体积。
在某些实施方案中，反应混合物包含核酸(例如，包含来自生物样品、来自环境样品、合成(例如来自运行对照)等的靶标序列)。在特定实施方案中，混合物包含基因组DNA、其片段或其扩增版本(例如，使用Lage等人,Genome Res.2003 13:294-307或公开的专利申请US 2004/0241658的方法扩增的基因组DNA，两份文献均全文以引用的方式并入本文)，其例如来自有待测试疾病例如直肠癌的患者。在示例性实施方案中，基因组样品可含有来自哺乳动物细胞诸如人类、小鼠、大鼠或猴子细胞的基因组DNA。所述样品可由培养的细胞或临床样品的细胞制成(例如，组织活检物、刮取物或灌洗物或法医用样品的细胞(即，在案发现场收集的样品细胞)等)。
在特定实施方案中，反应混合物中的核酸从生物样品诸如细胞、组织、体液和粪便中获得。目标体液包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、粘液、粘液质、脑脊髓液、胸膜液、泪液、***管液、淋巴液、痰、脑脊液、滑液、尿液、羊水、胰液和***。在具体实施方案中，样品可从受试者(例如人类)获得，并且它可在用于受试者测定中之前进行处理。例如，核酸可从使用之前的样品中提取，用于此的方法为已知的。在一些实施方案中，DNA在用于测定中之前用亚硫酸氢盐处理，其中未甲基化的胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶碱基。
在某些实施方案中，反应混合物(例如，包含来自患者的核酸；包含运行对照)包含用于进行扩增、处理、操纵、分析、检测步骤或测定(例如，不是PCR和/或除了PCR之外)的一种或多种试剂(例如，寡核苷酸，诸如引物、瓣状探针、检测盒；酶诸如聚合酶；化学试剂等)。本发明不受限于可使用本发明的核酸分析、操纵和/或检测方法的范围。
在一些实施方案中，提供多种不同反应混合物(例如，至少包含运行对照并且至少包含来自患者样品的核酸)(例如，用于实验或测定中)。在一些实施方案中，提供多个容器(例如，孔、管、通道等)，其各自含有反应混合物(例如，至少一个包含运行对照并且至少一个包含实验性靶标核酸)。
在某些实施方案中，本文所述的运行对照组合物、反应和/或方法用于多种诊断、医疗、分析和研究应用中，并且本发明不应视为限于任何特定领域或使用。然而，在特定实施方案中，本发明用于分析、检测、表征等来自粪便的核酸(例如，人类核酸、靶标核酸等)。用于本文所述的实施方案中的组合物、方法、装置等可见于例如美国专利号8,361,720；7,981,612；7,368,233；6,964,846；6,919,174；6,849,403；6,844,155；6,818,404；6,750,020；6,586,177；6,551,777；6,503,718；6,498,012；6,482,595；6,475,738；6,428,964；6,415,455；6,406,857；6,351,857；6,303,304；6,300,077；6,280,947；6,268,136；6,203,993；6,146,828；6,143,529；6,020,137；5,952,178；5,928,870；5,888,778；5,830,665；5,741,650；5,670,325；其各自出于任何目的全文以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于例如定量等位基因特异性实时靶标和信号扩增测定(QuARTS测定)，例如，如美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；以及9,212,392所述。
实验
在与直肠癌的测试相关的技术的实施方案的发展期间，实验表明包括对照DNA样品将提供改进的测试。因此，本文提供包含DNA对照的技术，所述对照当与实验(例如未知)样品(例如来自患者)平行地通过工作流程处理时生成特定信号。特别地，本文所提供的对照包含在捕获过程期间捕获的、在亚硫酸氢盐转化期间转化的各种核酸靶标，并且存在用于通过QuARTS突变和/或甲基化测定检测的正确序列。
实施例1
样品制备方法
用于DNA分离和QUARTS测定的方法
以下提供用于在分析和之前进行DNA分离的示例性方法和示例性QUARTS测定，诸如可以根据本技术的实施方案使用。在此实施例中描述了QuARTS技术对来自血液和不同组织样品的DNA的应用，但是本技术容易应用于其他核酸样品，如其他实施例中所示的。
来自细胞和血浆的DNA分离
对于细胞系，基因组DNA可以使用例如“RSC ccfDNA血浆试剂盒(Promega Corp.,Madison,WI)从细胞条件培养基中分离。遵循试剂盒方案，使用1mL细胞条件培养基(CCM)替***，并且根据试剂盒程序进行处理。
用于从血浆分离DNA的替代性示例性程序如下：
●向4mL血浆样品中添加300μL蛋白酶K(20mg/mL)并将其混合。
●将3μL的1μg/μL鱼DNA稀释液添加到血浆蛋白酶K混合物中。
●将2mL血浆裂解缓冲液添加到血浆中。
血浆裂解缓冲液为：
-4.3M硫氰酸胍
-10％IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇，支链)
(5.3g IGEPAL CA-630与45mL 4.8M硫氰酸胍组合)
●在55℃下在500rpm振荡下将混合物孵育1小时。
●添加3mL血浆裂解缓冲液并且混合。
●添加200μL磁二氧化硅结合珠粒(16μg珠粒/μL}并且再次混合。
●添加2mL 100％异丙醇并且混合。
●在30℃下在500rpm振荡下孵育30分钟。
●将一个或多个管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃上清液。
●将750μL GuHCl-EtOH添加到含有结合珠粒的容器中并且混合。
GuHCl-EtOH洗涤缓冲液为：
-3M GuHCl(盐酸胍)
-57％EtOH(乙醇)
●在400rpm下振荡1分钟。
●将样品转移到深孔板或2mL微量离心管中。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中10分钟。抽出并丢弃上清液。
●将1000μL洗涤缓冲液(10mM Tris HCl、80％EtOH)添加到珠粒中，并且在30℃下在振荡下孵育3分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃上清液。
●将500μL洗涤缓冲液添加到珠粒中，并且在30℃下在振荡下孵育3分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃上清液。
●添加250μL洗涤缓冲液，并且在30℃下在振荡下孵育3分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃其余缓冲液。
●添加250μL洗涤缓冲液，并且在30℃下在振荡下孵育3分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃其余缓冲液。
●在70℃下将珠粒干燥15分钟，同时振荡。
●将125μL洗脱缓冲液(10mM Tris HCl pH 8.0、0.1mM EDTA)添加到珠粒中，并且在65℃下在振荡下孵育25分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中10分钟。
●抽出含有DNA的上清液并且将其转移到新容器或管中。
可将如实施例2所述制备的斑马鱼DNA例如天然或合成DNA添加到如本文所述的血浆样品中。例如，可在添加血浆裂解物缓冲液之前、在添加蛋白酶K和鱼DNA之前或之后添加0.4ng/μL鱼DNA稀释液(从鲑鱼、鳕鱼和/或鲱鱼分离的大量基因组DNA，例如，如美国专利号9,212,392所述)中的100μL 120个拷贝/μL合成斑马鱼DNA(参见实施例2)。
DNA的亚硫酸氢盐转化
用于甲基化测试的DNA使用亚硫酸氢盐使用例如EZ-96DNA甲基化试剂盒(ZymoResearch,Irvine CA)或使用亚硫酸氢铵处理，如美国专利号9,315,853和美国临时专利申请号62/249,097所述，其各自全文以引用的方式并入。
用亚硫酸氢盐试剂处理DNA以转化未甲基化胞嘧啶残基的示例性方法如下：
I.使用亚硫酸氢铵使DNA磺化
1.在每个管中，将64μL DNA、7μL 1N NaOH和9μL含有0.2mg/mL BSA和0.25mg/mL鱼DNA的载体溶液组合。
2.在42℃下孵育20分钟。
3.添加120μL 45％亚硫酸氢铵并在66°下孵育75分钟。
4.在4℃下孵育10分钟。
II.使用磁珠脱磺化
材料
磁珠(Promega MagneSil Paramagnetic Particles，Promega目录号AS1050，16μg/μL)。
结合缓冲液：6.5-7M盐酸胍。
转化后洗涤缓冲液：80％乙醇和10mM Tris HCl(pH 8.0)。
脱磺化缓冲液：70％异丙醇，选择0.1N NaOH用于脱磺化缓冲液。
使用任何适当的装置或技术混合样品以在基本上如下文所述的温度和混合速度下混合或孵育样品。例如，可以使用热混合器(Eppendorf)混合或孵育样品。示例性脱磺化如下：
1.通过将瓶涡旋1分钟来将珠粒原液彻底混合。
2.将50μL珠粒等分到2.0mL管中(例如，来自USA Scientific)。
3.将750μL结合缓冲液添加到珠粒中。
4.添加150μL来自步骤I的磺化DNA。
5.混合(例如，在30℃下1000RPM持续30分钟)。
6.将管置于磁体支架并且将其留在适当位置上5分钟。在将管置于支架上的情况下，移出并丢弃上清液。
7.添加1,000μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃下1000RPM持续3分钟)。
8.将管置于磁体支架并且将其留在适当位置上5分钟。在将管置于支架上的情况下，移出并丢弃上清液。
9.添加250μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃下1000RPM持续3分钟)。
10.将管置于磁道上；在1分钟后移出并丢弃上清液。
11.添加200μL脱磺化缓冲液。混合(例如，在30℃下1000RPM持续5分钟)。
12.将管置于磁道上；在1分钟后移出并丢弃上清液。
13.添加250μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃下1000RPM持续3分钟)。
14.将管置于磁道上；在1分钟后移出并丢弃上清液。
15.将250μL洗涤缓冲液添加到管中。混合(例如，在30℃下1000RPM持续3分钟)。
16.将管置于磁道上；在1分钟后移出并丢弃上清液。
17.在30℃下在盖打开的情况下将所有管孵育15分钟。
18.从磁道移除管并且将70μL洗脱缓冲液直接添加到珠粒中。
19.用洗脱缓冲液孵育珠粒(例如，在40℃下1000RPM持续45分钟)。
20.将管置于磁道上约一分钟；移出并保存上清液。
然后将转化的DNA用于预扩增和/或瓣状核酸内切酶测定，如下文所述。
QuARTS瓣状核酸内切酶测定
QuARTS技术将基于聚合酶的靶标DNA扩增过程与侵入性基于裂解的信号扩增过程组合。本技术描述于例如美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；以及9,212,392，其各自以引用的方式并入本文。由QuARTS反应生成的荧光信号以与实时PCR类似的方式监测并且允许定量样品中靶标核酸的量。
示例性QuARTS反应通常包含约400-600nmol/l(例如，500nmol/l)每种引物和检测探针、约100nmol/l侵入性寡核苷酸、约600-700nmol/l每种FRET盒(FAM，例如，如由Hologic,Inc.在商业上供应；HEX，例如，如由BioSearch Technologies在商业上供应；以及Quasar 670，例如，如由BioSearch Technologies在商业上供应)、6.675ng/μL FEN-1核酸内切酶(例如，2.0,Hologic,Inc.)、30μl反应体积中的1个单元的Taq DNA聚合酶(例如，DNA聚合酶，Promega Corp.,Madison,WI)、10mmol/l 3-(正吗啉代)丙磺酸(MOPS)、7.5mmol/l MgCl2以及250μmol/l每种dNTP。示例性QuARTS循环条件如下表所示。在一些应用中，定量循环(Cq)的分析提供样品中靶标DNA链(例如，拷贝数)的初始数目的测量。
大体积亚硫酸氢盐转化的DNA的多重靶向预扩增
为了预先扩增大部分或所有来自输入样品的亚硫酸氢盐处理的DNA，可在单一大体积多重扩增反应中使用大体积的处理的DNA。例如，使用例如如上所述的MaxwellPromega血液试剂盒AS1400从细胞系(例如，DFCI032细胞系(腺癌)；H1755细胞系(神经内分泌)提取DNA。DNA为亚硫酸氢盐转化的，例如，如上文所述的。
例如在含有以下各项的反应混合物中进行预先扩增：7.5mM MgCl2、10mM MOPS、0.3mM Tris-HCl pH 8.0、0.8mM KCl、0.1μg/μL BSA、0.0001％Tween-20,0.0001％IGEPALCA-630、250μM每种dNTP、寡核苷酸引物(例如，对于12种靶标、12个引物对/24个引物，以等摩尔量计(包括但不限于例如200-500nM每种引物的范围)，或者其中个别引物浓度被调整以平衡不同靶标区域的扩增效率)、0.025个单位/μL HotStart GoTaq浓度以及20体积％至50体积％的亚硫酸氢盐处理的靶标DNA(例如，10μL靶标DNA到50μL反应混合物中或者50μL靶标DNA到125μL反应混合物中)。选择对于反应的体积和扩增容器而言适当的热循环时间和温度。例如，反应可如下循环
在热循环之后，将预扩增反应的等分试样(例如，10μL)在10mM Tris-HCl pH8.0、0.1mM EDTA中在具有或不具有鱼DNA的情况下稀释到500μL。将稀释的预扩增的DNA的等分试样(例如，10μL)用于QuARTS PCR-瓣状测定中，例如，如上文所述的。还参见2015年10月30日提交的美国专利申请序列号62/249,097，其出于所有目的以引用的方式并入本文中。
实施例2
作为内部处理对照的合成斑马鱼DNA
通过标准的熟知的DNA合成方法诸如亚磷酰胺加成、并入如图所指示的内部甲基C碱基来合成具有如图2所示的序列的甲基化斑马鱼DNA的互补链。
A.互补合成DNA链的重悬和退火
1.合成链的重悬
a.以100mM 10mM Tris-HCl pH8.0、0.1mM EDTA制备图2所示的各寡核苷酸的单独1μM浓度的溶液。
b.在37℃干燥浴中孵育30分钟以完全溶解DNA。
c.冷却至室温(5分钟)并且简单涡旋并离心以使内容物聚集到管底部。
d.在使用期间将重悬的寡核苷酸维持在冰上或者放置在-20℃下以用于长期储存。
2.制备10X退火缓冲液：
e.制备500mM NaCl、200mM Tris-HCl pH 8.0和20mM MgCl2的溶液。
3.使合成链退火：
f.在100μL总体积中，将等摩尔量的1X退火缓冲液中的各种单链寡核苷酸组合，例如，如以下表所示：
g.将退火混合物加热到98℃持续13分钟。
h.从加热块移出反应管并简单地旋转减慢以使冷凝物聚集到管底部。
i.将反应管在室温下孵育20分钟。
j.添加0.9ml鱼DNA稀释液(在10mM Tris-HCl pH8.0、0.1mM EDTA中的20ng/mL鱼DNA)以将斑马鱼DNA的浓度调节到基因组鱼DNA载体的载体中的1.0×1010个拷贝/μL退火的双链合成斑马鱼DNA。
k.用10mM Tris-HCl pH8.0、0.1mM EDTA缓冲液将10μL 1.0×1010个拷贝/μL储备液稀释到1ml以制备1.0×108个拷贝/μL。
l.用10mM Tris-HCl pH8.0、0.1mM EDTA缓冲液将10μL 1.0×108个拷贝/μL储备液稀释到1ml以制备1.0×106个拷贝/μL。
m.将所有储备液保存在-20℃下。
B.作为测定靶标的退火的双链甲基化斑马鱼rassf1 DNA的测试使用QuARTS瓣状测定分析退火的DNA以在定量检测测定中评定合成DNA的性能。所述测定如下进行：
1.以鱼DNA稀释液(10mM Tris-HCl pH 8.0、0.1mM EDTA中的20ng/ml鱼DNA)制备退火的斑马鱼靶标DNA的5倍系列稀释液以实现以下最终浓度：1.0×103、200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.0128个斑马鱼DNA的拷贝/μL。
2.制备10X含有以下的寡核苷酸混合物：各自2μM的正向引物和反向引物、各自5μM的探针和FRET盒以及每种dNTP 250μM的dNTP(对于引物、探针和FRET盒序列，参见下文)
“UT”引物和探针被设计为检测未处理，即未通过亚硫酸氢盐处理来转换的DNA。
3.制备20X含有以下的酶混合物：
200mM MOPS、pH 7.5、150mM MgCl2、6.38mM Tris-HCl、pH 8.0、15.94mM KCl、2μg/μL BSA、0.16％Tween-20、0.16％IGEPAL CA-630、25％甘油、146ng/μL裂解酶2.0、1个单位/μL HotStart GoTaq聚合酶。
4.如下制备QuARTS瓣状测定主混合物：
5.将20μL QuARTS主混合物等分到96孔测定板的每个孔中。将10μL稀释的样品添加到含有主混合物的孔中。
6.用光学密封物密封板并放置到LightCycler 480并且允许如下所述的曲线：
结果示出在图3-4中并且显示Cp对比log输入链的标准曲线(图4)并且示出每个QuARTS测定反应降低到10个斑马鱼DNA拷贝的线性反应。这些数据还证明斑马鱼测定寡核苷酸不会与用于稀释液中的载体鱼DNA交叉反应。
实施例3
作为用于从血浆中进行DNA提取的方法对照并用亚硫酸氢盐处理的斑马鱼DNA的评定
在系列稀释测定之后，选择将产生属于最常见使用的校准器的范围内的链计数的输入链值。用于大部分QuARTS测定的校准器的范围为每次反应200,000条链到每次反应20条链。已计算，在提取之前将12,000个合成斑马鱼DNA拷贝(如以上所述地制备)添加到每个血浆样品中并以125μL体积的缓冲液洗脱提取的DNA将基于每次反应的10μL样品每μL斑马鱼DNA产生192条链并且每次QuARTS测定产生1,920条链。
为了监测个别样品中的提取产率的一致性，在提取前将296个单独血浆样品各自掺入12,000个斑马鱼DNA拷贝。如实施例1所述的并被配置为检测斑马鱼DNA和β-肌动蛋白的QuARTS瓣状测定用于测量在处理之后和在亚硫酸氢盐转化之前回收的DNA拷贝数目。
然后如实施例1所述的，将各个提取的样品的70μL等分试样亚硫酸氢盐转化，并且在各个QuARTS瓣状测定中测试10μL亚硫酸氢盐处理的DNA。下文示出296种样品的结果：
这些数据显示，在亚硫酸氢盐处理之前和之后检测的平均链产生一致且准确的斑马鱼DNA链计数，这指示斑马鱼DNA与用于提取和亚硫酸氢盐转化过程的方法对照一致且可靠。
实施例4
在用于未转化和亚硫酸氢盐处理的靶标DNA的斑马鱼DNA检测测定与人类DNA之间的交叉反应性的评定
此实施例着眼于斑马鱼检测寡核苷酸是否与存在于反应物中的人类DNA交叉反应，并且反之亦然，两者均在亚硫酸氢盐转化之前和之后(即，使用涉及未转化和亚硫酸氢盐转化的斑马鱼DNA的斑马鱼测定寡核苷酸)。所述测定如下进行：
1.根据制造商说明书使用Maxwell RSC ccfDNA血浆试剂盒(Promega Corp.,Madison,WI)从1mL人类血浆提取DNA。将如实施例2所述的100μL斑马鱼DNA添加到120个拷贝/μL或者将10mM Tris-HCl pH 8、0.1mM EDTA添加到用于提取的裂解缓冲液中
2.以125μL 10mM Tris-HCl pH8.0、0.1mM EDTA洗脱DNA。
3.使用β-肌动蛋白和斑马鱼DNA测定对10uL洗脱的DNA进行双重QuARTS测定反应。
如下所示的未处理的DNA的寡核苷酸：
β-肌动蛋白UT正向引物 5′CCATGAGGCTGGTGTAAAG3′
(SEQ ID NO：15)
β-肌动蛋白UT反向引物 5′CTACTGTGCACCTACTTAATACAC3′
(SEQ ID NO：16)
β-肌动蛋白UT探针(加下划线臂1) 5′CGCCGAGGGCGGCCTTGGAG/3C6/
(SEQ ID NO：17)
ZF_RASSF1 UT正向引物 5′CGCATGGTGGGCGAG3′
(SEQ ID NO：4)
ZF_RASSF1 UT反向引物 5′ACACGTCAGCCAATCGGG3′
(SEQ ID NO：5)
ZF_RASSF1 UT探针(加下划线臂7) 5′GCGCGTCCGCGCGTGCGCC/3C6/
(SEQ ID NO：23)
未处理的靶标DNA的引物混合物包含200nM各种引物。
4.对70μL洗脱的DNA进行亚硫酸氢盐转化并且在70μL 10mM Tris-HCl pH8.0、0.1mM EDTA中进行洗脱转化；
5.使用50μL亚硫酸氢盐转化的DNA，使用涉及亚硫酸氢转化的DNA的β-肌动蛋白和斑马鱼引物和探针如下进行双重PCR：
i.制备各自浓度为750nM的以下引物寡核苷酸的混合物
β-肌动蛋白BT正向引物65：5′GTGTTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA3′
(SEQ ID NO：18)
β-肌动蛋白BT反向引物65：5′CTTTACACCAACCTCATAACCTTATC 3′
(SEQ ID NO：19)
ZF_RASSF1 BT正向引物：5′TGCGTATGGTGGGCGAG3′
(SEQ ID NO：7)
ZF_RASSF1 BT反向引物：5′CCTAATTTACACGTCAACCAATCGAA3′
(SEQ ID NO：8)
ii.对于每种亚硫酸氢盐处理的样品，制备以下PCR扩增反应混合物：
10X反应缓冲液为75mM MgCl2、100mM MOPS、3mM Tris-HCl、pH 8.0、8mM KCl、1μg/μL BSA、0.001％Tween-20以及0.001％IGEPAL CA-630。
iii.使用以下循环条件进行12次扩增循环：
| 阶段 | 温度/时间 | 循环次数 |
| 预孵育 | 95℃/5min | 1 |
| 扩增 | 95℃/30s | 12 |
| 64℃/60s | ||
| 冷却 | 4℃/保持 | 1 |
iv.通过将10μL扩增的反应产物与90μL 10mM TrisHCl、pH 8.0、0.1mM EDTA组合来稀释步骤iii的反应物。
v.制备含有各自为250μM的dNTP和下文所示的寡核苷酸(其中正向引物和反向引物各自为2μM)以及各自为5μM的探针和FRET盒的10X寡核苷酸/dNTP混合物：
β-肌动蛋白BT正向引物65：5′GTGTTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA 3′
(SEQ ID NO：18)
β-肌动蛋白BT反向引物65：5′CTTTACACCAACCTCATAACCTTATC 3′
(SEQ ID NO：19)
ZF_RASSF1 BT正向引物：5′TGCGTATGGTGGGCGAG3′
(SEQID NO：7)
ZF_RASSF1 BT反向引物：5′CCTAATTTACACGTCAACCAATCGAA3′
(SEQ ID NO：8)
ZF_RASSF1 BT探针(臂5)：5′CCACGGACGGCGCGTGCGTTT/3C6/
(SEQ ID NO：10)
β-肌动蛋白BT探针(臂3)：5′GACGCGGAGATAGTGTTGTGG/3C6/3′
(SEQ ID NO：20)
臂3 QUASAR670：5′Q670/TCT/BHQ_2／AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACTCCGCGTC/3C6
(SEQ ID NO：21)
臂5 FAM：5′d-FAM-TCT-BHQ-1-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACGTCCGTGG-C6
(SEQ ID NO：22)
vi.制备20X含有以下的酶混合物：
200mM MOPS、pH 7.5、150mM MgCl2、6.38mM Tris-HCl、pH8.0、15.94mM KCl、2ug/ul BSA、0.16％Tween-20、0.16％IGEPAL CA-630、25％甘油、146ng/ul裂解酶2.0、1个单位/μL hotstart GoTaq聚合酶。
vii.如下设定QuARTS瓣状测定主混合物(每次反应的量)：
viii.对于每次反应，将20μl QuARTS主混合物与10μl亚硫酸氢盐转化的DNA。
ix.用光学密封物密封板并且将其放置到LightCycler 480并运行如实施例2所述的曲线数据，检测斑马鱼DNA的FAM信号和β-肌动蛋白DNA的QUASAR-670信号：
x.使用由含有亚硫酸氢盐转化的β-肌动蛋白和斑马鱼DNA的序列的质粒稀释系列生成的标准曲线分析数据。
在亚硫酸氢盐转化之前和之后进行的QuARTS测定的结果汇总如下(每个测定进行两次)：
未处理的β-肌动蛋白DNA+/-斑马鱼DNA的瓣状测定结果
亚硫酸氢盐转化的β-肌动蛋白DNA+/-转化的斑马鱼DNA的瓣状测定
使用未处理和亚硫酸氢盐转化的DNA的β-肌动蛋白测定获得的信号显示人类DNA存在于样品中。使用未处理和亚硫酸氢盐转化的DNA的斑马鱼DNA测定获得的信号显示斑马鱼测定试剂不会与存在于这些样品中的未处理或亚硫酸氢盐转化的人类DNA交叉反应。
实施例5
在从血浆提取的DNA中的斑马鱼DNA与β-肌动蛋白的比较
运行测定以确定所添加的斑马鱼DNA的存在是否改变使用β-肌动蛋白对照可检测的提取的DNA的量。
在使用和未使用如实施例1所述的DNA提取之前添加的12,000个斑马鱼DNA拷贝的情况下，进行两种血浆样品(样品ID 4517和4520)提取。在提取DNA之后，使用涉及未处理(UT)β-肌动蛋白和斑马鱼DNA的引物和探针混合物，使用实施例2的部分B中所述的方案，测定10μL洗脱的DNA。对每种条件进行两次重复并且在下表中示出每种类型的DNA的平均测量链计数(误差示出为差不多平均链值)：
合成斑马鱼DNA的存在或不存在似乎对β肌动蛋白DNA的平均检测量几乎不具有或不具有影响，这指示斑马鱼DNA不会干扰其他DNA的回收或检测。另外，当未添加斑马鱼DNA时，未检测到其信号，这证实未处理DNA和提取的人类DNA的斑马鱼测定寡核苷酸之间不存在交叉反应性。
尽管本文的公开内容是指某些所说明的实施方案，但是应理解，这些实施方案通过举例而不是通过限制的方式呈现。以上说明书中所提及的所有公开和专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。本技术的所描述的组合物、方法和用途的各种修改和变化对于本领域技术人员是显而易知的，而不背离所描述的技术的范围和精神。虽然已结合具体的示例性实施方案描述了本技术，但应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地局限于这些具体的实施方案。事实上，对分子生物学、生物学、化学、生物化学、医学科学或相关领域的技术人员来说显而易见的用于执行本发明的所描述模式的各种修改意图在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> EXACT SCIENCES CORPORATION
<120> 来自非人类生物体的核酸对照分子
<130> EXCT-34545/WO-1/ORD
<150> US 62/364,046
<151> 2016-07-19
<160> 24
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 2241
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 1
tcagcaaatg aagtctgctc tccgttcgct cctcaaagta ggacagatcg cgccggatta 60
agcgttaatc tgagtcttct gcgcatgcgc atgaacgcgc gctacaagcg gacaaggtgc 120
gcgttcgaag aagaaacgaa ccgagccggt ttcgagcagc gacaacgcga atgaagccca 180
cggagtaccg aaaccttgag gaattcatct ttctgccagc ggaggactgt tttcagttta 240
gttttgagcg taatggaaga tgtttgggca cttttgcgca atccctcatg ttatcgcctc 300
acagacacgc gtcgcgcgcg cagattacgc ttaatttgag cggatttgag gaaacagacg 360
cgtttactgt cagtcgaggc tctactgaag actgaaagtg gcttgtttgg gtttaagatt 420
gacccagatg ctactgaaaa ctgtcaatca agaaggaaac tcttgaagca ataaaaacat 480
catctctgtt atatgaagac tgtcagatcc acacagtgat ccatgtttgt ggatatgcaa 540
acacatcaga acgagacgct aaatttatca gcttgctttg gagtaaacag cgttgcttta 600
aaacactcca cagtcataaa tcatctccag ccctaaccat ggtccactga gccatgccgt 660
tcatcctccc acgatcccaa aatggcaaaa tgtgagctca tcgagttgca ggacttgact 720
ccgaatgacc gtattgagct ggcaccccct agtgtccctc cacccaccgt ggtgcccact 780
ctggacaggt ggagcagagg gaaggtggtg cgcatggtgg gcgagcgcgt gcgcctggag 840
gaccccgatt ggctgacgtg taaaccagga cgaggacatg actttcagcc ctgcagccag 900
acacagctga gctggtgtga cctgtgtgga gagttcatct ggggcctgta cagacagagc 960
ctccgctgca cacactgtaa ctacacttgt cactaccgct gtcaaccctt cattcagctg 1020
gactgcagct ccaacaccga cactatctgc gaacaatcaa actacagcga ggacaccatc 1080
gagacagaca ccaatgtgga tgagcagtct gaagtggact ggaggaaaca ggatctgtct 1140
gtcactgaaa tacagcagaa agtgaaggaa tacaatgctc aggtcaacag taacctcttc 1200
atggttctga atcgtgacgg ctcatacact ggcttcatca aggtccagtt taagctggcg 1260
cgacccgtgt ctcttcctcc tccccgcagc gtctcctcct cctccatctc ctcctcttgt 1320
ttaggatggg atggcggctg tcaggagcga acttccttct acctgcccag agacacagtc 1380
aagcacctgc acatcagctc cagcacccgt gccagagagg tcatccaggc cctgctcaac 1440
aagttcactg tggtggacaa tccggctaaa tattccctgt atgagcgcag ccagcgggac 1500
aatcaagtgt acttaaggaa gttagctgat gatgaatgtc cacttttcct gcgtctgtgt 1560
gctggaccca atgagaaagt cctgagttta gtgcttaaag agaatgaaac cggggaagtg 1620
aattgggatg cgttcagttt tcctgaactc cagaacttcc tgcggattct ccagcgggag 1680
gaagaagatc acgtccggca aatcatacgc cgatacactc tggctcgtga taagatgaaa 1740
gaggctatga agaacttcag caagcctggc tgaatgaatc tgtgtttata cctcacaaac 1800
aagagagatc gaggaggaaa caaggcttat tactgtctga gtccaaagag tgtgtgaaag 1860
agcccttcgt cctactgtgg acataatgag ggttgaaagt gaaatgcagt gagcgagaga 1920
agagatgcgt gtgtttgaag catgactgtt gagtgtgact tcacactgga ggaaatgctg 1980
cgctcgtagc cgtagatcca gtggagagat gtcttcctgt ggagaatcta tatatcagtg 2040
cagattacag agtattttca gcaccattta aacttgtcat aggaaattaa acgaggatta 2100
ttttaatatc tgtatcaaaa tgccacctgt tagtgacaca gtaacttgtc atattttgaa 2160
gctcccatgt atatatttgg atgtttgttg tcaattattc tgaaaataga tacaaataaa 2220
ctatttttcc ctttaaaatg a 2241
<210> 2
<211> 420
<212> DNA
<213> 斑马鱼
<400> 2
atcagaacga gacgctaaat ttatcagctt gctttggagt aaacagcgtt gctttaaaac 60
actccacagt cataaatcat ctccagccct aaccatggtc cactgagcca tgccgttcat 120
cctcccacga tcccaaaatg gcaaaatgtg agctcatcga gttgcaggac ttgactccga 180
atgaccgtat tgagctggca ccccctagtg tccctccacc caccgtggtg cccactctgg 240
acaggtggag cagagggaag gtggtgcgca tggtgggcga gcgcgtgcgc ctggaggacc 300
ccgattggct gacgtgtaaa ccaggacgag gacatgactt tcagccctgc agccagacac 360
agctgagctg gtgtgacctg tgtggagagt tcatctgggg cctgtacaga cagagcctcc 420
<210> 3
<211> 420
<212> DNA
<213> 斑马鱼
<400> 3
attagaacga gacgttaaat ttattagttt gttttggagt aaatagcgtt gttttaaaat 60
attttatagt tataaattat ttttagtttt aattatggtt tattgagtta tgtcgtttat 120
ttttttacga ttttaaaatg gtaaaatgtg agtttatcga gttgtaggat ttgatttcga 180
atgatcgtat tgagttggta ttttttagtg tttttttatt tatcgtggtg tttattttgg 240
ataggtggag tagagggaag gtggtgcgta tggtgggcga gcgcgtgcgt ttggaggatt 300
tcgattggtt gacgtgtaaa ttaggacgag gatatgattt ttagttttgt agttagatat 360
agttgagttg gtgtgatttg tgtggagagt ttatttgggg tttgtataga tagagttttc 420
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 4
cgcatggtgg gcgag 15
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 5
acacgtcagc caatcggg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 6
gacgcggagg cgcgtgcgcc 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 7
tgcgtatggt gggcgag 17
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 8
cctaatttac acgtcaacca atcgaa 26
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 9
gacgcggagg cgcgtgcgtt t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 10
ccacggacgg cgcgtgcgtt t 21
<210> 11
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 11
tccacgtggt gcccactctg gacaggtgga gcagagggaa ggtggtggca tggtggggag 60
ggtggcctgg aggacccgat tggctgagtg taaaccagga gaggacatga ctttcagccc 120
tgcagccaga cacagctgag ctggtgtgac ctgtgtggag agttcatctg g 171
<210> 12
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 12
ccagatgaac tctccacaca ggtcacacca gctcagctgt gtctggctgc agggctgaaa 60
gtcatgtcct gtcctggttt acagtcagcc aatggggtcc tccagggcag gctgcccacc 120
atggcaccac cttccctctg ctccacctgt ccagagtggg caccaggtgg a 171
<210> 13
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 13
ctctgacctg agtctccttt ggaactctgc aggttctatt tgctttttcc cagatgagct 60
ctttttctgg tgtttgtctc tctgactagg tgtctaagac agtgttgtgg gtgtaggtac 120
taacactggc tcgtgtgaca aggccatgag gctggtgtaa agcggccttg gagtgtgtat 180
taagtaggtg cacagtaggt ctgaacagac tccccatccc aaga 224
<210> 14
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 14
ttttgatttg agtttttttt ggaattttgt aggttttatt tgtttttttt tagatgagtt 60
ttttttttgg tgtttgtttt tttgattagg tgtttaagat agtgttgtgg gtgtaggtat 120
taatattggt ttgtgtgata aggttatgag gttggtgtaa agtggttttg gagtgtgtat 180
taagtaggtg tatagtaggt ttgaatagat tttttatttt aaga 224
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 15
ccatgaggct ggtgtaaag 19
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 16
ctactgtgca cctacttaat acac 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 17
cgccgagggc ggccttggag 20
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 18
gtgtttgttt ttttgattag gtgtttaaga 30
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 19
ctttacacca acctcataac cttatc 26
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 20
gacgcggaga tagtgttgtg g 21
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 21
agccggtttt ccggctgaga ctccgcgtc 29
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 22
agccggtttt ccggctgaga cgtccgtgg 29
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 23
gcgcgtccgc gcgtgcgcc 19
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物/探针
<400> 24
agccggtttt ccggctgaga ggacgcgc 28
Claims (39)
1.一种组合物，其包含与哺乳动物DNA不具有显著同源性的合成的甲基化DNA，其中所述合成的甲基化DNA与哺乳动物DNA处于混合物中。
2.如权利要求1所述的组合物，其还在所述混合物中包含第三组分，其中所述第三组分选自
-包含与所述合成的甲基化DNA互补的区域的寡核苷酸；
-包含与所述哺乳动物DNA互补的区域的寡核苷酸；
-细菌、噬菌体、病毒、古细菌或非鱼真核生物核酸聚合酶；和/或
-细菌、噬菌体、古细菌或非鱼真核生物DNA修饰酶。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述合成的甲基化DNA包括斑马鱼DNA。
4.一种组合物，所述组合物在混合物中包含分离的甲基化斑马鱼DNA和第二组分，其中所述第二组分选自
-非鱼DNA；
-非鱼真核细胞；和/或
-非鱼生物样品。
5.如权利要求4所述的组合物，其还包含
-细菌、噬菌体、病毒、古细菌或非鱼真核生物核酸聚合酶；和/或
-细菌、噬菌体、古细菌或非鱼真核生物DNA修饰酶。
6.如权利要求4所述的组合物，其中所述斑马鱼DNA为合成的。
7.如权利要求3或权利要求4所述的组合物，其中所述斑马鱼DNA包含斑马鱼rassf1基因的至少一部分。
8.如权利要求3-7中任一项所述的组合物，其中所述斑马鱼DNA包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少一部分。
9.如权利要求3-8中任一项所述的组合物，其中所述斑马鱼DNA包含SEQ ID NO:2或其互补序列或者SEQ ID NO:3或其互补序列的至少一部分。
10.如权利要求3或权利要求6所述的组合物，其中所述合成的斑马鱼DNA包含具有序列SEQ ID NO:11的寡核苷酸和/或具有序列SEQ ID NO:12的寡核苷酸。
11.如权利要求3-6和权利要求9中任一项所述的组合物，其中所述斑马鱼DNA为亚硫酸氢盐处理的DNA。
12.如权利要求4所述的组合物，其中所述非鱼DNA为哺乳动物DNA。
13.如权利要求1-3和权利要求12中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物DNA为人类DNA。
14.如权利要求4所述的组合物，其中所述非鱼真核细胞为哺乳动物细胞。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞为人类细胞。
16.如权利要求2或权利要求5所述的组合物，其中所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述DNA聚合物为热稳定性DNA聚合酶。
18.如权利要求2或权利要求5所述的组合物，其中所述DNA修饰酶包括连接酶、核酸外切酶和/或核酸内切酶。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述核酸内切酶为瓣状核酸内切酶。
20.如权利要求4所述的组合物，其中所述非鱼生物样品为来自哺乳动物的样品。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述哺乳动物为人类。
22.如权利要求21所述的组合物，其中来自人类的所述生物样品包括血液、血清、血浆、组织、粪便或痰中的一种或多种。
23.一种处理来自非斑马鱼受试者的含有DNA的样品的方法，其包括
a)将分离的甲基化斑马鱼DNA与所述样品组合在混合物中；以及
b)处理所述混合物以从所述混合物纯化DNA。
24.一种处理来自哺乳动物的含有DNA的样品的方法，其包括
a)将与哺乳动物DNA不具有显著同源性的合成甲基化DNA与来自哺乳动物的DNA组合在混合物中；以及
b)处理所述混合物以从所述混合物纯化DNA。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述合成的甲基化DNA包括斑马鱼DNA。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述处理包括将DNA结合到支持体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述支持体包括二氧化硅颗粒。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其还包括用亚硫酸氢盐试剂处理从所述混合物纯化的DNA。
29.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其还包括用核酸检测测定检测从所述混合物纯化的DNA。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述核酸检测测定包括检测来自所述样品的DNA和甲基化斑马鱼DNA。
31.如权利要求23所述的方法，其中所述斑马鱼DNA为合成的。
32.如权利要求23和25-31中任一项所述的方法，其中所述斑马鱼DNA包含斑马鱼rassf1基因的至少一部分。
33.如权利要求23和25-32中任一项所述的方法，其中所述斑马鱼DNA包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少一部分。
34.如权利要求23和25-32中任一项所述的方法，其中所述斑马鱼DNA包含SEQ ID NO:2或其互补序列或者SEQ ID NO:3或其互补序列的至少一部分。
35.如权利要求25或权利要求31所述的方法，其中所述合成的斑马鱼DNA包含具有序列SEQ ID NO:11的寡核苷酸和/或具有序列SEQ ID NO:12的寡核苷酸。
36.一种试剂盒，其包含与哺乳动物DNA不具有显著同源性的合成的甲基化DNA并且还包含至少一种选自由以下组成的组的组分：
i)包含与哺乳动物DNA互补的区域的寡核苷酸；
ii)包含与所述合成的甲基化DNA互补的区域的寡核苷酸；
iii)亚硫酸氢盐试剂；
iv)二氧化硅颗粒或二氧化硅涂覆的颗粒；
v)离液剂；
vi)缓冲剂；
vii)核酸聚合酶；以及
viii)DNA修饰酶；以及FRET盒。
37.如权利要求36所述的试剂盒，其中所述合成的甲基化DNA包含SEQ ID NO:1或其互补序列或者SEQ ID NO:2或其互补序列的至少一部分。
38.如权利要求36所述的试剂盒，其中所述合成的甲基化DNA包含具有序列SEQ ID NO:11的寡核苷酸和/或具有序列SEQ ID NO:12的寡核苷酸。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述合成的甲基化DNA基本上由退火到具有序列SEQ ID NO:12的寡核苷酸的具有序列SEQ ID NO:11的寡核苷酸组成。
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|---|---|---|---|
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| CN201780039764.3A Active CN109642227B (zh) | 2016-07-19 | 2017-07-19 | 来自非人类生物体的核酸对照分子 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113025692A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-06-25 | 江苏为真生物医药技术股份有限公司 | 灵长类动物dna甲基化相对定量试剂盒 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018017710A1 (en) | 2016-07-19 | 2018-01-25 | Exact Sciences Development Company, Llc | Nucleic acid control molecules from non-human organisms |
| EP3978624A1 (en) | 2016-07-19 | 2022-04-06 | Exact Sciences Corporation | Methylated control dna |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101675171A (zh) * | 2007-03-02 | 2010-03-17 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用basp1基因和/或srd5a2基因中的甲基化胞嘧啶检测肝癌、肝癌风险、肝癌复发风险、肝癌恶化和肝癌随时间进展的方法 |
| CN103717750A (zh) * | 2011-04-29 | 2014-04-09 | 塞昆纳姆股份有限公司 | 少数核酸物质的定量 |
Family Cites Families (75)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288609A (en) | 1984-04-27 | 1994-02-22 | Enzo Diagnostics, Inc. | Capture sandwich hybridization method and composition |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5011769A (en) | 1985-12-05 | 1991-04-30 | Meiogenics U.S. Limited Partnership | Methods for detecting nucleic acid sequences |
| US5359100A (en) | 1987-10-15 | 1994-10-25 | Chiron Corporation | Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers |
| US5124246A (en) | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| US5403711A (en) | 1987-11-30 | 1995-04-04 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
| CA1340807C (en) | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| US5639611A (en) | 1988-12-12 | 1997-06-17 | City Of Hope | Allele specific polymerase chain reaction |
| CA2036946C (en) | 1990-04-06 | 2001-10-16 | Kenneth V. Deugau | Indexing linkers |
| US5494810A (en) | 1990-05-03 | 1996-02-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease |
| US5849481A (en) | 1990-07-27 | 1998-12-15 | Chiron Corporation | Nucleic acid hybridization assays employing large comb-type branched polynucleotides |
| US5846717A (en) | 1996-01-24 | 1998-12-08 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
| US5994069A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages |
| US6872816B1 (en) | 1996-01-24 | 2005-03-29 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection kits |
| US5338671A (en) | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| AU8102694A (en) | 1993-11-17 | 1995-06-06 | Id Biomedical Corporation | Cycling probe cleavage detection of nucleic acid sequences |
| DE69531612D1 (de) | 1994-04-25 | 2003-10-02 | Avitech Diagnostics Inc | Die bestimmung von mutationen durch spaltung mit resolvase |
| US5851770A (en) | 1994-04-25 | 1998-12-22 | Variagenics, Inc. | Detection of mismatches by resolvase cleavage using a magnetic bead support |
| ES2185719T3 (es) | 1994-12-23 | 2003-05-01 | Dade Behring Inc | Deteccion de acidos nucleicos por formacion de un producto catalizada por diana. |
| US5882867A (en) | 1995-06-07 | 1999-03-16 | Dade Behring Marburg Gmbh | Detection of nucleic acids by formation of template-dependent product |
| US5773258A (en) | 1995-08-25 | 1998-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme |
| US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US5965408A (en) | 1996-07-09 | 1999-10-12 | Diversa Corporation | Method of DNA reassembly by interrupting synthesis |
| EP0876510B1 (en) | 1995-12-22 | 2008-05-07 | Dade Behring Marburg GmbH | Homogeneous amplification and detection of nucleic acids |
| US5670325A (en) | 1996-08-14 | 1997-09-23 | Exact Laboratories, Inc. | Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample |
| US5985557A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Invasive cleavage of nucleic acids |
| US5741650A (en) | 1996-01-30 | 1998-04-21 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting colon cancer from stool samples |
| DE69738687D1 (de) | 1996-04-12 | 2008-06-26 | Phri Properties Inc | Sonden, kits und assays |
| US6020137A (en) | 1996-08-14 | 2000-02-01 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
| US6146828A (en) | 1996-08-14 | 2000-11-14 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor |
| US6203993B1 (en) | 1996-08-14 | 2001-03-20 | Exact Science Corp. | Methods for the detection of nucleic acids |
| US5952178A (en) | 1996-08-14 | 1999-09-14 | Exact Laboratories | Methods for disease diagnosis from stool samples |
| US6143529A (en) | 1996-08-14 | 2000-11-07 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for improving sensitivity and specificity of screening assays |
| US6300077B1 (en) | 1996-08-14 | 2001-10-09 | Exact Sciences Corporation | Methods for the detection of nucleic acids |
| US5928870A (en) | 1997-06-16 | 1999-07-27 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
| US6096273A (en) | 1996-11-05 | 2000-08-01 | Clinical Micro Sensors | Electrodes linked via conductive oligomers to nucleic acids |
| US5830665A (en) | 1997-03-03 | 1998-11-03 | Exact Laboratories, Inc. | Contiguous genomic sequence scanning |
| US6013459A (en) | 1997-06-12 | 2000-01-11 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Detection of analytes using reorganization energy |
| US6406857B1 (en) | 1997-06-16 | 2002-06-18 | Exact Sciences Corporation | Methods for stool sample preparation |
| US6268136B1 (en) | 1997-06-16 | 2001-07-31 | Exact Science Corporation | Methods for stool sample preparation |
| US5888778A (en) | 1997-06-16 | 1999-03-30 | Exact Laboratories, Inc. | High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers |
| US6818404B2 (en) | 1997-10-23 | 2004-11-16 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting hypermethylated nucleic acid in heterogeneous biological samples |
| CA2307177C (en) | 1997-10-23 | 2004-06-29 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting contamination in molecular diagnostics using pcr |
| US6063573A (en) | 1998-01-27 | 2000-05-16 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Cycling probe technology using electron transfer detection |
| CA2319712A1 (en) | 1998-02-04 | 1999-08-12 | Variagenics, Inc. | Mismatch detection techniques |
| US6235502B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-05-22 | Molecular Staging Inc. | Methods for selectively isolating DNA using rolling circle amplification |
| US6280947B1 (en) | 1999-08-11 | 2001-08-28 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension |
| US6503718B2 (en) | 1999-01-10 | 2003-01-07 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease |
| DE60028732T2 (de) | 1999-02-25 | 2007-06-14 | Exact Sciences Corp., Maynard | Verfahren zur erhaltung der dns-integrität |
| EP1169479B1 (en) | 1999-04-09 | 2006-06-28 | EXACT Sciences Corporation | Methods for detecting nucleic acids indicative of cancer |
| CA2372145A1 (en) | 1999-05-03 | 2000-11-09 | Exact Sciences Corporation | Stool specimen collector |
| US6586177B1 (en) | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| US6849403B1 (en) | 1999-09-08 | 2005-02-01 | Exact Sciences Corporation | Apparatus and method for drug screening |
| US6919174B1 (en) | 1999-12-07 | 2005-07-19 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| CA2394921A1 (en) | 1999-12-07 | 2001-06-14 | Anthony P. Shuber | Supracolonic aerodigestive neoplasm detection |
| EP1548130B1 (en) | 2000-11-15 | 2012-01-18 | Third Wave Technologies, Inc. | Fen endonucleases |
| US6428964B1 (en) | 2001-03-15 | 2002-08-06 | Exact Sciences Corporation | Method for alteration detection |
| US7662594B2 (en) | 2002-09-20 | 2010-02-16 | New England Biolabs, Inc. | Helicase-dependent amplification of RNA |
| US7211384B2 (en) | 2003-05-28 | 2007-05-01 | Agilent Technologies, Inc. | Comparative genomic hybridization assays using immobilized oligonucleotide targets with initially small sample sizes and compositions for practicing the same |
| WO2005023091A2 (en) | 2003-09-05 | 2005-03-17 | The Trustees Of Boston University | Method for non-invasive prenatal diagnosis |
| DE602004021192D1 (de) | 2003-10-09 | 2009-07-02 | Epigenomics Ag | Verbesserte bisulfitkonversion von dna |
| AU2005230936B2 (en) | 2004-03-26 | 2010-08-05 | Agena Bioscience, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| DK1871912T3 (da) | 2005-04-15 | 2012-05-14 | Epigenomics Ag | Fremgangsmåde til bestemmelse af DNA-methylering i blod- eller urinprøver |
| ES2739484T3 (es) | 2006-02-02 | 2020-01-31 | Univ Leland Stanford Junior | Prueba genética fetal no invasiva mediante análisis digital |
| KR101419980B1 (ko) | 2008-03-15 | 2014-07-15 | 홀로직, 인크. | 증폭 반응 도중에 핵산 분자를 분석하기 위한 조성물 및 방법 |
| US8916344B2 (en) | 2010-11-15 | 2014-12-23 | Exact Sciences Corporation | Methylation assay |
| US8361720B2 (en) | 2010-11-15 | 2013-01-29 | Exact Sciences Corporation | Real time cleavage assay |
| US8715937B2 (en) | 2010-11-15 | 2014-05-06 | Exact Sciences Corporation | Mutation detection assay |
| CA3111723A1 (en) | 2012-01-30 | 2013-08-08 | Exact Sciences Development Company, Llc | Sulfonated small dna compositions and methods for sulfonating and desulfonating small dnas |
| US9212392B2 (en) | 2012-09-25 | 2015-12-15 | Exact Sciences Corporation | Normalization of polymerase activity |
| AU2016343937B2 (en) | 2015-10-30 | 2023-01-19 | Exact Sciences Corporation | Multiplex amplification detection assay and isolation and detection of DNA from plasma |
| WO2018017710A1 (en) | 2016-07-19 | 2018-01-25 | Exact Sciences Development Company, Llc | Nucleic acid control molecules from non-human organisms |
| WO2018140781A1 (en) * | 2017-01-27 | 2018-08-02 | Exact Sciences Development Company, Llc | Detection of colon neoplasia by analysis of methylated dna |
-
2017
- 2017-07-19 WO PCT/US2017/042842 patent/WO2018017710A1/en unknown
- 2017-07-19 AU AU2017300534A patent/AU2017300534B2/en active Active
- 2017-07-19 US US16/318,578 patent/US11208680B2/en active Active
- 2017-07-19 EP EP17831787.1A patent/EP3488003B1/en active Active
- 2017-07-19 CN CN201780039764.3A patent/CN109642227B/zh active Active
- 2017-07-19 CA CA3029838A patent/CA3029838A1/en active Pending
- 2017-07-19 ES ES17831787T patent/ES2963227T3/es active Active
-
2021
- 2021-11-18 US US17/529,896 patent/US11952615B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101675171A (zh) * | 2007-03-02 | 2010-03-17 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用basp1基因和/或srd5a2基因中的甲基化胞嘧啶检测肝癌、肝癌风险、肝癌复发风险、肝癌恶化和肝癌随时间进展的方法 |
| CN103717750A (zh) * | 2011-04-29 | 2014-04-09 | 塞昆纳姆股份有限公司 | 少数核酸物质的定量 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MARY G GOLL等: "DNA methylation in zebrafish", 《PROG MOL BIOL TRANSL SCI》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113025692A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-06-25 | 江苏为真生物医药技术股份有限公司 | 灵长类动物dna甲基化相对定量试剂盒 |
| CN113025692B (zh) * | 2021-05-18 | 2021-11-30 | 江苏为真生物医药技术股份有限公司 | 灵长类动物dna甲基化相对定量试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20220136035A1 (en) | 2022-05-05 |
| AU2017300534A1 (en) | 2019-01-17 |
| US11952615B2 (en) | 2024-04-09 |
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| CN109642227B (zh) | 2023-02-28 |
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