CN109641002B

CN109641002B - 血液癌症的组合治疗

Info

Publication number: CN109641002B
Application number: CN201780048256.1A
Authority: CN
Inventors: 黄菲; J·J·鲁斯布尔特; A·里佐
Original assignee: Geron Corp
Current assignee: Geron Corp
Priority date: 2016-08-02
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: MX2019001315A; EP3318276A1; SI3493812T1; EP3493812B1; JP2022145948A; DK3493812T3; JP7016856B2; CL2019000228A1; JP2019523277A; CA3217021A1; EP4218768A1; EP3493812A1; BR112019002025A2; IL305332A; US11278561B2; SG11201900883UA; FI3493812T3; RS64074B1; WO2018026646A1; US20180036336A1

Abstract

本发明涉及用于血液癌症的组合治疗。更具体地，端粒酶抑制剂和Bcl‑2抑制剂的组合用于治疗血液癌症，包括AML。在某些实施例中，所述端粒酶抑制剂是伊美司他或伊美司他钠，所述Bcl‑2抑制剂是ABT‑199。

Description

血液癌症的组合治疗

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号62/370,018(2016年8月2日提交)、欧洲专利申请号16197293.0(2016年11月4日提交)和美国临时申请号62/422,738(2016年11月16日)的优先权，各申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。将2017年7月17日创建的所述ASCII拷贝命名为PRD3424WOPCT_SL.txt，大小为2,335字节。

技术领域

本文提供的公开内容涉及使用端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合治疗血液癌症。

背景技术

急性髓性白血病(AML)患者在诊断时具有有限的治疗选择；治疗通常采取化疗的形式，以迅速减少白血病细胞负荷。用于去除大量白细胞(正常和患病)的侵入性白细胞去除术可以与化疗同时应用以暂时降低肿瘤细胞负荷。诱导期化疗可能是成功的，但是，驻留在患者骨髓中的大多数健康细胞也被杀死，导致疾病并需要额外的缓解疗法来抵御感染并增加白细胞计数。可以使用额外轮次的化疗以试图使患者处于缓解期；但复发是常见的。

端粒酶存在于所有癌症类型的超过90％的肿瘤中；在正常健康组织中是缺乏的。伊美司他钠(Imetelstat sodium)是一种新型的一流端粒酶抑制剂，其是一种与人端粒酶RNA(hTR)模板区域互补的共价脂质化13-mer寡核苷酸(如下所示)。伊美司他钠不通过反义机制起作用，因此缺乏这些疗法常见的副作用。伊美司他钠是伊美司他的钠盐(如下所示)：

除非另有说明或从上下文中清楚得知，否则以下对伊美司他的提及也包括其盐。如上所述，伊美司他钠特别是伊美司他的钠盐。

ABT-199/venetoclax(商品名Venclexta)是FDA批准的Bcl-2抑制剂，其用于患有dell7p的复发/难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者。ABT-199也被称为ABT 199、GDC0199、GDC-0199或RG7601。ABT-199的化学名称为4-[4-[[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-l-基]甲基]哌嗪-l-基]-N-[3-硝基-4-(环氧乙烷-4-基甲基氨基)苯基]磺酰基-2-(lH-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺(Cas No.1257044-40-8)。除非另有说明或从上下文中清楚得知，否则以下对ABT-199的提及还包括其药学上可接受的盐。然而，具体地，在实例中，ABT-199以游离碱形式使用。

以下以游离碱形式显示的ABT-199对Bcl-2具高度特异性，不同于对相关Bel家族成员显示亲和力并诱导更大副作用的其他第一代抑制剂。Bcl-2的抑制阻断由细胞DNA内的损伤或异常引起的促细胞凋亡信号，并最终通过胱天蛋白酶级联反应导致治疗细胞中的程序性细胞死亡，并通过内源途径导致细胞凋亡。

发明内容

伊美司他钠和ABT-199在AML细胞中的组合给药为血液癌症，特别是AML提供了新的治疗。伊美司他钠目前正在骨髓纤维化(MF)和骨髓发育不良综合征(MDS)中用于临床研究。ABT-199被FDA批准用于CLL，并且也正在AML中进行研究。

当组合施用时，这两种药剂可以促进癌细胞中的细胞凋亡。当组合施用时，这两种药剂可以治疗有此需要的受试者的癌症。

因此，本发明的一个实施例是一种治疗血液癌症的方法，其包括将端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂组合施用给有此需要的受试者。

在该方法的一个实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在另一个实施例中，伊美司他是伊美司他钠。伊美司他或伊美司他钠可以施用1、2、3、4、5、6、7、8或多于8个给药周期，每个周期包括：(a)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他，每四周一次；(b)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他，每周一次，持续4周；(c)静脉内施用约2.5-10mg/kg伊美司他，每三周一次；或(d)静脉内施用约0.5-9.4mg/kg伊美司他，每四周一次。

治疗方法可用于治疗选自以下的血液癌症：急性髓性白血病；特发性血小板增多症；真性红细胞增多症；原发性骨髓纤维化；***性肥大细胞增多症；慢性髓细胞样白血病；慢性中性粒细胞性白血病；慢性嗜酸性粒细胞白血病；环状铁粒幼红细胞伴难治性贫血；多系发育不良伴难治性血细胞减少症；过量胚细胞伴难治性贫血；1型；过量胚细胞伴难治性贫血；2型；孤立性缺失(5q)伴骨髓发育不良综合征(MDS)；MDS未分型；慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)；非典型慢性髓细胞样白血病；幼年型髓单核细胞白血病；骨髓增生性/脊髓发育不良综合征-未分型；B淋巴细胞白血病/淋巴瘤；T淋巴细胞白血病/淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；原发性中枢神经***淋巴瘤；原发性纵隔B细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤/白血病；滤泡性淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤/沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症；套细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤；移植后淋巴组织增生性疾病；HIV相关淋巴瘤；原发性积液淋巴瘤；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；意义未知的单克隆丙种球蛋白病；郁积型多发性骨髓瘤；和孤立性浆细胞瘤(孤骨和髓外)。在一个实施例中，血液癌症是急性髓性白血病。因此，本发明的一个实施例是一种治疗急性髓性白血病的方法，其包括将伊美司他和ABT-199施用给患有急性髓性白血病的受试者。

本发明的另一个实施例是一种诱导血液癌细胞凋亡的方法，其包括使细胞与治疗有效量的端粒酶抑制剂接触，并使细胞与治疗有效量的Bcl-2抑制剂接触。在某些实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他或伊美司他钠。在某些实施例中，特别是在使用伊美司他的情况下，Bcl-2抑制剂是ABT-199。在某些实施例中，血液癌细胞选自以下类型的血液癌症：急性髓性白血病；特发性血小板增多症；真性红细胞增多症；原发性骨髓纤维化；***性肥大细胞增多症；慢性髓细胞样白血病；慢性中性粒细胞性白血病；慢性嗜酸性粒细胞白血病；环状铁粒幼红细胞伴难治性贫血；多系发育不良伴难治性血细胞减少症；过量胚细胞伴难治性贫血；1型；过量胚细胞伴难治性贫血；2型；孤立性缺失(5q)伴骨髓发育不良综合征(MDS)；MDS未分型；慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)；非典型慢性髓细胞样白血病；幼年型髓单核细胞白血病；骨髓增生性/脊髓发育不良综合征-未分型；B淋巴细胞白血病/淋巴瘤；T淋巴细胞白血病/淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；原发性中枢神经***淋巴瘤；原发性纵隔B细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤/白血病；滤泡性淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤/沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症；套细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤；移植后淋巴组织增生性疾病；HIV相关淋巴瘤；原发性积液淋巴瘤；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；意义未知的单克隆丙种球蛋白病；郁积型多发性骨髓瘤；和孤立性浆细胞瘤(孤骨和髓外)。在一个实施例中，血液癌细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。

诱导细胞凋亡的方法可以在体内或体外进行。因此，本发明的一个实施例是一种在急性髓性白血病(AML)细胞中诱导细胞凋亡的体外方法，其包括：使细胞与治疗有效量的伊美司他钠接触；并使细胞与治疗有效量的ABT-199接触。在另一个实施例中，该方法包括将治疗有效量的端粒酶抑制剂和Bel-2抑制剂施用给患有血液癌症的受试者。

本发明的另一个实施例是一种试剂盒，其包含：一定剂量的端粒酶抑制剂(例如伊美司他)，其量在施用时有效诱导血液癌细胞中的细胞凋亡；和一定剂量的Bcl-2抑制剂(例如ABT-199)，其量在施用时有效诱导血液癌细胞中的细胞凋亡。在又另一个实施例中，本发明涉及一种包含伊美司他或伊美司他钠和ABT-199的药物组合物。该组合物可以被配制用于治疗急性髓性白血病。

本发明还包括使用伊美司他或伊美司他钠治疗经历BCL抑制疗法的患者的血液癌症。在另一个实施例中，本发明涉及使用ABT-199治疗经历端粒酶抑制疗法的患者的血液癌症。

本发明的替代实施例涉及：(1)用于治疗血液癌症的方法中的端粒酶抑制剂(例如，伊美司他或伊美司他钠)，该方法包括将端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂(例如，ABT-199)组合施用给有此需要的受试者；或(2)包含端粒酶抑制剂(例如伊美司他或伊美司他钠)和Bcl-2抑制剂(例如Bcl-2)的组合，其用于治疗血液癌症的方法，该方法包括将该组合施用给有此需要的受试者。在这些实施例中，血液癌症可以是急性髓性白血病。替代地，血液癌症选自：急性髓性白血病(AML)；特发性血小板增多症；真性红细胞增多症；原发性骨髓纤维化；***性肥大细胞增多症；慢性髓细胞样白血病；慢性中性粒细胞性白血病；慢性嗜酸性粒细胞白血病；环状铁粒幼红细胞伴难治性贫血；多系发育不良伴难治性血细胞减少症；过量胚细胞伴难治性贫血；1型；过量胚细胞伴难治性贫血；2型；孤立性缺失(5q)伴骨髓发育不良综合征(MDS)；MDS未分型；慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)；非典型慢性髓细胞样白血病；幼年型髓单核细胞白血病；骨髓增生性/脊髓发育不良综合征-未分型；B淋巴细胞白血病/淋巴瘤；T淋巴细胞白血病/淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；原发性中枢神经***淋巴瘤；原发性纵隔B细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤/白血病；滤泡性淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤/沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症；套细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤；移植后淋巴组织增生性疾病；HIV相关淋巴瘤；原发性积液淋巴瘤；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；意义未知的单克隆丙种球蛋白病；郁积型多发性骨髓瘤；和孤立性浆细胞瘤(孤骨和髓外)。在这些实施例中，端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合诱导血液癌细胞的凋亡。

本发明另外的实施例涉及：(1)用于治疗急性髓性白血病(AML)的方法中的伊美司他钠，该方法包括将伊美司他钠和ABT-199组合施用给有此需要的受试者；(2)用于治疗急性髓性白血病(AML)的方法中的ABT-199，该方法包括将ABT-199和伊美司他钠组合施用给有此需要的受试者；或(3)用于治疗急性髓性白血病(AML)的方法中的包含伊美司他钠和ABT-199的组合，该方法包括将该组合施用给有此需要的受试者。在这些实施例中，伊美司他钠施用1、2、3、4、5、6、7、8或多于8个给药周期，每个周期包括：(a)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他钠，每四周一次；(b)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他钠，每周一次，持续4周；(c)静脉内施用约2.5-7mg/kg伊美司他钠，每三周一次；或(d)静脉内施用约0.5-9.4mg/kg伊美司他钠，每四周一次。另外，在这些实施例中，ABT-199以以下剂量施用：(a)每天约50-400mg ABT-199；(b)在第1天约2mg ABT-199，每日升高，在第6天最终剂量约800mg，此后每日一次；或者(c)在第1天约25mg ABT-199，每日升高，在第5天最终剂量约400mg，此后每日一次。同样在这些实施例中，ABT-199的施用可以是施用伊美司他钠前一天，后一天或同一天。

附图说明

图1A和1B显示用伊美司他钠和/或ABT-199治疗KG-1细胞48小时的效果。图1A显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗48小时并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色后KG-1细胞的点图。图1B显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗KG-1细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图2A和2B显示用伊美司他钠和/或ABT-199治疗KG-1细胞96小时的效果。图2A显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗96小时并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色后KG-1细胞的点图。图2B显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗KG-1细胞96小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图3A和3B显示用错配或非互补寡核苷酸和ABT-199治疗KG-1细胞48小时的效果。图3A显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗48小时并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色后KG-1细胞的点图。图3B显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗KG-1细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。非Comp是指非互补的对照寡核苷酸。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图4A和4B显示用错配或非互补寡核苷酸和ABT-199治疗KG-1细胞96小时的效果。图4A显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗96小时并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色后KG-1细胞的点图。图4B显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗KG-1细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。非Comp是指非互补的对照寡核苷酸。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图5A和5B显示用伊美司他钠和/或ABT-199治疗MOLM-13细胞48小时的效果。图5A显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗48小时并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色后MOLM-13细胞的点图。图5B显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗MOLM-13细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图6A和6B显示用伊美司他钠和/或ABT-199治疗MOLM-13细胞48小时的效果。图6A显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗96小时并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色后MOLM-13细胞的点图。图6B显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗MOLM-13细胞96小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图7A和7B显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗MOLM-13细胞48小时的效果。图7A显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗48小时并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色后MOLM-13细胞的点图。图7B显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗MOLM-13细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。非Comp是指非互补的对照寡核苷酸。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图8A和8B显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗MOLM-13细胞96小时的效果。图8A显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗96小时并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色后MOLM-13细胞的点图。图8B显示用不同浓度的ABT-199和/或对照寡核苷酸治疗MOLM-13细胞96小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。非Comp是指非互补的对照寡核苷酸。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图9显示在KG-1或MOLM-13细胞中用伊美司他钠，ABT-199或组合治疗48和96小时后通过RT-qPCR测量的hTERT转录水平。

图10显示在KG-1或MOLM-13细胞中用伊美司他钠，ABT-199或组合治疗48和96小时后通过qPCR TRAP测量的端粒酶活性水平。

图11显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗MOLM-13细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图12A和12B显示用不同浓度的ABT-199，对照错配寡核苷酸和非互补寡核苷酸治疗MOLM-13细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度。图12A显示用不同浓度的ABT-199和/或对照错配寡核苷酸“错配”治疗MOLM-13细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。图12B显示用不同浓度的ABT-199和/或对照非互补寡核苷酸“Non-comp”治疗MOLM-13细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图13显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗MOLM-13细胞96小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图14A和14B显示用不同浓度的ABT-199，对照错配寡核苷酸和非互补寡核苷酸治疗MOLM-13细胞48小时的％凋亡细胞与化合物浓度。图14A显示用不同浓度的ABT-199和/或对照错配寡核苷酸“错配”治疗MOLM-13细胞96小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。图14B显示用不同浓度的ABT-199和/或对照非互补寡核苷酸“Non-comp”治疗MOLM-13细胞96小时的％凋亡细胞与化合物浓度的图。凋亡细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶双重标记。

图15A-15D显示从AML患者的全血中纯化，并且离体暴露于用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠进行的16和40小时治疗的四个PBMC(外周血单核细胞)样品的平均反应，以及用膜联蛋白V和碘化丙啶染色通过流式细胞术测定来分析细胞活力。图15A和图15B显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗AML患者全血Ficoll纯化的PBMC 16小时的％活细胞与化合物浓度的图。图15A显示CD45⁺白细胞的结果。图15B显示CD45⁺/CD34⁺白血病干细胞的结果。图15C和图15D显示用不同浓度的ABT-199和/或伊美司他钠治疗AML患者全血Ficoll纯化的PBMC40小时的％活细胞与化合物浓度的图。图15C显示CD45⁺白细胞的结果。图15D显示CD45⁺/CD34⁺白血病干细胞的结果。在图15A-15D中，误差棒表示标准偏差。治疗后剩余的活细胞未用膜联蛋白V或碘化丙啶标记。

图16显示伊美司他钠或ABT-1作为单一疗法或两种药剂组合在小鼠模型中的体内抗肿瘤功效和存活益处。小鼠用MOLM-13细胞(弥散模型)接种，并用媒介、伊美司他钠和/或ABT-199、或错配寡核苷酸对照加ABT-199治疗。在治疗后监测小鼠的存活(发病时n＝10只小鼠/组)。具体而言，图16显示了作为肿瘤细胞植入后天数的函数的小鼠存活百分比。用以下治疗小鼠31天：(i)媒介(MM+PEG400/Phosal50/ETOH)；(ii)伊美司他钠(30mg/kg)，(iii)ABT-199(10mg/kg)，(iv)MM(错配寡聚物)(30mg/kg)和ABT-199(100mg/kg)；(v)伊美司他钠(30mg/kg)和ABT-199(100mg/kg)。

图17A和17B显示用伊美司他钠对MOLM-13和HL-60细胞单剂量治疗后96小时的凋亡群体。图17A显示用伊美司他钠对MOLM-13单剂量治疗后96小时的凋亡群体(双标记)。图17B显示用伊美司他钠对AML细胞系HL-60单剂量治疗后96小时的凋亡群体(双标记)。

具体实施方式

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的以下详细描述。提供附图用于说明本发明的某些实施例。然而，本发明不限于所示的精确布置、实例和工具。为了清楚地公开，而不是为了限制，本发明的详细描述分为描述或说明本发明的某些特征，实施例或应用的子部分。

本发明提供了用端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合治疗血液癌症的方法。耐药细胞群可导致对治疗或疾病复发的不完全响应。本发明提供了端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合，其协同作用以在AML细胞中诱导比任何药物可以单独诱导的更高水平的细胞凋亡。本发明提供一种诱导血液癌细胞凋亡的方法，其包括使细胞与治疗有效量的端粒酶抑制剂和治疗有效量的Bcl-2抑制剂接触。在一些实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在一些实施例中，Bcl-2抑制剂是ABT-199。在一些实施例中，血液癌症是AML。

在某些情况下，该组合相对于单独的任一组分提供增强的抑制作用；在一些情况下，该组合相对于组分的组合或累加效应提供超累加或协同效应。

在一些实施例中，该方法是在血液癌细胞中诱导细胞凋亡的方法。主题方法可包括使细胞与治疗有效量的端粒酶抑制剂接触，并使细胞与治疗有效量的Bcl-2抑制剂接触。在某些实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在一些实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他钠。在一些实施例中，Bcl-2抑制剂是ABT-199。细胞与端粒酶抑制剂的接触可在细胞与Bcl-2抑制剂接触之前，期间和/或之后进行。细胞与端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的接触可以同时或依次进行。

在一个实施例中，端粒酶抑制剂是具有端粒酶抑制活性的寡核苷酸，特别是WO2005/023994和/或WO 2014/088785中定义的寡核苷酸，两者均通过引用并入本文。

通常，可以使用端粒酶抑制剂和Bel-2抑制剂的各种组合，顺序或同时使用。对于多剂量，例如，两种药剂可以直接交替，或者一种药剂的两种或更多种剂量可以与单剂量的另一种药剂交替。两种药剂的同时施用也可以交替或以其他方式散布在各药剂的剂量中。在一些情况下，在开始治疗后，剂量之间的时间可以是约1-6小时、约6-12小时、约12-24小时、约1-2天、约1-2周或更长时间。在治疗过程中，可以重新评估完成计划给药的需要。

术语“细胞凋亡”是指程序性细胞死亡的过程，伴随细胞形态变化和细胞活力的丧失。在一个实施例中，诱导细胞凋亡的方法提供了一种治疗脊椎动物生物体中的肿瘤性障碍的方法。

在该方法的上下文中，术语“诱导”意指直接或间接的因果关系。因此，特定病症的存在和/或维持引起或导致诱导结果。

如本文所使用的，当提及诸如量、时间持续时间等的可测量值时，术语“约”意指包括指定值的±20％至±0.1％的变化，优选地±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，还更优选地±0.1％，因为这些变化适于实施所公开的方法。

如文中所使用的，“AML”是指急性髓性白血病。

A.治疗

如本文所用，并且如本领域所熟知的，“治疗”是用于获得有益或期望结果的方法，包括临床结果。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种症状，减轻疾病程度，稳定(即，不恶化)疾病状态，防止疾病扩散，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或缓解，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还意味着与不接受治疗所预期的存活相比延长存活。

本公开提供了治疗(用于血液癌症，例如急性髓性白血病)，其包括将端粒酶抑制剂伊美司他钠的施用与Bcl-2抑制剂ABT-199的施用相结合。与使用任一种药物观察到的相比，本发明的治疗方法可以更有效并且对AML患者的治疗产生更大的反应。在一个实施例中，治疗方法包括将端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂组合施用给需要治疗血液癌症的受试者。在另一个实施例中，血液癌症是AML。在另一个实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在某些实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他钠。在另一个实施例中，Bcl-2抑制剂是ABT-199。

在一些实施例中，施用于受试者的端粒酶抑制剂的剂量是当单独使用其端粒酶抑制剂时足以治疗该疾病的量。在某些实施例中，当单独使用端粒酶抑制剂时，施用于受试者的端粒酶抑制剂的剂量小于足以治疗该疾病的量。在一个实施例中，当与ABT-199组合用于治疗已被诊断患有AML的受试者时，端粒酶抑制剂的剂量降低。在一些实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在一些实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他钠。在一些实施例中，施用于受试者的Bcl-2抑制剂的剂量是当单独使用Bcl-2抑制剂时足以治疗疾病的量。在某些实施例中，当单独使用Bcl-2抑制剂时，施用于受试者的Bcl-2抑制剂的剂量小于足以治疗该疾病的量。在一些实施例中，Bcl-2抑制剂是ABT-199。在另一个实施例中，当与伊美司他组合用于治疗已被诊断患有AML的受试者时，Bcl-2抑制剂的剂量降低。在又另一个实施例中，当组合用于治疗已被诊断患有AML的受试者时，其伊美司他和ABT-199的剂量均降低。

在另一个实施例中，当与Bcl-2抑制剂组合用于治疗患有血液癌症的受试者时，用端粒酶抑制剂治疗的长度减少。在另一个实施例中，当与ABT-199组合用于治疗患有血液癌症的受试者时，用伊美司他治疗的长度减少。在另一个实施例中，当与伊美司他组合用于治疗已被诊断患有血液癌症的受试者时，用ABT-199治疗的长度减少。在另一个实施例中，当组合用于治疗已被诊断患有血液癌症的受试者时，用伊美司他和ABT-199治疗的长度减少。在一些实施例中，血液癌症是AML。

本文所述的药物组合可以作为含有两种药物的组合物或单独施用给受试者。本文所述的药物组合可以在组合药物组合物中施用，例如通过静脉内施用，或单独施用。

B.血液癌症

本发明的方法可用于治疗任何方便的血液恶性肿瘤。血液恶性肿瘤是从血液形成组织细胞(如骨髓)或免疫***细胞开始的癌症形式。血液癌症的实例是急性和慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓发育不良综合征。在一些情况下，血液肿瘤被称为血液癌症。骨髓增生性肿瘤(MPN)是由骨髓中的肿瘤性造血骨髓祖细胞产生的血液肿瘤，例如红细胞、血小板和粒细胞的前体细胞。肿瘤祖细胞的增殖导致白细胞、红细胞和/或血小板的任何组合的过量产生，这取决于疾病。这些过量产生的细胞也可能是异常的，导致额外的临床并发症。存在各种类型的慢性骨髓增生性疾病。包括在骨髓增生性肿瘤中的是特发性血小板增多症、真性红细胞增多症、慢性髓性白血病、骨髓纤维化、慢性中性白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病和急性髓性白血病。骨髓发育不良综合征(MDS)是一组症状，包括血液癌和骨髓癌。MDS包括但不限于难治性贫血、过量胚细胞伴难治性贫血，多多系发育不良伴难治性血细胞减少症和慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)。

感兴趣的血液癌症包括但不限于AML、特发性血小板增多症、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化、***性肥大细胞增多症、慢性髓细胞样白血病、慢性中性粒细胞性白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、环状铁粒幼红细胞伴难治性贫血、多系发育不良伴难治性血细胞减少症、过量胚细胞伴难治性贫血，1型、过量胚细胞伴难治性贫血，2型、孤立性缺失(5q)伴骨髓发育不良综合征(MDS)、MDS未分型、慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)、非典型慢性髓细胞样白血病、幼年型髓单核细胞白血病、骨髓增生性/脊髓发育不良综合征-未分型、B淋巴细胞白血病/淋巴瘤、T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤/沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、移植后淋巴组织增生性疾病、HIV相关淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性皮肤B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、意义未知的单克隆丙种球蛋白病、郁积型多发性骨髓瘤、和孤立性浆细胞瘤(孤骨和髓外)。

本发明的某些治疗方案特别适用于治疗AML。在本发明的某些实施例中，施用治疗的受试者患有AML。在AML中，例如通过施用伊美司他和ABT-199组合，可以使用本文公开的方法治疗化疗难治性AML，例如阿糖胞苷与柔红霉素或伊达比星组合治疗难以治疗的AML。AML对治疗的响应在本领域中是已知的。AML响应评估的一个实例如表1所示。

表1.AML响应评估

本文所述的药物组合适用于治疗本文提及的任一种疾病或障碍，包括血液癌症(或其亚型)。药物可以同时或依次施用。

本文描述的药物组合适用于诱导血液癌细胞中的细胞凋亡。药物可以同时或依次施用。

还将清楚的是，本文所述的组合物适用于治疗本文提及的任一种疾病或障碍，包括血液癌症(或其亚型)。

C.受试者

受试者是需要治疗癌症的哺乳动物。通常，受试者是人类患者。在本发明的一些实施例中，受试者可以是非人哺乳动物，例如非人灵长类动物、动物模型(例如，用于筛选、表征和评估药物的小鼠和大鼠等动物)和其他哺乳动物。如本文所用，术语患者，受试者和个体可互换使用。

D.抗癌剂

以下部分描述了在本发明的各种实施例中使用的药物。由于这些药物是众所周知的，因此只提供简短的讨论。本部分中引用的出版物旨在说明药物的各个方面，以使从业者受益；然而，在本部分或本公开中其他地方引用特定出版物并非旨在在任何方面限制本发明，包括剂量、组合和适应症。

1.端粒酶抑制剂

端粒酶抑制剂的实例包括但不限于伊美司他，特别是伊美司他钠。在一些情况下，可以将一种或多种端粒酶抑制剂(例如，两种或三种端粒酶抑制剂)施用给哺乳动物以治疗血液恶性肿瘤。

伊美司他钠是伊美司他的钠盐，其是合成的脂质缀合的13-mer寡核苷酸N3'→P5'-硫代-氨基磷酸酯。伊美司他钠的化学名称为：DNA，d(3'-氨基-3'-脱氧-P-硫代)(T-A-G-G-G-T-T-A-G-A-C-A-A)，5'-[O-[2-羟基-3-(十六酰氨基)丙基]硫代磷酸酯]，钠盐(1:13)(SEQ ID NO：1)。伊美司他和伊美司他钠可以如其他地方所述制备、配制或获得(Asai等人,Cancer Res.,63(14):3931-3939(2003),Herbert等人,Oncogene,24:5262-5268(2005)，以及Gryaznov,Chem.Biodivers.,7:477-493(2010))。

伊美司他和伊美司他钠靶向端粒酶的RNA模板，并且已显示在小鼠的各种癌细胞系和肿瘤异种移植物中抑制端粒酶活性和细胞增殖。涉及乳腺癌，非小细胞肺癌和其他实体瘤，多发性骨髓瘤或慢性淋巴细胞白血病患者的1期研究提供了关于药物药代动力学和药效学的信息，并帮助建立了每公斤体重9.4毫克(以2小时静脉内输注)。随后的涉及特发性血小板增多症患者的2期研究显示血小板降低活性，伴随有JAK2V617F和CALR突变等位基因负荷的显著降低。伊美司他钠通常静脉内施用；预期在本发明的实践中也可以使用其他施用途径，例如鞘内施用、肿瘤内注射、口服施用等。伊美司他钠可以以与临床常规使用的剂量相当的剂量施用。在优选的实施例中，伊美司他钠施用如本文其他地方所述。

特定实施例根据任一个其他实施例所述，其中伊美司他限于伊美司他钠。

2.Bcl-2抑制剂ABT-199

ABT-199(venetoclax)代表一流的、选择性的、口服的保留血小板的BCL-2抑制剂(图1B)。其显示对BCL-2的亚纳摩尔亲和力(Ki<0.010nM)，在体外对非霍奇金淋巴瘤(NHL)和CLL具有抗肿瘤活性。体内小鼠异种移植研究显示出对侵袭性(Myc+)淋巴瘤以及急性白血病的活性。在R/R NHL中进行ABT-199的Ia期试验，每天连续给药200-900mg。在第7天施用单剂量，然后为在2-3周内逐步向上滴定的导入期。单剂ABT-199也在高风险R/R AML患者和不适合强化化疗的未治疗患者的2期开放标签多中心试验中进行了研究。当患者在第1周(Wk)第1天接受20mg ABT-199时，该研究允许患者内剂量递增。实施每日递增以在第6天和之后每天以800mg的最终剂量为目标。在第一次预定评估(第4周结束)时没有完全响应(CR)或血液恢复不完全的CR(CRi)的那些患者能够递增至1200mg。与利妥昔单抗组合的ABT-199的推荐的2期剂量为每日400mg。

E.药物组合物

本发明还涉及包含端粒酶抑制剂(例如，伊美司他，特别是伊美司他钠)和Bel-2抑制剂(例如ABT-199)的药物组合物。在一个实施例中，药物组合物包含伊美司他，特别是伊美司他钠和ABT-199。在一个实施例中，药物组合物包含伊美司他，特别是伊美司他钠和ABT-199。本文所述的药物组合可以作为含有两种药物的组合物施用于受试者。

在与组合物的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体或稀释剂必须是“可接受的”。

为了便于施用，可出于施用目的将本文所述药物组合配制成各种药物形式。可出于施用目的将本文所述药物组合配制成各种药物形式。对于合适的组合物，可以列举通常用于全身施用药物的所有组合物。

为了制备本发明的药物组合物，将有效量的本文所述药物组合与药学上可接受的载体紧密混合，该载体可以采取多种形式，这取决于施用所需的制剂形式。这些药物组合物是合适的单位剂型，特别是口服、直肠、经皮、肠胃外注射或吸入施用。在某些情况下，可以通过静脉内注射施用。例如，在制备口服剂型的组合物时，在口服液体制剂如悬浮液、糖浆、酏剂、乳液和溶液的情况下；在固体载体如淀粉、糖、高岭土、稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等的情况下，在粉末、丸剂、胶囊和片剂的情况下，可以使用任何常用的药物介质，比如，例如水、二醇、油、醇等。由于他们易于施用，因此片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下显然使用固体药物载体。对于肠胃外组合物，载体通常包含无菌水，至少在很大程度上，尽管可以包括其他成分，例如，以帮助溶解。例如，可以制备可注射溶液，其中载体包括盐溶液、葡萄糖溶液或盐水和葡萄糖溶液的混合物。例如，可以制备可注射溶液，其中载体包括盐溶液、葡萄糖溶液或盐水和葡萄糖溶液的混合物。含有本文所述药物组合的可注射溶液可以配制在油中以延长作用。用于此目的的合适的油是例如花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油、大豆油、长链脂肪酸的合成甘油酯以及这些油和其他油的混合物。还可以制备可注射的悬浮液，在这种情况下可以使用适当的液体载体、悬浮剂等。还包括固体形式的制剂，其意图在使用前不久转化为液体形式的制剂。在适于经皮施用的组合物中，载体任选地包含渗透增强剂和/或合适的润湿剂，任选地与较小比例的任何性质的合适添加剂组合，该添加剂不会对皮肤产生显著的有害作用。该添加剂可以促进对皮肤的施用和/或可以有助于制备所需的组合物。这些组合物可以以各种方式施用，例如作为透皮贴剂、作为点涂剂、作为软膏剂。

将上述药物组合物配制成单位剂型以便于施用和剂量均匀是特别有利的。本文所用的单位剂型是指适合作为单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性成分。这种单位剂型的实例是片剂(包括刻痕或包衣片剂)、胶囊、丸剂、粉末包、糯米纸囊剂、栓剂、可注射溶液或悬浮液等，以及他们的隔离复合物。

为了增强药物组合物中本文所述组合中药物的溶解度和/或稳定性，使用α-，β-或γ-环糊精或其衍生物，特别是羟烷基取代的环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精可能是有利的。此外，共溶剂如醇可以改善本发明化合物在药物组合物中的溶解度和/或稳定性。

根据施用方式，药物组合物优选地包含0.05至99重量％，更优选地0.1至70重量％，甚至更优选地0.1至50重量％的本文所述的药物组合，以及1至99.95重量％，更优选地30至99.9重量％，甚至更优选地50至99.9重量％的药物可接受的载体，所有百分比均基于组合物的总重量。

施用频率可以是降低血液恶性肿瘤症状的严重程度(例如，减少或逆转骨髓纤维化)而不会对哺乳动物产生显著毒性的任何频率。例如，施用频率可以是每两个月约一次到每周约一次，或者每月约一次到每月约两次，或者每六周约一次到每月约两次。施用频率可以保持恒定，或者在治疗期间可以变化。用含有一种或多种端粒酶抑制剂的组合物的治疗疗程可包括休息期。例如，含有端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合物可以在三周时间内每周施用，然后是两周的休息期，并且这种方案可以重复多次。与有效量一样，各种因素可影响用于特定应用的实际施用频率。例如，有效量、治疗持续时间、多种治疗剂的使用、施用途径和血液恶性肿瘤的严重程度可能需要增加或减少施用频率。

施用含有端粒酶抑制剂(例如，伊美司他或伊美司他钠)和Bcl-2抑制剂(例如，ABT-199)的组合物的有效持续时间可以是降低血液恶性肿瘤症状严重程度(例如，减少或逆转骨髓纤维化)而不会对哺乳动物产生显著毒性的任何持续时间。因此，有效持续时间可以从一个月到几个月或几年(例如，一个月到两年，一个月到一年，三个月到两年，三个月到十个月，或三个月到18个月)。通常，治疗血液恶性肿瘤的有效持续时间可以为两个月至二十个月。在某些情况下，有效持续时间可以长达个体哺乳动物存活。多种因素可以影响用于特定治疗的实际有效持续时间。例如，有效持续时间可随施用频率、有效量、多种治疗剂的使用，施用途径和血液恶性肿瘤的严重程度而变化。

在某些情况下，可以监测治疗过程和与血液恶性肿瘤相关的一种或多种症状的严重程度。可以使用任何方法来确定血液恶性肿瘤的症状的严重程度是否降低。例如，可以使用活组织检查技术评估血液恶性肿瘤(例如，骨髓纤维化)的症状的严重程度。

术语“药学上可接受的盐”是指对患者(例如哺乳动物)施用可接受的盐(具有对于给定给药方案具有可接受的哺乳动物安全性的抗衡离子的盐)。这些盐可以衍生自药学上可接受的无机或有机碱和药学上可接受的无机或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，该盐衍生自本领域公知的各种有机和无机抗衡离子，并且仅举例来说，包括钠等；当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，如盐酸盐等。感兴趣的药学上可接受的盐包括但不限于铝、铵、精氨酸、钡、苄星、钙、胆盐、乙二胺、赖氨酸、锂、镁、葡甲胺、普鲁卡因、钾、钠、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、乙醇胺、哌嗪、锌、二异丙胺、二异丙基乙胺、三乙胺和三乙醇胺盐。

术语“其盐”是指当酸的质子被阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)代替时形成的化合物。优选地，该盐是药学上可接受的盐。举例来说，本发明化合物的盐包括其中化合物被无机或有机酸质子化形成阳离子的盐，其中无机或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子组分。感兴趣的盐包括，但不限于，铝、铵、精氨酸、钡、苄星、钙、铯、胆盐、乙二胺、锂、镁、葡甲胺、普鲁卡因、N-甲基葡糖胺、哌嗪、钾、钠、氨丁三醇、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、乙醇胺、哌嗪、二异丙胺、二异丙基乙胺、三乙胺和三乙醇胺盐。应理解，对于包括核苷间键的骨架的本文所述的任一寡核苷酸结构，这种寡核苷酸也可包括任何方便的盐形式。在一些实施例中，为简单起见，描绘了核苷间键的酸性形式。在某些情况下，主题化合物的盐是单价阳离子盐。在某些情况下，主题化合物的盐是二价阳离子盐。在某些情况下，主题化合物的盐是三价阳离子盐。“溶剂化物”是指通过溶剂分子与溶质的分子或离子的组合形成的复合物。溶剂可以是有机化合物、无机化合物或两者的混合物。溶剂的一些实例包括但不限于甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜和水。当溶剂是水时，形成的溶剂化物是水合物。

“立体异构体(Stereoisomer)”和“立体异构体(stereoisomers)”是指具有相同原子连接性但在空间中具有不同原子排列的化合物。立体异构体包括例如顺式-反式异构体、E和Z异构体、对映异构体和非对映异构体。对于本文公开的含有一个或多个取代基的任一基团，当然应理解，这些基团不含任何在空间上不实用和/或在合成上不可行的取代或取代模式。所有立体异构体都包括在本公开的范围内。

本领域普通技术人员将认识到，本文所述基团的其他互变异构排列是可能的。应当理解，主题化合物的所有互变异构形式都包括在其中描述了化合物基团的一种可能的互变异构排列的结构中，即使没有具体指出。

希望包括主题化合物的立体异构体的互变异构体的药学上可接受的盐的溶剂化物。这些旨在包括在本公开的范围内。

F.施用和施用方案

对于血液癌症的治疗，端粒酶抑制剂(例如，伊美司他或伊美司他钠)和Bcl-2抑制剂(例如，ABT-199、ABT-263和ABT-737)可以组合施用于需要治疗的受试者。可以通过该方法治疗的癌症的实例是急性髓性白血病(AML)，也称为急性髓细胞白血病、急性髓性白血病、急性粒细胞白血病或急性非淋巴细胞白血病。在急性白血病中，白血病细胞是未成熟的血细胞(称为胚细胞)，其快速生长并快速***。如果不进行治疗，大多数急性白血病患者只能活几个月。

用于本发明的端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂可以以任何治疗上有效的剂量施用，例如与临床常规使用的剂量相当的剂量。已知和批准的抗癌剂的具体给药方案(例如，推荐的有效剂量)是医生已知的，并且例如在PHYSICIANS'DESK REFERENCE,2003,第57版,Medical Economics Company,Inc.,Oradell,N.J.；Goodman&Gilman's THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS"2001,第10版,McGraw-Hill,New York中的产品说明书中给出；和/或可从联邦药物管理局获得和/或在医学文献中讨论。

在一些方面中，施用于受试者的端粒酶抑制剂伊美司他钠的剂量为约1.0mg/kg至约13.0mg/kg。在其他方面中，端粒酶抑制剂的剂量为约6.5mg/kg至约11.7mg/kg。在一些实施例中，端粒酶抑制剂的剂量包括至少约6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、10.1mg/kg、10.2mg/kg、10.3mg/kg、10.4mg/kg、10.5mg/kg、10.6mg/kg、10.7mg/kg、10.8mg/kg、10.9mg/kg、11mg/kg、11.1mg/kg、11.2mg/kg、11.3mg/kg、11.4mg/kg、11.5mg/kg、11.6mg/kg、11.7mg/kg、11.8mg/kg、11.9mg/kg、12mg/kg、12.1mg/kg、12.2mg/kg、12.3mg/kg、12.4mg/kg、12.5mg/kg、12.6mg/kg、12.7mg/kg、12.8mg/kg、12.9mg/kg、或13mg/kg。

在一些实施例中，施用于个体的端粒酶抑制剂的有效量包括至少约1mg/kg、2.5mg/kg、3.5mg/kg、5mg/kg、6.5mg/kg、7.5mg/kg、9.4mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg中任一个。在各种实施例中，施用于个体的端粒酶抑制剂的有效量包括小于约350mg/kg、300mg/kg、250mg/kg、200mg/kg、150mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、30mg/kg、25mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、7.5mg/kg、6.5mg/kg、5mg/kg、3.5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg端粒酶抑制剂中任一个。

药物组合物(例如，包含端粒酶抑制剂的药物组合物和/或包含Bcl-2抑制剂的药物组合物)的示例性给药频率包括但不限于每天；每隔一天；每周两次；每周三次；每周不休息；每周，四周中有三周；每三周一次；每两周一次；每周，三周中有两周。在一些实施例中，药物组合物施用约每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每6周一次、或每8周一次。在一些实施例中，组合物施用至少约每周1x、2x、3x、4x、5x、6x或7x(即每天)、或每天3次、每天2次中任一个。在一些实施例中，每次施用之间的间隔小于约6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天中任一个。在一些实施例中，每次施用之间的间隔大于约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月或12个月中任一个。在一些实施例中，给药方案没有中断。在一些实施例中，每次施用之间的间隔不超过约一周。

可以使用任何合适的方法施用端粒酶抑制剂如伊美司他或伊美司他钠。例如，端粒酶抑制剂如伊美司他或伊美司他钠可以在一段时间内(例如，一、二、三、四或五小时)每4周静脉内施用一次。在一个实施例中，伊美司他在约2小时内以7-10mg/kg每周静脉内施用一次。在另一个实施例中，伊美司他在约2小时内以2.5-7mg/kg每3周静脉内施用一次。在又另一个实施例中，伊美司他在约2小时内以0.5-5mg/kg每4周静脉内施用一次。在另一个实施例中，伊美司他在约2小时内以约2.5-10mg/kg每3周静脉内施用一次。在又另一个实施例中，伊美司他在约2小时内以约0.5-9.4mg/kg每4周静脉内施用一次。

在这种情况下，当用Bel-2抑制剂ABT-199治疗时，ABT-199的剂量可以是约或低于400mg PO qDay。例如，被鉴定为患有血液恶性肿瘤的人可用ABT-199治疗，剂量为a)20mgPO qday，b)50mg PO qDay，c)100mg PO qDay，d)200mg PO qDay或e)400mg PO qDay。在另一个实施例中，ABT-199根据每周一次的斜线上升方案施用，持续5周，达到推荐的日剂量400mg，起始于第1周的20mg PO qDay，第2周的50mg PO qDay，第3周的100mg PO qDay，第4周的200mg PO qDay和第5周及以后的400mg PO qDay。在另一个实施例中，ABT-199以400mgPO qDay施用。在另一个实施例中，继续给药直至疾病进展或不可接受的毒性。

应当理解，癌症治疗有时涉及药物施用的多个“轮次”或“周期”，其中每个周期包括根据指定的时间表(例如，每三周一次，连续三天；每周一次；等)施用药物一次或多次。例如，抗癌药物可以施用1至8个周期，或更长时间。当向受试者施用多于一种药物(例如，两种药物)时，每种药物可以根据其自己的时间表施用(例如，每周一次；每三周一次；等)。很明显，药物的施用，甚至是那些以不同周期施用的药物，可以协调，以便两种药物在同一天至少在一段时间施用或者，替代地，以便药物连续几天至少在一段时间施用。

在其中组合施用端粒酶抑制剂(例如，伊美司他或伊美司他钠)和Bcl-2抑制剂(例如ABT-199或Veneteclax)的治疗方案中，他们可以以任何顺序施用。在某些实施例中，端粒酶抑制剂在施用Bcl-2抑制剂的前一天，后一天或同一天施用。应当理解，可以使用由医生确定的其他时间表。

如本领域所理解的，如果观察到毒性，或者为了患者的方便，可以暂时中止用癌症治疗药物治疗，而不脱离本发明的范围，然后重新开始。

G.组合施用

当药物作为相同疗程的一部分施用时，将两种或三种药物“组合”施用于受试者。疗程是指由医学专业人员认为可以相加地，互补性，协同地或以其他方式一起工作以产生比施用单一药物所预期结果更有利的结果的药物组合施用。疗程可持续一天或几天，但更常见的是持续数周。

因此，组合施用的实例是每28天施用伊美司他一次，持续1至4个周期，从第1天开始，并且在第1天开始，每7天施用ABT-199一次，持续4个周期。在一个实施例中，ABT-199的施用在周期内的第1天，第-1天或第2天或另一天开始。在一个实施例中，组合施用是每28天施用伊美司他一次，持续1至4个周期，从第1天开始，并且在第1天开始，每天施用ABT-199一次，持续28天，持续1至4个周期。

当组合施用两种药物时，可以使用各种方案。在一种情况下，例如但不限于，在药物2施用之前，首先施用药物1，并且在药物2施用的整个过程中继续用药物1治疗；或者，药物1在药物2治疗开始或完成后施用；替代地，药物1首先在其他癌症疗法开始同时施用。如上下文中所使用的，“同时地”是指两种药物在同一天或连续几天施用。

尽管原则上某些药物可以共同配制，但通常他们以单独的组合物施用。类似地，尽管可以同时施用某些药物，但是更频繁地(特别是对于通过输注施用的药物)，药物在同一天，连续几天或根据另一个时间表在不同时间施用。

本发明还涉及包含端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合。特别地，端粒酶抑制剂是伊美司他，Bcl-2抑制剂是ABT-199。特别地，端粒酶抑制剂是伊美司他钠，Bcl-2抑制剂是ABT-199。

本发明还涉及包含端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合，其用作药物。特别地，端粒酶抑制剂是伊美司他，Bcl-2抑制剂是ABT-199。特别地，端粒酶抑制剂是伊美司他钠，Bcl-2抑制剂是ABT-199。

H.诊断

为了诊断AML，使用May-Griinwald-Giemsa或Wright-Giemsa染色对血液和骨髓涂片在形态学上进行检查。建议对血液涂片上至少200个白细胞和骨髓涂片上500个有核细胞进行计数，后者含有骨针。为了诊断AML，除了具有t(15；17)，t(8；21)，inv(16)或t(16；16)的AML以及一些红白血病病例外，需要20％或更多的骨髓或血液计数。成胚细胞、成单核细胞和成巨核细胞包括在胚细胞计数中。在具有单核细胞或骨髓单核细胞分化的AML中，成单核细胞和前单核细胞，但不是异常的单核细胞，被计为胚细胞等价物。除少数纯红白血病外，成红细胞不计为胚细胞。

I.试剂盒

本发明还涉及包含端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的试剂盒。还提供了包含端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的试剂盒，其用于治疗血液癌症。在一些情况下，这种治疗包括在施用端粒酶抑制剂之前，之后或同时向受试者施用Bcl-2抑制剂。在某些情况下，端粒酶抑制剂是伊美司他。

在一个相关方面中，本发明提供了一种试剂盒，其含有一定量的端粒酶抑制剂，其量可有效抑制受试者中癌细胞的增殖。在一些情况下，试剂盒包括***物，其具有施用端粒酶抑制剂的说明书。***物可以为使用者提供一组说明书，用于将抑制剂与Bcl-2抑制剂组合使用。在某些情况下，Bcl-2抑制剂是ABT-199。

在一些情况下，组合疗法的一组说明书可推荐(i)当与Bcl-2抑制剂组合使用时，较低剂量的端粒酶抑制剂，(ii)当与端粒酶抑制剂组合使用时，较低剂量的Bcl-2抑制剂，和/或(iii)不同于通常推荐的剂量方案的一种或两种抑制剂的给药方案。

显然，在上述段落中，在某些情况下，端粒酶抑制剂是伊美司他；在某些情况下，端粒酶抑制剂是伊美司他钠；在某些情况下，Bcl-2抑制剂是ABT-199。

J.示例性实施例

本发明的一个示例性实施例是治疗方法，其包括将端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂组合施用给需要治疗血液癌症的受试者。在某些实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在替代实施例中，Bcl-2抑制剂ABT-199、ABT-263或ABT-737。在又另一个实施例中，Bcl-2抑制剂是ABT-199。在一个实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他，Bcl-2抑制剂是ABT-199。

血液癌症可以是AML、特发性血小板增多症、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化、***性肥大细胞增多症、慢性髓细胞样白血病、慢性中性粒细胞性白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、环状铁粒幼红细胞伴难治性贫血、多系发育不良伴难治性血细胞减少症、过量胚细胞伴难治性贫血，1型、过量胚细胞伴难治性贫血，2型、孤立性缺失(5q)伴骨髓发育不良综合征(MDS)、MDS未分型、慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)、非典型慢性髓细胞样白血病、幼年型髓单核细胞白血病、骨髓增生性/脊髓发育不良综合征-未分型、B淋巴细胞白血病/淋巴瘤、T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤/沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、移植后淋巴组织增生性疾病、HIV相关淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性皮肤B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、意义未知的单克隆丙种球蛋白病、郁积型多发性骨髓瘤、和孤立性浆细胞瘤(孤骨和髓外)。在一个实施例中，血液癌症是AML。

在某些实施例中，端粒酶抑制剂伊美司他施用1、2、3、4、5、6、7、8或多于8个给药周期，每个周期包括：a)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他，每四周一次，b)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他，每周一次，持续四周，c)静脉内施用约2.5-7mg/kg伊美司他，每三周一次，或d)静脉内施用约0.5-9.4mg/kg伊美司他，每四周一次。伊美司他可能是伊美司他钠。

在某些实施例中，ABT-199以以下剂量施用：a)每天约50-400mg ABT-199；b)在第1天约2mg ABT-199，每日升高，在第6天最终剂量约800mg，此后每日一次；c)在第1天约25mgABT-199，每日升高，在第5天最终剂量约400mg，此后每日一次。ABT-199的施用可以是端粒酶抑制剂施用的前一天，后一天或同一天。

本发明的另一个实施例是诱导血液癌细胞中的细胞凋亡的方法，其包括使细胞与治疗有效量的端粒酶抑制剂接触，并使细胞与治疗有效量的Bcl-2抑制剂接触。该方法可以在体外或体内进行。在一个实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在另一个实施例中，伊美司他是伊美司他钠。在该方法中，Bcl-2抑制剂是ABT-199。在某些实施例中，血液癌细胞可以是来自以下类型的癌症的细胞：急性髓性白血病(AML)；特发性血小板增多症；真性红细胞增多症；原发性骨髓纤维化；***性肥大细胞增多症；慢性髓细胞样白血病；慢性中性粒细胞性白血病；慢性嗜酸性粒细胞白血病；环状铁粒幼红细胞伴难治性贫血；多系发育不良伴难治性血细胞减少症；过量胚细胞伴难治性贫血；1型；过量胚细胞伴难治性贫血；2型；孤立性缺失(5q)伴骨髓发育不良综合征(MDS)；MDS未分型；慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)；非典型慢性髓细胞样白血病；幼年型髓单核细胞白血病；骨髓增生性/脊髓发育不良综合征-未分型；B淋巴细胞白血病/淋巴瘤；T淋巴细胞白血病/淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；原发性中枢神经***淋巴瘤；原发性纵隔B细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤/白血病；滤泡性淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤/沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症；套细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤；移植后淋巴组织增生性疾病；HIV相关淋巴瘤；原发性积液淋巴瘤；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；意义未知的单克隆丙种球蛋白病；郁积型多发性骨髓瘤；和孤立性浆细胞瘤(孤骨和髓外)。在一个实施例中，血液癌细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。

本发明还提供了用于组合疗法的试剂盒。因此，本发明的一个实施例是一种试剂盒，其包含：(a)一定剂量的端粒酶抑制剂，其量在施用时有效诱导血液癌细胞中的细胞凋亡；和(b)一定剂量的Bcl-2抑制剂，其量在施用时有效诱导血液癌细胞中的细胞凋亡。在该试剂盒的一个实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他，而Bcl-2抑制剂是ABT-199。

本发明的一个实施例是一种包含端粒酶抑制剂(例如伊美司他/伊美司他钠)和BCL-2抑制剂(例如ABT-199)的药物组合物，其用于治疗血液癌症。在一个实施例中，药物组合物包含伊美司他/伊美司他钠和ABT-199。

本发明的另一个实施例是用于治疗血液癌症的方法的端粒酶抑制剂，该方法包括将端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂组合施用给有此需要的受试者。本发明的又另一个实施例是用于治疗血液癌症的方法的Bcl-2抑制剂，该方法包括将Bcl-2抑制剂和端粒酶抑制剂组合施用给有此需要的受试者。本发明的另一个实施例是包含端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合，其用于治疗血液癌症的方法，该方法包括将该组合施用给有此需要的受试者。在这些实施例中，端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合诱导血液癌细胞的细胞凋亡。在这些实施例中，端粒酶抑制剂可以是伊美司他。在一个实施例中，伊美司他是伊美司他钠。同样在这些实施例中，Bcl-2抑制剂可以是ABT-199。伊美司他可以施用1、2、3、4、5、6、7、8或多于8个给药周期，每个周期包括：a)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他，每四周一次，b)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他，每周一次，大概持续四周，或c)静脉内施用约2.5-7mg/kg伊美司他，每三周一次，或d)静脉内施用约0.5-9.4mg/kg伊美司他，每四周一次。ABT-199可以以以下剂量施用：约a)每天50-400mg ABT-199；b)在第1天约2mg ABT-199，每日升高，在第6天最终剂量约800mg，此后每日一次；c)在第1天约25mg ABT-199，每日升高，在第5天最终剂量约400mg，此后每日一次。在某些实施例中，ABT-199的施用可以是端粒酶抑制剂施用的前一天，后一天或同一天。

在端粒酶抑制剂、Bcl-2抑制剂或组合的实施例中，血液癌症可以是急性髓性白血病(AML)；特发性血小板增多症；真性红细胞增多症；原发性骨髓纤维化；***性肥大细胞增多症；慢性髓细胞样白血病；慢性中性粒细胞性白血病；慢性嗜酸性粒细胞白血病；环状铁粒幼红细胞伴难治性贫血；多系发育不良伴难治性血细胞减少症；过量胚细胞伴难治性贫血；1型；过量胚细胞伴难治性贫血；2型；孤立性缺失(5q)伴骨髓发育不良综合征(MDS)；MDS未分型；慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)；非典型慢性髓细胞样白血病；幼年型髓单核细胞白血病；骨髓增生性/脊髓发育不良综合征-未分型；B淋巴细胞白血病/淋巴瘤；T淋巴细胞白血病/淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；原发性中枢神经***淋巴瘤；原发性纵隔B细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤/白血病；滤泡性淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤/沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症；套细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤；移植后淋巴组织增生性疾病；HIV相关淋巴瘤；原发性积液淋巴瘤；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；意义未知的单克隆丙种球蛋白病；郁积型多发性骨髓瘤；和孤立性浆细胞瘤(孤骨和髓外)。在一个实施例中，血液癌症是急性髓性白血病(AML)。

本发明的另一个实施例是在血液癌细胞中诱导细胞凋亡的体外方法，其包括：使细胞与治疗有效量的端粒酶抑制剂接触；使细胞与治疗有效量的Bcl-2抑制剂接触。在一个实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他。伊美司他可能是伊美司他钠。Bcl-2抑制剂可以是ABT-199。

在体外方法的某些实施例中，血液癌细胞是来自以下类型的癌症的细胞：急性髓性白血病(AML)；特发性血小板增多症；真性红细胞增多症；原发性骨髓纤维化；***性肥大细胞增多症；慢性髓细胞样白血病；慢性中性粒细胞性白血病；慢性嗜酸性粒细胞白血病；环状铁粒幼红细胞伴难治性贫血；多系发育不良伴难治性血细胞减少症；过量胚细胞伴难治性贫血；1型；过量胚细胞伴难治性贫血；2型；孤立性缺失(5q)伴骨髓发育不良综合征(MDS)；MDS未分型；慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)；非典型慢性髓细胞样白血病；幼年型髓单核细胞白血病；骨髓增生性/脊髓发育不良综合征-未分型；B淋巴细胞白血病/淋巴瘤；T淋巴细胞白血病/淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；原发性中枢神经***淋巴瘤；原发性纵隔B细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤/白血病；滤泡性淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤/沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症；套细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤；移植后淋巴组织增生性疾病；HIV相关淋巴瘤；原发性积液淋巴瘤；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；意义未知的单克隆丙种球蛋白病；郁积型多发性骨髓瘤；和孤立性浆细胞瘤(孤骨和髓外)。在体外方法的一个实施例中，血液癌细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。

本发明的又另一个实施例是包含端粒酶抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合。在一个实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他，Bcl-2抑制剂是ABT-199。在另一个实施例中，端粒酶抑制剂是伊美司他钠，Bcl-2抑制剂是ABT-199。该组合可以用作药物。

本发明的另一个实施例是伊美司他或伊美司他钠用于治疗经历BCL抑制疗法的患者的血液癌症的用途。另一个实施例是ABT-199用于治疗经历端粒酶抑制疗法的患者的血液癌症的用途。本发明的又另一个实施例是用于治疗急性髓性白血病(AML)的方法的伊美司他钠，该方法包括将伊美司他钠和ABT-199组合施用给有此需要的受试者。另一个实施例是用于治疗急性髓性白血病(AML)的方法的ABT-199，该方法包括将ABT-199和伊美司他钠组合施用给有此需要的受试者。另一个实施例是包含伊美司他钠和ABT-199的组合，其用于治疗急性髓性白血病(AML)的方法，该方法包括将该组合施用给有此需要的受试者。适用时，在这些实施例中，伊美司他钠可以施用1、2、3、4、5、6、7、8或多于8个给药周期，每个周期包括：a)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他钠，每四周一次，b)静脉内施用约7-10mg/kg伊美司他钠，每周一次，持续四周，或c)静脉内施用约2.5-7mg/kg伊美司他钠，每三周一次，或d)静脉内施用约0.5-9.4mg/kg伊美司他钠，每四周一次。此外，在这些实施例中，ABT-199可以以下列剂量施用：a)每天约50-400mg ABT-199；b)在第1天约2mg ABT-199，每日升高，在第6天最终剂量约800mg，此后每日一次；c)在第1天约25mg ABT-199，每日升高，在第5天最终剂量400mg，此后每日一次。在某些实施例中，ABT-199的施用可以是伊美司他钠施用的前一天，后一天或同一天。

本发明的又另一个实施例是在急性髓性白血病(AML)细胞中诱导细胞凋亡的体外方法，其包括：使细胞与治疗有效量的伊美司他钠接触；并使细胞与治疗有效量的ABT-199接触。

在所有上述实施例中，端粒酶抑制剂可以是伊美司他，Bcl-2抑制剂可以是ABT-199。更特别地，在所有上述实施例中，端粒酶抑制剂可以是伊美司他钠，Bcl-2抑制剂可以是ABT-199。

以下实施例进一步说明本发明，但不限于此。

实例

实例1：端粒酶抑制剂伊美司他钠与BCL-2抑制剂Venetoclax组合体外增强AML细胞系中的细胞凋亡

将AML肿瘤细胞KG-1(ATCC#CCL-246)和MOLM-13(DSMZ#ACC554)以每孔-20,000个细胞的密度接种在96孔聚苯乙烯U-底组织培养板上(Corning目录号353777)的补充有10％胎牛血清(ThermoFisher目录号16140-089)和1％青霉素/链霉素抗生素混合物(ThermoFisher目录号15140-122)的RPMI-1640(ThermoFisher目录号11875-085)中并在37℃培养箱中在加湿的5％CO2气氛下生长。用补充有10％胎牛血清和/或制备为DMSO中的1000x储液，在磷酸盐缓冲盐水中1：100稀释(PBS，载体；ThermoFisher目录号20012-027)的ABT-199(Selleckchem目录号S8048)的RPMI-1640中制备的伊美司他钠(Janssen Biotech,Inc.)立即处理细胞。在96小时实验中，在48小时时施加第二剂量的化合物而不添加新鲜培养基，因为ABT-199和伊美司他钠的体外半衰期小于48小时(Shammas等,Leukemia,22(7):1410-1418(2008))。测试0-50μM伊美司他钠，并且测试0-500nM ABT-199。以与伊美司他钠相同的浓度使用表2中所示的对照非互补和错配寡核苷酸(US 7,998,938)，以显示对伊美司他钠和ABT-199的组合具有特异性。

表2：hTR靶向序列

在48和96小时，用膜联蛋白V(内部细胞膜染色)加碘化丙啶(PI，DNA结合染料)流式细胞术测定试剂盒(BioLegend目录640914)测量细胞的健康、早期凋亡和凋亡群体。膜联蛋白V使用与绿色荧光FITC染料缀合的重组膜联蛋白V检测凋亡细胞中以及使用碘化丙啶(PI)检测死细胞中磷脂酰丝氨酸的外化。碘化丙锭用红色荧光染色坏死细胞。用两种探针处理后，早期凋亡细胞显示绿色荧光，凋亡(死)细胞显示红色和绿色荧光，活细胞显示很少或没有荧光。简而言之，根据制造商建议的方案，将细胞沉淀并用PBS洗涤2次，然后悬浮于含有1：2比例的抗膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭的膜联蛋白V结合缓冲液中。将细胞在4℃下在黑暗中染色30分钟，然后用PBS洗涤3次和悬浮在FACs染色缓冲液(BD目录554657)中，然后在BD FACs Canto流式细胞仪上进行询问，用于前向散射、侧向散射、FITC和PE通道。使用Cytobank软件分析细胞群并与未处理的(没有伊美司他钠或ABT-199)条件比较以确定活细胞(在任一通道中未染色；即双阴性群体)门控的边界。对于所有实验，流式细胞术数据的点图显示四个象限，活细胞百分比在左下象限中，早期凋亡细胞百分比(膜联蛋白V+/PI-)在左上象限中和凋亡(死)细胞百分比(双标记膜联蛋白V+/PI+)在右上象限中。使用最高单一制剂(HSA)和Bliss可加性模型(J Tang等人Frontiers in Pharmacology.2015；6(181))，使用凋亡细胞百分比(双标记)来计算组合效应。

使用HSA模型，将组合条件(“C”)的细胞毒性作用与每种单一药剂对照(“A”或“B”)对组合中各自剂量产生的作用进行比较：

HSA过量＝C-A(如果A>B)或C-B(如果A<B)

Bliss模型执行类似的比较，但是不是单一药剂的最高作用，而是从组合中减去等于每个单一药剂的总和减去其乘积的值：

Bliss过量＝C-[(A+B)-(A*B)]

这些模型能够在组合中证明叠加性或弱协同作用。

AML细胞系治疗的结果

用伊美司他钠和/或ABT-199治疗48小时后KG-1细胞的流式细胞术数据的点图显示在图1A中，图1B显示了各种伊美司他钠浓度下的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图。KG-1在48小时后对ABT-199表现出较小的敏感性(在100nM和500nM下分别为约9％和约14％)，对伊美司他钠的敏感性最小。然而，当50μM伊美司他钠的治疗与100nM或500nM ABT-199组合时，观察到对细胞死亡的更大作用(在100nM下为约27％，在500nM下为约50％)。表3和4显示了使用HSA或BLISS模型对治疗KG-1细胞48小时的组合效果的计算。负值在这些模型中并不表示对抗，只是缺乏相互作用。

表3.在KG-1细胞中使用ABT-199和伊美司他钠48小时的最高单一药剂过量

表4.在KG-1细胞中使用ABT-199和伊美司他钠48小时的BLISS过量

用伊美司他钠和/或ABT-199治疗96小时后KG-1细胞的流式细胞术数据的点图显示在图2A中，图2B显示了各种伊美司他钠浓度下的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图。KG-1在96小时后对ABT-199表现出较小的敏感性(在100nM和500nM下分别为约6％和约10％)，还观察到对伊美司他钠的一些敏感性(在10μM、20μM和50μM下分别为5％、9％和16％)。然而，当25或50μM伊美司他钠的治疗与20至500nM ABT-199组合时，在所有浓度下观察到对细胞死亡的更大作用。表5和6显示了使用HSA或BLISS模型对治疗KG-1细胞96小时的组合效果的计算。

表5.在KG-1细胞中使用ABT-199和伊美司他钠96小时的最高单一药剂过量

表6.在KG-1细胞中使用ABT-199和伊美司他钠48小时的BLISS过量

用错配或非互补寡核苷酸和ABT-199治疗48小时(图3A)或96小时(图4A)后KG-1细胞的流式细胞术数据的点图，显示了48小时(图3B)或96小时(图4B)的各种寡核苷酸浓度下的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图。最高单一药剂过量(表7和8)和Bliss过量(表9和10)模型证实使用寡核苷酸对照没有作用。负值在这些模型中并不表示对抗，只是缺乏相互作用。

表7.在KG-1细胞中使用非互补或错配对照48小时的HSA过量

表8.在KG-1细胞中使用非互补或错配对照96小时的HSA过量

表9.在KG-1细胞中使用非互补或错配对照48小时的BLISS过量

表10.在KG-1细胞中使用非互补或错配对照96小时的BLISS过量

用伊美司他钠和/或ABT-199治疗48小时后MOLM-13细胞的流式细胞术数据的点图显示在图5A中，图5B显示了各种伊美司他钠浓度下的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图。MOLM-13在48小时后表现出对ABT-199的一些敏感性(在100nM和500nM下分别为约19％和约30％)，对伊美司他钠的一些敏感性(在50μΜ下为21.5％)。然而，当25μM伊美司他钠与ABT-199组合时，观察到对细胞死亡的更大作用(在100nM和500nM下分别为约32％和约72％)。用50μM伊美司他钠和100nM(62％)和500nM(88％)ABT-199组合观察到对细胞死亡的最大作用。令人惊讶地是，与50μM伊美司他钠组合，观察到ABT-199在5nM和20nM的较低浓度下对细胞杀伤的作用。表11和12显示了使用HSA或BLISS模型对治疗MOLM-13细胞48小时的组合效果的计算。

表11.在MOLM-13细胞中使用ABT-199和伊美司他钠48小时的最高单一药剂过量

表12.在MOLM-13细胞中使用ABT-199和伊美司他钠48小时的BLISS过量

用伊美司他钠和/或ABT-199治疗96小时后MOLM-13细胞的流式细胞术数据的点图显示在图6A中，图6B显示了各种伊美司他钠浓度下的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图。MOLM-13在96小时后表现出对ABT-199的敏感性(在5、20、100和500nM下为>30％细胞死亡)，对伊美司他钠的敏感性(在10、25和50μΜ下为>30％)。在所有浓度的组合ABT-199加伊美司他钠治疗中，增强细胞杀伤作用。当与最高浓度的ABT-199(500nM)组合时，在最低浓度的伊美司他钠(10μM)下观察到大于90％的细胞死亡。组合时，在ABT-199 100nM和500nM浓度下，也观察到大于90％的细胞死亡。在最高浓度的伊美司他钠(50μM)下，在5、10、20、100和500nM的ABT-199浓度下观察到几乎完全的细胞死亡。表13和14显示了使用HSA或BLISS模型对治疗MOLM-13细胞96小时的组合效果的计算。

表13.在MOLM-13细胞中使用ABT-199和伊美司他钠96小时的最高单一药剂过量

表14.在MOLM-13细胞中使用ABT-199和伊美司他钠96小时的最高单一药剂过量

用错配或非互补寡核苷酸和ABT-199治疗48小时(图7A)或96小时(图8A)后显示了MOLM-13细胞的流式细胞术数据的点图。显示了48小时(图7B)或96小时(图8B)的各种寡核苷酸浓度下的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图。最高单一药剂过量(表15和17)和Bliss过量(表16和18)模型证实使用寡核苷酸对照没有作用。负值在这些模型中并不表示对抗，只是缺乏相互作用。

表15.在MOLM-13细胞中使用非互补或错配对照48小时的HSA过量

表16.在MOLM-13细胞中使用非互补或错配对照48小时的Bliss过量

表17.在MOLM-13细胞中使用非互补或错配对照96小时的HSA过量

表18.在MOLM-13细胞中使用非互补或错配对照96小时的Bliss过量

实例2：在治疗细胞中对伊美司他钠和ABT-199之间的相互作用机制的研究

在机制上，伊美司他钠主要通过抑制端粒酶复合物的活性位点起作用。这样，酶作用的端粒末端因此不会伸长。随着肿瘤细胞的快速和重复细胞***，随着时间的推移，他们变得易于进行性端粒缩短。随着端粒更新的过程被阻断，细胞逐渐接近危机并最终引发细胞凋亡(Bruedigam等人,Cell Stem Cell,15:775-790(2014))。

Bcl-2及其相关的家族成员在向肿瘤细胞递送抗细胞凋亡信号中起作用。Bcl-2通过抑制Bax起作用，Bax是信号传导释放导致正常程序性细胞死亡的凋亡因子的关键介质。在这些信号下，Bax移位至线粒体，触发细胞色素c和其他导致半胱天冬酶级联激活的细胞凋亡因子，并通过内在(即非受体介导的-TRAIL，T Fa等)途径导致细胞死亡。Bcl-2的存在对这些信号产生干扰，因为Bcl-2可以直接抑制Bax。没有Bax，细胞凋亡因子不会被释放，细胞从细胞凋亡信号中脱离出来。

这两种途径会聚，因为端粒酶的主要蛋白质组分hTERT也在与Bcl-2相交的内在细胞凋亡途径中起辅助作用。此外，已知Bcl-2还增加hTERT表达和随后的端粒酶活性，进一步减少肿瘤细胞中的细胞凋亡。已显示hTERT能够在其到达线粒体并触发细胞凋亡信号级联之前拦截Bax。此外，在线粒体内，hTERT可以增强Bcl-2对Bax的抑制作用。为了进一步阐明在治疗细胞中伊美司他钠和ABT-199之间相互作用的机制，通过使用RT-qPCR评估转录水平来测量hTERT表达，并且在基于PCR的TRAP测定中使用来自裂解细胞的蛋白质评估端粒酶活性。

hTERT转录水平

收集来自细胞实验的样品(和单一药剂对照)用于分子分析，以评估有助于潜在作用机制的组合效应。AML细胞在Falcon T25烧瓶(Corning目录353135)中以8百万个细胞批次在8mL培养基中生长，所述培养基给予50μM伊美司他钠，20nM ABT-199，50μM伊美司他钠加20nM ABT-199，或与没有药物，进行48和96小时，与先前实验类似，然后作为细胞沉淀收集用于裂解和核酸或蛋白质提取。通过首先用补充有2-巯基乙醇(Sigma目录号63689-100ML-F)的350μL RLT缓冲液(Qiagen目录号1030963)裂解细胞来纯化核酸。用AllPrepRNA/DNA微型试剂盒(Qiagen目录号80204)纯化RNA，并使用高容量cDNA试剂盒(ThermoFisher目录号4368814)逆转录成cDNA，并在用TaqMan PreAmp Master Mix(ThermoFisher目录号4384557B)分析之前进行预扩增。使用来自ThermoFisher的ViiA7实时PCR***，使用内部开发的Taq-Man RT-qPCR测定法分析产物以测量hTERT转录水平(TaqMan Universal PCR Master Mix-ThermoFisher目录号4304437；下文的引物和探针序列)：

hTERT全长正向：5'-TGTACTTTGTCAAGGTGGATGTGA-3'(SEQ ID NO：4)

hTERT全长反向：5'-GCTGGAGGTCTGTCAAGGTAGAG-3'(SEQ ID NO：5)

hTERT FAM探针：FAM 5'-CGCGTACGACACCAT-3'MGBNFQ(SEQ ID NO：6)

其中FAM是荧光报道分子，MGBNFQ是猝灭剂。

指示用伊美司他钠和/或ABT-199治疗48和96小时后hTERT表达的条形图显示于图9中。通过RT-qPCR测量的RNA表达水平显示为在暴露的同一时间未治疗对照的百分比。结果显示，在使用ABT-199治疗的hTERT的RNA水平KG-1细胞具有最小的减少(在任一时间点与对照相比为90-95％)，MOLM-13细胞在96小时给药后仅显示hTERT转录水平的轻微降低(与对照相比为约69％)。伊美司他钠治疗显示两种细胞系的RNA水平均有较大降低，较长的治疗时间表达较低(KG-1细胞在48小时为对照的72％，在96小时为对照组的47％；MOLM-13细胞在48小时为39％，在96小时通过测定法检测不到)。对于伊美司他钠和ABT-199组合，在KG-1中，与伊美司他钠单一药剂相比，hTERT表达没有变化。对于MOLM-13，在两个时间点，hTERT检测不到。

hTERT酶水平

通过1500K离心5分钟作为细胞沉淀收集来自前一部分的用于蛋白质分析的样品，进行裂解和蛋白质提取。通过利用组合来自两个主要来源的改良方法分析蛋白质裂解物(Hou等人(2001)43(3)519-524和Nature Protocols(2006)1(3)1583-1590)。通过添加80μL10mM Tris-EDTA，1％P-40，10％甘油，150mM NaCl，1mM MgCh，250μM脱氧胆酸钠，100μMAEBSF，5mM 2-巯基乙醇缓冲液并在冰上孵育30分钟来产生裂解物。将裂解物以最大速度和4℃离心15分钟以沉淀细胞碎片。使用BCA测定法(ThermoFisher目录23252)对来自澄清的裂解物的蛋白质进行定量，并使用来自ThermoFisher的ViiA7实时PCR***进行基于qPCRTRAP的测定法以确定相对端粒酶活性(Power SYBR Green PCR Master Mix-ThermoFisher#4367659)。在该测定中，将蛋白质裂解物在过量dNTP和SYBR绿色染料存在下暴露于模拟端粒序列的合成寡核苷酸。端粒酶的活性越大，合成引物的延伸越大，因此SYBR染料产生的核酸的染色和信号越大。将该信号与对照蛋白质裂解物的标准曲线进行比较，以确定样品之间的相对端粒酶活性。

正向引物：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'(SEQ ID NO：7)

反向引物：5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3'(SEQ ID NO：8)分子相互作用的结果

指示用伊美司他钠和/或ABT-199治疗48和96小时后端粒酶活性的条形图显示于图10中。在48小时时，当用作单一药剂时，ABT-199在KG-1和MOLM-13细胞中对端粒酶活性没有作用。在ABT-199治疗96小时时，端粒酶的活性在KG-1中降低至约80％，约70％指示ABT-199对端粒酶活性的作用很小。伊美司他钠在KG-1和MOLM-13细胞系中显示端粒酶活性的降低。在MOLM-13细胞中，在两个时间点，降低与对照相比是相当的(48小时为37％，96小时为44％)。然而，KG-1在用伊美司他钠治疗96小时时显示出端粒酶活性的更大降低(48小时为64％，96小时为16％)。通过组合治疗，KG-1显示出与伊美司他钠单一药剂的最小差异，而在MOLM-13中，通过PCR测定几乎检测不到端粒酶活性的降低。

实例3：阐明组合的协同作用

以实例1中描述的实验形式重复模型AML肿瘤细胞系MOLM-13的治疗，具有以下变化：在0-75μM的较高浓度下测试伊美司他钠、对照错配和对照非互补化合物(总共7个浓度)和测试20pM-1μM ABT-199(总共9个浓度)。如前所述，通过流式细胞术分析治疗过的细胞的膜联蛋白V和碘化丙锭染色。在细胞凋亡群体中门控的事件(膜联蛋白V+/碘化丙啶+)用于确定组合基质的协同作用评分。组合数据分析由Horizon Chalice^TM分析软件(HorizonDiscovery Group,Cambridge,UK)生成。利用MOLM-13和细胞系HL-60进行另外的体外实验，以评估在单次暴露于组合时伊美司他钠加ABT-199的协同作用(即在48小时时没有重新给药)。ABT-199剂量范围略微改变(500pM-100nM，总共5个浓度)，并在上述实验中与等效数据点进行比较，其中细胞在48小时时第二次给药。在该实验中没有使用错配和非互补对照。

为了统计学鉴定在经治疗的MOLM-13细胞中观察到的效果，使用Horizon的Chalice^TM分析软件的网络应用评估给药组合，其根据Chou和Talalay的方法总结来自等效分析固定比例给药的原始数据(Chou TC,Talalay P.,Adv Enzyme Regul 1984；22:27-55)。组合条件经历等效分析以产生组合指数并且图形地表示组合的行为，其中协同对低于等效线图并且拮抗对落在其上方(预期加合组合落在线上)。Horizon Chalice^TM分析仪软件还提供协同作用得分，其值大于1指示协同作用。

图11中显示了在各种伊美司他钠浓度下治疗48小时的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图。表19显示了MOLM-13细胞治疗48小时后在每种组合下过量加和(Loewe模型)的计算。大于零的值在表19的右上象限中，其中ABT-199的浓度大于或等于20nM并且伊美司他钠的浓度大于或等于25μM。Horizo n Chalice^TM分析仪软件还提供协同作用得分，其值大于1指示协同作用。对于用伊美司他钠治疗的细胞，48小时后，协同作用得分确定为5.12。相比之下，错配和非互补对照的得分分别为0.22和0.41(表20和21)。在各种伊美司他钠浓度下分别用错配和非互补对照治疗48小时的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图显示在图12A和图12B中。

表19.用伊美司他钠治疗48小时的过量加和(Loewe模型)的计算

表20.用错配对照治疗48小时的过量加和(Loewe模型)的计算

表21.用非互补对照治疗48小时的过量加和(Loewe模型)的计算

图13中显示了在各种伊美司他钠浓度下治疗96小时的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图。表22显示了MOLM-13细胞治疗96小时后在每种组合下过量加和(Loewe模型)的计算。大于零的值在表19的右上象限中。令人惊讶的是，即使最低浓度的ABT-199(0.04nM和0.2nM)分别在50μM和75μM伊美司他钠下也显示与伊美司他钠的协同作用，并且最低浓度的伊美司他钠(1μM和5μM)分别与500nM和100nM ABT-199也显示出协同作用。Horizon Chalice^TM分析仪软件还提供协同作用得分，其值大于1指示协同作用。对于用伊美司他钠治疗的细胞，96小时后，协同作用得分确定为11.33。相比之下，错配和非互补对照的得分分别为0.03和0.06(表23和24)。在各种伊美司他钠浓度下分别用错配和非互补对照治疗96小时的％凋亡细胞(双标记)对ABT-199浓度的图显示在图14A和图14B中。

表22.用伊美司他钠治疗96小时的过量加和(Loewe模型)的计算

表23.用错配对照治疗96小时的过量加和(Loewe模型)的计算

表24.用非互补对照治疗96小时的过量加和(Loewe模型)的计算

显示了在对MOLM-13(图17A)和AML细胞系HL-60(图17B)单剂量治疗96小时后的凋亡群体(双标记)。在该实验中使用较小剂量范围的ABT-199来评估伊美司他钠组合治疗的功效。表25显示了由Horizon Chalice^TM分析仪软件对每种MOLM-13组合计算的过量加和(Loewe模型)的计算，而表26显示了对HL-60的计算。虽然在两种品系中都具有协同作用，但在MOLM-13中观察到更大的协同作用，如在较低(5和10μM)的伊美司他钠浓度下得分较高以及对细胞凋亡的作用增强所证实。与伊美司他钠的组合显示出ABT-199浓度低至1-5nM剂量的前景。

表25.在MOLM-13中用伊美司他钠单次给药治疗96小时的过量加和(Loewe模型)的计算

表26.在HL-60中用伊美司他钠单次给药治疗96小时的过量加和(Loewe模型)的计算

为了比较，绘制在图13中并用于产生表22的数据用Horizon Chalice^TM分析仪软件仅在图17A和表25中使用的剂量下重新分析。如表27所示，去除ABT-199滴定曲线的上限水平，协同作用得分几乎减半(11.33至6.06)。该得分大约是96小时单剂量条件获得的两倍(6.06对3.24)(表25)，这表明通过连续暴露诱导ABT-199与伊美司他钠组合的更大协同作用。

表27.在MOLM-13中在48小时时重新加药的96小时治疗的过量加和(Loewe模型)的计算(从图13重新创建)

实例4：端粒酶抑制剂伊美司他钠与BCL-2抑制剂Venetoclax组合增强AML患者样品中的离体细胞凋亡

急性髓性白血病(AML)是一种侵袭性癌症，除化疗外具有有限的治疗选择，因此需要治疗剂来填补这种未满足的需求。hTERT(端粒酶的催化亚基)和BCL-2(调节因子)均在AML中过表达，分别与疾病严重程度和预后不良相关。伊美司他钠是一种一流的端粒酶竞争性抑制剂，在血液恶性肿瘤中具有临床活性。Venetoclax(ABT-199)是一种被批准用于CLL患者的BCL-2抑制剂，该患者缺失17p且先前至少接受过一次治疗，已在AML患者中显示出有希望的临床益处。该实例中的研究在体外研究了单独或组合的伊美司他钠或venetoclax对AML细胞的作用。

在Ficoll纯化后从AML患者全血获得的AML细胞系(参见实例1)和AML患者外周血单核细胞(“PBMC”)样品用单独或组合的伊美司他钠或venetoclax治疗，通过流式细胞术评估活细胞和凋亡细胞群。研究端粒酶活性，hTERT表达和线粒体功能障碍的作用机制。向AML患者PBMC给药伊美司他钠(0μM、25μM和50μM)、venetoclax(ABT-199)(0nM、20nM和100nM)或组合16小时或40小时。通过膜联蛋白V和碘化丙锭的流式细胞术染色测量细胞凋亡。未染色(即双阴性)细胞构成治疗后剩余的活细胞。

具体地，使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare目录号17-1440-03)纯化来自AML患者(n＝4)的全血以纯化PBMC。将Ficoll装入50mL SepMate离心管(StemCellTechnologies目录号85450)中，用1：1的补充2％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS；ThermoFisher目录号20012-027)和HyClone FBS(ThermoFisher目录号SH30070.02)预测患者血液，然后装载在Ficoll上方。离心血液以将PBMC与红细胞，粒细胞等分离，并用PBS+2％FBS洗涤剩余的PBMC两次。将细胞以每孔约300,000个细胞的密度接种在96孔聚苯乙烯U-底组织培养板(Corning目录号353777)的补充有上述10％HyClone FBS的RPMI-1640(ThermoFisher目录号#11875-085)中，在加湿的5％CO₂下在37℃培养箱中生长。离体PBMC没有使用抗生素。立即用补充有10％FBS和/或ABT-199(Selleckchem目录号S8048)的制备为DMSO中的1000x储液，在PBS(载体)中1：100稀释的RPMI-1640中制备的伊美司他钠(Janssen Biotech,Inc.)治疗细胞。测试0-50μM伊美司他钠，并测试0-100nM venetoclax(ABT-199)。

在治疗16和40小时后，用膜联蛋白V(内部细胞膜染色)加碘化丙啶(PI，DNA结合染料)流式细胞术测定试剂盒(BioLegend目录号640914)测量细胞的健康，早期凋亡和凋亡群体，如实例1中所述。另外，PBMC针对以下分化标志物进行染色：CD45(V500缀合；BD目录号560777)和CD34(Pacific Blue缀合；Biolegend目录号343512)。如上文实例1中所述，在膜联蛋白V/碘化丙啶评估之前首先对CD45阳性然后对CD34门控事件。对4名患者确定CD45⁺(白细胞)和CD45⁺/CD34⁺(白血病干细胞)群体的平均值和标准偏差。

离体治疗的结果

图15A至15D示出了离体暴露于伊美司他钠和/或venetoclax(ABT-199)的四个AML患者PBMC样品的平均响应。用各种浓度的venetoclax(ABT-199)和/或伊美司他钠治疗AML患者CD45⁺白细胞和CD45⁺/CD34⁺白血病干细胞16小时的治疗后活细胞％的图示于图15A(CD45⁺白细胞)和15B(CD45⁺/CD34⁺白血病干细胞)中。用各种浓度的venetoclax(ABT-199)和/或伊美司他钠治疗AML患者CD45⁺白细胞和CD45⁺/CD34⁺白血病干细胞40小时的治疗后活细胞％的图示于图15C(CD45⁺白细胞)和15D(CD45⁺/CD34⁺白血病干细胞)中。通常，来自AML患者的CD45⁺白细胞的存活率不受单独的伊美司他钠治疗的影响，并且仅在16小时和40小时暴露后受到作为单一药剂的venetoclax的中度影响。然而，当伊美司他钠与venetoclax组合使用时，观察到细胞活力降低。对于CD45⁺/CD34⁺白血病干细胞群观察到类似的结果；当伊美司他钠在两个时间点与venetoclax组合使用时，注意到在降低细胞活力方面的剂量依赖性活性，并且在40小时时最剧烈。

当将伊美司他钠与venetoclax组合时，在多种AML细胞系中观察到在诱导细胞凋亡方面的剂量依赖性协同活性(参见实例1)。例如，在MOLM-13细胞系中，单一药剂伊美司他钠和venetoclax在48小时后具有适度的细胞凋亡活性(分别为22％和30％)，但组合在48小时时达到88％并在96小时时接近100％。在4个AML患者样品中也观察到类似的增强的细胞凋亡活性。分子分析显示，与单独的任一药剂相比，将伊美司他钠与venetoclax组合使hTERT表达和端粒酶活性降低更强烈。该实例证明，在AML中使用伊美司他钠与venetoclax组合在体外细胞系和患者样品中对细胞凋亡的诱导具有协同作用。

实例5：端粒酶抑制剂伊美司他钠与BCL-2抑制剂Venetoclax组合在急性髓性白血病中增强体内存活

如实例4中所讨论的，急性髓性白血病(AML)是一种侵袭性癌症，除化疗外具有有限的治疗选择，因此需要治疗剂。在实例4中，证实了端粒酶抑制剂伊美司他钠与BCL-2抑制剂venetoclax组合在体外增强细胞凋亡。该实例中的研究在急性髓性白血病的体内模型中研究了单独或组合的伊美司他钠或venetoclax的效果。

方法

在MOLM-13AML播散性小鼠模型中进行体内研究以评估功效和存活。具体地，在研究的第0天，将MOLM-13AML肿瘤细胞植入小鼠中。小鼠接受31天治疗：(i)载体(MM+PEG400/Phosal50/ETOH)；(ii)伊美司他钠(30mg/kg)；(iii)venetoclax(ABT-199)(100mg/kg)；(iv)MM(错配寡核苷酸对照)(30mg/kg)和ABT-199(100mg/kg)；(v)伊美司他钠(30mg/kg)和ABT-199(100mg/kg)。作为时间的函数评估小鼠的存活百分比(肿瘤细胞植入后的天数)。该研究总共持续108天(停止治疗后77天)。

向50只雌性SCID-beige小鼠(6周龄，Jackson Laboratory)静脉内注射100万个MOLM-13细胞，并随机分成5组。在注射后第一天，用表28中列出的五种条件中的任一种治疗小鼠。

表28.用MOLM-13播散性AML模型接种的SCID-beige小鼠的治疗条件。

每天观察小鼠并且每周测量两次体重。追踪每组小鼠的存活。该研究在第108天终止，这是最后一次治疗后77天。评估每组的寿命增加(“ILS”)，并且％ILS对载体对照计算如下：

％ILS＝100x(T-C)/C

其中T是治疗组的中值存活率，C是对照组的中值存活率。

体内研究的结果

第108天的AML播散性模型MOLM-13的Kaplan-Meier存活图显示在图16中。特别地，图16显示了作为肿瘤细胞植入后天数的函数的小鼠存活百分比。表29显示了对各种治疗组计算的中值存活率和％寿命增加(“ILS”)。结果显示，伊美司他钠单一药剂治疗的小鼠的中值存活时间为26.5天，与载体相比，转化为20.4％ILS(p＝0.0009)。用venetoclax(ABT-199)单一药剂治疗导致中值存活时间为30天，ILS为36.3％(p≤0.0001)。与错配(MM)寡核苷酸对照组合，ABT-199给出了单独ABT-199的类似效果：中值存活时间为31天，ILS为40.9％(p≤0.0001)。伊美司他钠与ABT-199的组合产生最佳结果，中值存活时间为37天，68.1％ILS的显著效力(p≤0.0001)。此外，来自该组合治疗组的四只小鼠(40％)存活时间久并存活超过108天，表现出增强的存活益处。

表29：用伊美司他钠和/或venetoclax(ABT-199)或MM(错配寡核苷酸对照)治疗的MOLM-13植入小鼠的中值存活时间和寿命增加百分比(％ILS；与对照相比)。

组	中值存活时间(天数)	％ILS	p
				载体：MM	22	---	---
伊美司他钠	26.5	20.4	0.0009
				ABT-199	30	36.3	0.0001
MM+ABT-199	31	40.9	0.0001
				伊美司他钠+ABT-199	37	68.1	0.0001

所有小鼠都耐受伊美司他钠与venetoclax组合，并且与单独的伊美司他钠(39.6％，p＝0.0011)或venetoclax(23.3％，p＝0.0001)相比，观察到寿命延长。在组合组中，40％的治疗小鼠在停止治疗后存活77天，证明具有潜在治愈的显著存活益处。该实例以及实例4中的结果表明，在AML中伊美司他钠与venetoclax的组合在体外细胞系和患者样品中对细胞凋亡的诱导具有协同作用，这在异种移植模型中转化为延长的存活率和潜在的治愈。

等同物和通过引用并入

尽管已经参考本发明的具体实施例描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等效物。另外，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行许多修改以适应特定情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤，以实现本发明提供的益处。所有这些修改都在所附权利要求的范围内。

本文引用的所有出版物和专利文献均通过引用并入本文，如同每个这样的出版物或文献被具体和单独地指出以通过引用并入本文。出版物和专利文献的引用并不意味着指明任何此类文件是相关的现有技术，也不构成对其内容或日期的任何承认。

序列表

<110> 美国杰龙生物医药公司

<120> 血液癌症的组合治疗

<130> PRD3424WOPCT

<140>

<141>

<150> 62/422,738

<151> 2016-11-16

<150> EP 16197293.0

<151> 2016-11-04

<150> 62/370,018

<151> 2016-08-02

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /备注="人工序列的描述: 合成

寡核苷酸"

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探针"

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引物"

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引物"

<400> 8

gcgcggctta cccttaccct taccctaacc 30

Claims

1.(a)伊美司他或其盐和(b)ABT-199在制备供一种治疗急性髓性白血病(AML)的方法使用的药物中的用途，所述方法包括：将(a)伊美司他或其盐和(b)ABT-199组合施用给有此需要的受试者。

2.根据权利要求1所述的用途，其中伊美司他或其盐施用1、2、3、4、5、6、7、8或多于8个给药周期，每个周期包括：

(a)静脉内施用7-10mg/kg伊美司他或其盐，每四周一次；

(b)静脉内施用7-10mg/kg伊美司他或其盐，每周一次，持续4周；

(c)静脉内施用2.5-10mg/kg伊美司他或其盐，每三周一次；或

(d)静脉内施用0.5-9.4mg/kg伊美司他或其盐，每四周一次。

3.根据权利要求2所述的用途，其中伊美司他的盐是伊美司他钠。

4.根据权利要求1所述的用途，其中ABT-199以以下剂量施用：

(a)每天50-400mg ABT-199；

(b)在第1天2mg ABT-199，每日升高，在第6天最终剂量800mg，此后每日一次；或者

(c)在第1天25mg ABT-199，每日升高，在第5天最终剂量400mg，此后每日一次。

5.根据权利要求4所述的用途，其中ABT-199的施用是施用伊美司他的前一天、后一天或同一天。

6.(a)伊美司他或其盐和(b)ABT-199在制备供一种在急性髓性白血病(AML)细胞中诱导细胞凋亡的方法使用的药物中的用途，所述方法包括：使所述细胞与治疗有效量的伊美司他或其盐接触，并使所述细胞与治疗有效量的ABT-199接触。

7.根据权利要求6所述的用途，其中伊美司他的盐是伊美司他钠。

8.一种试剂盒，其包括：

(a)伊美司他或其盐，其剂量为在施用时有效诱导急性髓性白血病(AML)细胞中的细胞凋亡的量；以及

(b)ABT-199，其剂量为在施用时有效诱导急性髓性白血病(AML)细胞中的细胞凋亡的量。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述伊美司他的盐是伊美司他钠。

10.一种在急性髓性白血病(AML)细胞中诱导细胞凋亡的体外方法，其包括：使所述细胞与治疗有效量的伊美司他钠接触；并使所述细胞与治疗有效量的ABT-199接触。

11.一种包含(a)伊美司他或其盐和(b)ABT-199的药物组合物。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述伊美司他的盐是伊美司他钠。

13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于治疗急性髓性白血病。

14.一种包含(a)伊美司他或其盐和(b)ABT-199的组合在制备供治疗急性髓性白血病(AML)的方法使用的药物中的用途，所述方法包括将所述组合施用给有此需要的受试者。

15.根据权利要求14所述的组合的用途，其中所述伊美司他的盐是伊美司他钠。

16.根据权利要求14所述的组合的用途，其中伊美司他或其盐施用1、2、3、4、5、6、7、8或多于8个给药周期，每个周期包括：

(a)静脉内施用7-10mg/kg伊美司他或其盐，每四周一次；

(b)静脉内施用7-10mg/kg伊美司他或其盐，每周一次，持续4周；或

(c)静脉内施用2.5-7mg/kg伊美司他或其盐，每三周一次；或

(d)静脉内施用0.5-9.4mg/kg伊美司他或其盐，每四周一次。

17.根据权利要求14所述的组合的用途，其中所述ABT-199以以下剂量施用：

(a)每天50-400mg ABT-199；

18.根据权利要求14所述的组合的用途，其中ABT-199的施用是施用伊美司他或其盐的前一天、后一天或同一天。

19.根据权利要求14所述组合的用途，其中(a)伊美司他或其盐和(b)ABT-199的使用诱导急性髓性白血病(AML)细胞的细胞凋亡。

20.一种包含伊美司他钠和ABT-199的组合物在制备供治疗急性髓性白血病(AML)的方法使用的药物中的用途，所述方法包括将伊美司他钠和ABT-199组合施用给有此需要的受试者。

21.一种包含伊美司他钠和ABT-199的组合产品在制备供治疗急性髓性白血病(AML)的方法使用的药物中的用途，所述方法包括将所述组合产品施用给有此需要的受试者。

22.根据权利要求20-21中任一项所述的用途，其中伊美司他钠施用1、2、3、4、5、6、7、8或多于8个给药周期，每个周期包括：

(a)静脉内施用7-10mg/kg伊美司他钠，每四周一次；

(b)静脉内施用7-10mg/kg伊美司他钠，每周一次，持续4周；

(c)静脉内施用2.5-7mg/kg伊美司他钠，每三周一次；或

(d)静脉内施用0.5-9.4mg/kg伊美司他钠，每四周一次。

23.根据权利要求20-21中任一项所述的用途，其中所述ABT-199以以下剂量施用：

(a)每天50-400mg ABT-199；

24.根据权利要求20-21中任一项所述的用途，其中ABT-199的施用是施用所述伊美司他钠的前一天、后一天或同一天。