CN109628323B - 绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂,涉及微生物农药领域。绿色木霉发酵方法,包括如下步骤:将绿色木霉LTR‑2接种至发酵培养基,发酵前期控制温度为29‑31℃,发酵后期控制温度为24℃‑26℃、pH为5.0~5.5,得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR‑2发酵液。采用本发明方法,能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液,显著提高产品的抗逆性,延长货架期;其水分散粒剂对番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病的防治效果明显优于对照药剂和农用制剂DZ‑1。
Description
技术领域
本发明涉及微生物农药领域,更具体地说是涉及绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂。
背景技术
木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目,粘孢菌类,是一类普遍存在的真菌。
绿色木霉菌(Trichoderma viride)在自然界分布广泛,常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉菌能产生多种具有生物活性的酶系,如:纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。在植物病理生物防治中具有重要的作用。绿色木霉菌是所产纤维素酶活性最高的菌株之一,所产生的纤维素酶对作物有降解作用,效果非常好。
大多数绿色木霉菌可产生多种对植物病原真菌、细菌及昆虫具有拮抗作用的生物活性物质,并能提高农作物的抗逆性,促进植物生长和提高农产品产量,因此被广泛用于生物防治、生物肥料及土壤改良剂。由于化学农药对环境的负面影响较为严重,所以对环境较为友好的绿色木霉菌受到了广泛的关注。
厚垣孢子(chlamydospore)又称厚壁孢子。它是由菌丝中间的个别细胞膨大,原生质浓缩和细胞壁变厚而形成的***菌丝,既不是无性孢子,也不是有性孢子。厚垣孢子呈圆形、纺锤形或长方形,它是真菌度过不良环境的一种休眠细胞,寿命较长,菌丝体死亡后,上面厚垣孢子还活着,一旦环境条件好转,又能萌发成菌丝体。
分生孢子(conidiospore)是真菌中常见的一类无性孢子,是生于细胞外的孢子,所以称为外生孢子。分生孢子着生与已分化的分生孢子梗(conidiophore)或具有一定形状的小梗上,也有些真菌的分生孢子就着生在菌丝的顶端。
跟分生孢子相比,厚垣孢子存在抗逆性强、货架期长等优点,但是现有技术发酵培养绿色木霉LTR-2,仅能得到富含分生孢子的发酵液。
发明内容
本发明的目的是提供绿色木霉发酵方法,能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液,显著提高产品的抗逆性,延长货架期。
本发明的再一目的是提供绿色木霉的水分散粒剂。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
绿色木霉发酵方法,包括如下步骤:将绿色木霉LTR-2接种至发酵培养基,发酵前期控制温度为29-31℃,发酵后期控制温度为24℃-26℃、pH为5.0~5.5;发酵结束后,得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液;所述发酵培养基含有如下成分:玉米粉18~22g/L、葡萄糖8~12g/L、磷酸二氢钾7~8g/L、碳酸钙4~6g/L、硝酸钠0.8~1.2g/L、硫酸铵1~2g/L、氯化钠0.8~1.2g/L、七水硫酸镁0.4~0.6g/L、七水硫酸亚铁0.4~0.6g/L、硫酸锰0.15~0.25g/L、硫酸锌0.15~0.25g/L,pH为6.0~7.0。
在本发明中,所述发酵前期是自发酵开始至发酵后65-72h,发酵后期是发酵后72h-发酵后178h。
在本发明中,将绿色木霉LTR-2种子液接种至发酵培养基。
在本发明中,所述发酵液是将绿色木霉LTR-2接种至液体种子培养基,在25-30℃条件下培养2~3d,得到绿色木霉LTR-2种子液;所述液体种子培养基是将马铃薯切块,加蒸馏水,煮沸后取滤液,加入葡萄糖,搅拌后所得。
本发明还提供采用上述方法得到的发酵液。
本发明还提供绿色木霉分散粒剂,采用如下方法制备:
(1)将富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液浓缩;
(2)在浓缩液中添加润湿剂、分散剂、崩解剂和填料,混合均匀后,粉碎、造粒、干燥、筛分,得到所述水分散粒剂。
优选的技术方案中,所述润湿剂为十二烷基硫酸钠、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、萘磺酸盐和十八烷基丁二酸钠中的一种或两种以上;所述分散剂为木质素磺酸盐、萘磺酸钠甲醛缩合物、烷基酚乙氧基化合物、多芳基酚乙氧基化磷酸酯、EO–PO嵌段共聚物和聚羧酸盐中的一种或两种以上;所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡络烷酮、交联羧甲基纤维素钠中的一种或两种以上;所述填料为粘土、高岭土、膨润土、白炭黑、硅藻土、滑石粉中的一种或两种以上。
优选的技术方案中,所述绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂中润湿剂的质量百分含量为1~5%、分散剂的质量百分含量为2~10%、崩解剂的质量百分含量为2~5%。
在本发明中,所述绿色木霉分散粒剂中绿色木霉LTR-2含量至少为25×108cfu/g。
采用本发明绿色木霉发酵方法,能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液,显著提高产品的抗逆性,延长货架期。本发明绿色木霉的水分散粒剂,能够使绿色木霉LTR-2进入水中分散并防止重新再聚集,保证呈悬浮状态,对番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病的防治效果明显优于对照药剂和农用制剂DZ-1。
具体实施方式
实施例1绿色木霉LTR-2厚垣孢子发酵液的制备
本实施例介绍了绿色木霉LTR-2厚垣孢子发酵液的制备。
1、绿色木霉LTR-2的活化
从绿色木霉LTR-2的斜面中,用无菌接种针挑取部分菌苔至已预制好的含有PDA固体培养基的茄子瓶中,30℃培养2d,得到活化的绿色木霉LTR-2。
2、绿色木霉LTR-2种子液的制备
用无菌接种针挑取活化后的绿色木霉LTR-2菌苔,接种到装有100mL液体种子培养基的三角烧瓶(500mL规格)中。培养条件:在28℃、100~150r/min的摇床中,遮光震荡培养2~3d,得到绿色木霉LTR-2种子液。
其中液体种子培养基采用如下方法制备:将300g去皮马铃薯切块,加800mL蒸馏水,煮沸10~20min,用纱布过滤,在滤液中加入20g葡萄糖,搅拌至葡萄糖溶解后,补加蒸馏水至1000mL,分装后121℃高压灭菌20min。
3、制备绿色木霉LTR-2发酵液
发酵培养基含有如下成分:玉米粉20g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾7.5g/L、碳酸钙5g/L、硝酸钠1g/L、硫酸铵1.5g/L、氯化钠1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸锌0.2g/L,pH为6.5。
按照2%的接种量将绿色木霉LTR-2种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中。发酵前期(自发酵开始至发酵后72h),控制发酵温度为30℃、转速150r/min、通气量为1VVM;发酵后期(发酵后72h至发酵后168h),控制发酵温度为25℃、转速150r/min、通气量为1VVM,通过流加稀酸控制发酵液pH为5.0~5.5。发酵结束后,得到厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液。
去掉上述发酵培养基中的七水硫酸镁和七水硫酸亚铁,其他培养基成分和含量不变,作为对照发酵培养基。按照2%的接种量将绿色木霉LTR-2种子液接入装有对照发酵培养基的发酵罐中。整个发酵过程,发酵温度一直控制在30℃、转速150r/min、通气量为1:1;一直持续到发酵结束,得到分生孢子含量为5×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2菌液,几乎无厚垣孢子产生。
实施例2 绿色木霉LTR-2水分散粒剂的制备
在厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液(实施例1制备)中,加入助滤剂后通过过滤或加入絮凝剂后离心得到厚垣孢子浓缩物。例如:向1200kg厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液中加入絮凝剂聚丙烯酰胺(按照2g/kg的比例添加),混合均匀后,在蝶式离心机中,5000rpm转速下离心浓缩,取沉淀,得到210kg厚垣孢子浓缩物。
在210kg厚垣孢子浓缩物中,添加1000目的高岭土(填料)290kg,再添加十二烷基硫酸钠(润湿剂)10kg、木质素磺酸钠(分散剂)25kg和羧甲基淀粉钠(崩解剂)15kg,在混合罐中混合60min以上,搅拌均匀。将得到的混合物通过气流粉碎,挤压造粒,通过流化床干燥(进风温度80~90℃,出风口温度40~50℃),过筛除去过大和过小的颗粒,得到直径为0.5~1mm、长1~5mm的绿色木霉LTR-2水分散粒剂。该水分散粒剂中,绿色木霉LTR-2厚垣孢子含量为25×108cfu/g,水含量为4.5%,润湿时间54s,分散性92%,悬浮率85%。
本实施例中涉及到的润湿剂,也可以为脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、萘磺酸盐和十八烷基丁二酸钠中的一种或两种以上。
本实施例中涉及到的分散剂,也可以萘磺酸钠甲醛缩合物、烷基酚乙氧基化合物、多芳基酚乙氧基化磷酸酯、EO–PO嵌段共聚物和聚羧酸盐中的一种或两种以上。
本实施例中涉及到的崩解剂,也可以为低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡络烷酮、交联羧甲基纤维素钠中的一种或两种以上。
本实施例中涉及到的填料,也可以为粘土、膨润土、白炭黑、硅藻土、滑石粉中的一种或两种以上。
在保证水分散粒剂中绿色木霉菌LTR-2厚垣孢子含量不低于2×108cfu/g的情况下,可以对发酵液浓缩工艺、添加剂及填料的种类及含量、后处理工艺进行适当的调整。
设对照样品1:液体种子培养基含有玉米粉2%、葡萄糖0.5%、豆饼粉1%,磷酸氢二钾0.2%、磷酸二氢钾0.3%、碳酸钙1%,pH6.0。灭菌后将2个茄子瓶的种子接种至150立升的种子罐中,30℃培养,通气量1:0.7,搅拌转速200rpm,培养时间为40h,得到液体菌种。将该液体菌种与固体培养基(麸皮:稻壳:玉米粉=7:1:2,含水量为70%,pH6.0,灭菌后冷却)混合均匀,接种量为8%,接种完毕转移到固体培养室内培养。培养基厚度5cm,料温控制在30±2℃,室温控制在25~30±2℃,空气的相对含水量控制在95~100%,培养时间7天。培养完毕,将固体培养物自然风干,成品含水量控制在5~10%,得绿色木霉菌LTR-2固体培养物,过100目筛收集孢子粉,记为农用制剂DZ-1,该分生孢子含量为1×108cfu/g。
实施例3 绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂在田间对病害的防治效果
采用实施例2制备的绿色木霉LTR-2水分散粒剂,在云南省开展了大量的试验。
施用作物及防治病害:番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病。
选取如下用药方案进行试验:
番茄灰霉病:空白对照CK(清水)、绿色木霉LTR-2水分散粒剂(1500倍液喷雾)、农用制剂DZ-1(60倍液喷雾)、对照药剂(10%井•蜡芽悬浮剂,500~625倍液喷雾)。第一次用药在定植前,第二次在发病初期,之后每隔7天喷1次,共施用4次。
马铃薯晚疫病:空白对照CK(清水)、绿色木霉LTR-2水分散粒剂(1500倍液喷雾)、农用制剂DZ-1(60倍液喷雾)、对照药剂(80%代森锰锌,600~800倍液喷雾)。田间发现病株时,第一次用药,之后间隔7天喷1次,连续施用3次。
烟草白粉病:空白对照CK(清水)、绿色木霉LTR-2水分散粒剂(1500倍液喷雾)、农用制剂DZ-1(60倍液喷雾)、对照药剂(70%甲基托布津,1000倍液喷雾)。田间发现病株时第一次用药,之后间隔7天喷1次,连续施用3次。
试验小区设置:对于每种作物及病害,单个小区面积在30-40平方米左右,设置12个小区,每个实验3个小区,在田块面积大的地方可以设隔离带。
每种作物的各小区仅施药不一样,其他管理及育苗等完全一样。分别统计发病指数,每个处理3次重复取平均值后,计算各药剂的使用效果。其试验数据分别见下表1。
表1 绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂对植物病害的防治效果
由上述表1的数据可知,绿色木霉LTR-2水分散粒剂对番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病的防治效果明显优于对照药剂和农用制剂DZ-1。
绿色木霉菌是一种安全、无毒、无残留的新型生物农药,通过人工培养获得绿色木霉菌厚垣孢子后又施用在作物中,使之在土壤中继续繁殖,形成有益微生物在土壤中的良性循环,有利于保持根际土壤微生态平衡,达到对病害的持续控制,而且不易产生抗药性,因此可以在农业生产中推广应用,前景广阔。
Claims (7)
1.绿色木霉发酵方法,其特征在于包括如下步骤:将绿色木霉LTR-2种子液接种至发酵培养基进行培养,发酵前期控制温度为29-31℃,发酵后期控制温度为24℃-26℃、pH为5.0~5.5;发酵结束后,得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液;所述发酵培养基由如下组分组成:玉米粉18~22g/L、葡萄糖8~12g/L、磷酸二氢钾7~8g/L、碳酸钙4~6g/L、硝酸钠0.8~1.2g/L、硫酸铵1~2g/L、氯化钠0.8~1.2g/L、七水硫酸镁0.4~0.6g/L、七水硫酸亚铁0.4~0.6g/L、硫酸锰0.15~0.25g/L、硫酸锌0.15~0.25g/L,pH为6.0~7.0,余量为水;所述发酵前期是自发酵开始至发酵后72h,发酵后期是发酵后72h至发酵后168h;将绿色木霉LTR-2种子液接种至发酵培养基,接种量为2%,转速为150r/min、通气量为1VVM。
2.根据权利要求1所述绿色木霉发酵方法,其特征在于将绿色木霉LTR-2接种至液体种子培养基,在25-30℃条件下培养2~3d,得到绿色木霉LTR-2种子液;所述液体种子培养基是将马铃薯切块,加蒸馏水,煮沸后过滤,取滤液,加入葡萄糖后所得。
3.权利要求1所述方法得到的发酵液。
4.绿色木霉分散粒剂,其特征在于采用如下方法制备:
(1)将权利要求1所得富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液浓缩;
(2)在浓缩液中添加润湿剂、分散剂、崩解剂和填料,混合均匀后,粉碎、造粒、干燥、筛分,得到所述水分散粒剂。
5.根据权利要求4所述绿色木霉分散粒剂,其特征在于所述润湿剂为十二烷基硫酸钠、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、萘磺酸盐和十八烷基丁二酸钠中的一种或多种;所述分散剂为木质素磺酸盐、萘磺酸钠甲醛缩合物、烷基酚乙氧基化合物、多芳基酚乙氧基化磷酸酯、EO–PO嵌段共聚物和聚羧酸盐中的一种或多种;所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡络烷酮、交联羧甲基纤维素钠中的一种或多种;所述填料为粘土、高岭土、膨润土、白炭黑、硅藻土、滑石粉中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述绿色木霉分散粒剂,其特征在于所述绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂中润湿剂的质量百分含量为1~5%、分散剂的质量百分含量为2~10%、崩解剂的质量百分含量为2~5%。
7.根据权利要求6所述绿色木霉分散粒剂,其特征在于所述绿色木霉分散粒剂中绿色木霉LTR-2含量为25×108cfu/g。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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