CN109620797B - 一种耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂及其制备方法 - Google Patents

一种耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂及其制备方法，将水溶性高分子聚合物溶于无菌去离子水中，得到水溶性高分子聚合物溶液；再加入丝素蛋白，搅拌均匀，得到水溶性高分子聚合物/丝素蛋白前驱体溶液；将益生菌菌液离心洗涤，蒸馏水重溶后加入到水溶性高分子聚合物/丝素蛋白前驱体溶液，搅拌均匀，得到水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液；通过静电纺丝制备得到获得水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料，即为所述纳米纤维缓释固体剂。本发明能够较大程度地提高益生菌在人体肠道内的存活率；并且可通过改变丝素蛋白的添加量调节耐受胃液胁迫后益生菌的繁殖率。

Description

一种耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种属于药物技术领域的固体试剂，具体地说，就是一种基于纳米纤维包埋益生菌缓释固体试剂。
背景技术
人体肠道内存在着数以亿计的肠道微生物，统称为肠道微生物组，是人体物质代谢的重要环节。肠道微生物在人体新陈代谢过程中起着重要的调节作用，研究表明肠道菌群与人类疾病有着密切的关系并且针对不同的人群不同的症状，需要摄入益生菌的量完全不一样。在一项关于哮喘的研究中，研究者们让极有可能产出哮喘婴儿的准妈妈们每天摄入100亿个菌落形成单位的益生菌。结果发现，这个剂量的益生菌有助于降低宝宝们患哮喘的风险；如果在腹泻发病率较高的地方旅行，每天可以服用200-300亿个菌落形成单位的益生菌。在成人肠道中，如果肠道菌群平衡失调会引起代谢疾病、消化***疾病、心血管疾病甚至肿瘤疾病，因此对肠道微生物的研究越来越受重视。益生菌发挥作用必须进入并以一定数量的活菌定植于大肠处。但是，当益生菌被摄入后，其必须首先顺利通过人类或动物的胃部低pH环境胁迫(消化)，然后在肠道中进行生长与繁殖。人胃部的低酸环境(pH 1.5-4.0)对于益生菌的转运具有巨大的阻碍作用，从而减弱了其对人体及动物产生的有益作用。因此，益生菌包埋技术作为一种最为有效的保护策略用来提高益生菌在胃液中的存活率具有重要的意义。并且针对不同的人群、症状所需摄入益生菌量不同外界递送的活菌量需要调节。
与传统的包埋材料相比静电纺丝是一种制备条件温和、工艺简单且可连续制备纳米纤维的方法，所得纳米纤维材料比表面积大、孔隙率高、对活性物质负载率高且具有良好的控释性能。所以在固载体系中，静电纺丝聚合物纳米纤维是个极具前景的方法。目前，益生菌与水溶性高聚物如聚乙烯醇(PVA)共混物进行静电纺丝已有研究报道，并且结果也都显示能够较大程度地提高益生菌的活性及热稳定性。但是，存在并且需要解决的问题是，聚乙烯醇与益生菌共混物的电纺纳米纤维膜薄且电纺的成功率不高。丝素蛋白(SF)作为一种天然材料，因其所具有的各种特殊物理及化学性能，如①具有良好的降解性和生物相容性，应用体内安全，组织相容性好；②良好的力学性能和理化性质，包括其柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等。所以将丝素蛋白与同样具有较好的韧性和生物相容性的聚乙烯醇(PVA)共混物进行静电纺丝得到的纳米纤维材料，可成为一种应用前景广阔的缓释载体材料。但是并且目前尚未有关于丝素蛋白、聚乙烯醇与益生菌共混进行静电纺丝制成具有抵御胃酸胁迫并具备缓释活菌功能的先例报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂及其制备方法，能够使包埋在纳米纤维内部的益生菌耐受胃液胁迫，并且进入肠道后通过纤维的崩解而释放出来，在肠道内繁殖。另一方面可通过改变电纺液各组分的配比调节耐受胃液胁迫后益生菌的繁殖率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将水溶性高分子聚合物溶于无菌去离子水中，得到水溶性高分子聚合物溶液；
(2)再向步骤(1)得到的水溶性高分子聚合物溶液中加入丝素蛋白，搅拌均匀，得到水溶性高分子聚合物/丝素蛋白前驱体溶液；
(3)将益生菌菌液离心洗涤，蒸馏水重溶后加入到步骤(2)得到的水溶性高分子聚合物/丝素蛋白前驱体溶液，搅拌均匀，得到水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液；
(4)将步骤(3)得到的水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液通过静电纺丝制备得到获得水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料，即为所述纳米纤维缓释固体剂。
所述丝素蛋白与无菌去离子水的质量体积比为0.05～0.08:1g/mL，水溶性高分子聚合物与无菌去离子水的质量体积比为0.06～0.08:1g/mL。
所述步骤(1)中，将水溶性高分子聚合物溶于无菌去离子水中，60℃油浴加热搅拌，待其溶解，然后冷却至室温。
所述步骤(2)中，在室温条件下用磁力搅拌器搅拌均匀。
所述步骤(3)中，益生菌菌液与蒸馏水的体积比为20:1。
所述步骤(4)中，静电纺丝的具体步骤如下：将水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液加入到静电纺丝装置的注射针管中，将针头接高压源，接收端接地，然后在22kv～24kv电压下，用微量泵以2mL/min速度推进，通过喷射装置注射到距离15～20cm的接收屏上进行静电纺丝。
一种由上述的方法制备得到的耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂。
有益效果：本发明提供的一种耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂及其制备方法，具有以下优点：
(1)电纺纤维具有较小的尺寸和较高的表面积和孔隙率，有利于细胞粘附，能较好地模拟细胞外基质的形态结构，对细菌的活性影响小，可保持了较高的活性；
(2)电纺纳米纤维可以通过调整纺丝原料方便选择性地制备包埋效果最好、益生菌活性最高的固载纳米纤维；
(3)添加适合浓度的丝素蛋白能够有效解决聚乙烯醇/益生菌电纺效率不高以及纳米纤维薄不易成丝的问题，提高了纳米纤维对益生菌的包埋率并且可通过改变丝素蛋白的添加量调节耐受胃液胁迫后益生菌的繁殖率。
附图说明
图1为水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌复合生物纳米纤维材料的扫描电镜图；其中，A为水溶性高分子聚合物/丝素蛋白纳米纤维；B为水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌复合纳米纤维；
图2为水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌复合纳米纤维生长曲线；
图3为水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌复合纳米纤维和纯益生菌在模拟胃液中胁迫条件2.0h后的生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1：
高繁殖率的聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料缓释固体剂
取1.2g聚乙烯醇放入称量瓶中，加入10mL无菌去离子水，油浴加热搅拌至溶解，冷却至室温；取1.6g丝素蛋白放入称量瓶中，加入10mL无菌去离子水搅拌至溶解；将丝素蛋白溶液加入到聚乙醇溶液中，放在恒温磁力搅拌器上混合均匀；取20mL乳酸菌菌液离心洗涤后，在1.0mL蒸馏水中重溶后加入到聚乙烯醇和丝素蛋白的混合溶液中，溶液用静电纺丝法制备成聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料。
其中，静电纺丝的具体步骤如下：将水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液加入到静电纺丝装置的注射针管中，将针头接高压源，接收端接地，然后在22kv～24kv电压下，用微量泵以2mL/min速度推进，通过喷射装置注射到距离15～20cm的接收屏上进行静电纺丝。
按照2010年版中国药典规定要求配置模拟胃液：取稀盐酸16.4mL，加800mL水及胃蛋白酶10g，摇匀后加水稀释成1000mL；称取本实施例制备的聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料2.0mg，放入已配好的模拟胃液中后37℃水浴2.0h后，再把聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料取出并且蒸馏水洗涤4～5次，再把聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料放入液体培养基中进行培养，每隔固定时间段取样测定其OD值，绘制标准曲线；2.0mL原菌液离心后再用蒸馏水洗涤2～3次，同时放入已配好的模拟胃液中后37℃水浴2h后，再用蒸馏水洗涤聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料3～4次，2.0mL蒸馏水重溶后加入到相同液体培养基中，每隔固定时间段取样测定其OD值，绘制标准曲线，OD值最高达到2.305。
实施例2：
低繁殖率的聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料缓释固体剂
取1.2g聚乙烯醇放入称量瓶中，加入10mL无菌去离子水，油浴加热搅拌至溶解，冷却至室温；取1.0g丝素蛋白放入称量瓶中，加入10mL无菌去离子水搅拌至溶解；将丝素蛋白溶液加入到聚乙醇溶液中，放在恒温磁力搅拌器上混合均匀；取20mL乳酸菌菌液离心洗涤后，在1.0mL蒸馏水中重溶后加入到聚乙烯醇和丝素蛋白的混合溶液中，溶液用静电纺丝法制备成聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料。
其中，静电纺丝的具体步骤如下：将水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液加入到静电纺丝装置的注射针管中，将针头接高压源，接收端接地，然后在22kv～24kv电压下，用微量泵以2mL/min速度推进，通过喷射装置注射到距离15～20cm的接收屏上进行静电纺丝。
按照2010年版中国药典规定要求配置模拟胃液。称取本实施例制备的聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料2.0mg，放入已配好的模拟胃液中后37℃水浴2.0h后，再把聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料取出并且蒸馏水洗涤4～5次，再把聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料放入液体培养基中进行培养，每隔固定时间段取样测定其OD值，绘制标准曲线；2.0mL原菌液离心后再用蒸馏水洗涤2～3次，同时放入已配好的模拟胃液中后37℃水浴2.0h后，再用蒸馏水洗涤聚乙烯醇/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料3～4次，2.0mL蒸馏水重溶后加入到相同液体培养基中，每隔固定时间段取样测定其OD值，绘制标准曲线，OD值最高达到1.505。
本发明所采用的水溶性高分子聚合物和丝素蛋白是一种来源广泛，可生物降解，生物相溶性优良的益生菌载体。通过采用静电纺丝法将水溶性高分子高聚物、丝素蛋白和益生菌混纺得到复合生物纳米纤维材料，将益生菌包埋于纳米纤维内部，益生菌在指定的时间范围通过纳米纤维的崩解而释放出来，起到保护益生菌耐受胃液胁迫的作用，能够较大程度地提高益生菌在人体肠道内的存活率；并且可通过改变丝素蛋白的添加量调节耐受胃液胁迫后益生菌的繁殖率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将水溶性高分子聚合物溶于无菌去离子水中，得到水溶性高分子聚合物溶液；
(2)再向步骤(1)得到的水溶性高分子聚合物溶液中加入丝素蛋白，搅拌均匀，得到水溶性高分子聚合物/丝素蛋白前驱体溶液；
(3)将益生菌菌液离心洗涤，蒸馏水重溶后加入到步骤(2)得到的水溶性高分子聚合物/丝素蛋白前驱体溶液，搅拌均匀，得到水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液；
(4)将步骤(3)得到的水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液通过静电纺丝制备得到获得水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/乳酸菌复合生物纳米纤维材料，即为所述纳米纤维缓释固体剂；
所述丝素蛋白与无菌去离子水的质量体积比为0.05～0.08:1g/mL，水溶性高分子聚合物与无菌去离子水的质量体积比为0.06～0.08:1g/mL；
所述步骤(2)中，向水溶性高分子聚合物溶液中加入已配好的丝素蛋白水溶液，将其放在磁力搅拌器上恒温条件下混合均匀；
所述步骤(3)中，益生菌菌液与蒸馏水的体积比为20:1；
所述步骤(4)中，静电纺丝的具体步骤如下：将水溶性高分子聚合物/丝素蛋白/益生菌纺丝液加入到静电纺丝装置的注射针管中，将针头接高压源，接收端接地，然后在22kv～24kv的电压下，微量泵以2mL/min的速度推进，通过喷射装置注射到距离15～20cm的接收屏上进行静电纺丝；
所述水溶性高分子聚合物为聚乙烯醇；
所述益生菌包埋于纳米纤维内部，益生菌在指定的时间范围通过纳米纤维的崩解而释放出来，起到保护益生菌耐受胃液胁迫的作用，提高益生菌在人体肠道内的存活率。
2.根据权利要求1所述的耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将水溶性高分子聚合物溶于无菌去离子水中，60℃油浴加热搅拌，待其溶解，然后冷却至室温。
3.一种由权利要求1或2所述的方法制备得到的耐受胃液胁迫的纳米纤维缓释固体剂。
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