CN109616157A - 肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库及其构建方法，选取氢化可的松诱导的肾阴虚模型和肾阳虚模型，采用iTRAQ技术、蛋白互作网络和聚类分析手段比较正常模型、肾阴虚模型和肾阳虚模型睾丸表达的差异蛋白，从而获得肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库。本发明利用构建的差异蛋白质数据库解释肾虚证的本质，为肾虚证的诊疗提供蛋白质组学方面的基础，对研究男性生殖功能障碍的诊治具有非常重要的意义。

Description

肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库及其构建方法

技术领域

本发明涉及蛋白质组学技术领域，具体涉及一种肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库及其构建方法。

背景技术

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学，蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。

中医中包括了不同的“证”，但基于中医的历史和诊疗特点，中医领域很少基于具体的检测报告和量化数据来确诊“证”，“证”一般会通过具体症状来确诊。通过蛋白质组学研究技术可对机体蛋白质组进行鉴定，如果对中医的不同“证”进行整体蛋白质组分分析，明确各种“证”之间的蛋白质组分的异同，并进行综合归纳，概括其共性与个性，就能更好、更准确地揭示中医“证”的本质。

在多种疾病的辨证施治中，肾虚证具有非常重要的意义，尤其在男性不育治疗中显得尤为重要。肾阳虚或肾阴虚导致的男性不育与下丘脑-垂体-睾丸轴的形态和功能紊乱相关，且睾丸中蛋白的表达亦与其生精功能密切相关。因此可以基于蛋白质组学来解释肾虚证的本质。

然而，迄今为止，将传统中医学的“证”与分子生物学(特别是蛋白质组学)结合的研究技术及方法较少，关于中医“证型”的蛋白质组学数据库建立尚处空白阶段。在组学中，高通量的数据筛查和比较可以更形象客观地展现不同“证”之间的关联性。因此，本技术方法旨在通过蛋白质组学数据库的构建，利用大数据分析更好地比较研究中医不同“证”地异同。

发明内容

本发明的目的是提供一种肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库及其构建方法，利用构建的差异蛋白质数据库解释肾虚证的本质。

本发明所采用的技术方案为：

肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，其特征在于：

选取氢化可的松诱导的肾阴虚模型和肾阳虚模型，采用iTRAQ技术、蛋白互作网络和聚类分析手段比较正常模型、肾阴虚模型和肾阳虚模型睾丸表达的差异蛋白，从而获得肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库。

具体包括以下步骤：

步骤一：获取正常组模型、肾阴虚组模型和肾阳虚组模型的睾丸蛋白；

步骤二：对提取的睾丸蛋白进行iTRAQ分析，得到原始质谱数据；

步骤三：原始质谱数据转换成mgf格式文件后，利用Mascot软件进行比对搜索鉴定，得到最终可信的差异蛋白鉴定结果；

步骤四：采用STRING数据库，预测肾阳虚组与正常组、肾阴虚组与正常组、肾阴虚组与肾阳虚组小鼠睾丸差异蛋白的互相作用，并绘制差异蛋白互作网络图，借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，分析蛋白质互作网络的拓扑结构，得到差异蛋白网络模块，比对核心蛋白，发现差异蛋白互作网络中的节点差异蛋白。

步骤一中，正常组模型、肾阴虚组模型和肾阳虚组模型均包括相同数量的小鼠，其中肾阴虚组模型和肾阳虚组模型基于氢化可的松的作用获得。

步骤二的具体过程为：

还原烷基化处理提取的睾丸蛋白，充分酶解蛋白，并用Brandford法测定蛋白浓度，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；取等量蛋白Tripsin酶解每个样品，用iTRAQ试剂标记肽段，并等量混合，再用强阳离子交换色谱进行预分离，最后，液相串联质谱分析得到原始质谱数据。

步骤三中，原始质谱数据采用Mascot软件进行数据库搜索，数据库为Uniprot-Musmusculus；

采用Confidence Interval＞95％鉴定蛋白，至少有1个肽段与库中的肽段95％以上匹配；差异蛋白根据蛋白质丰度水平获得，差异倍数在1.2倍以上，且P＜0.05。

步骤四中，选择综合置信度≥0.15时STRING数据库的数据分析模式构建蛋白质互作网络图；选择综合置信度≥0.7，并借助STRING的MCL方法，分析蛋白质互作网络的拓扑结构，得到差异蛋白网络模块，比对每组的核心蛋白。

步骤四中：

将肾虚小鼠睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时的差异蛋白为节点形成蛋白相互作用关系图；当综合置信度≥0.7时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，获得肾虚小鼠睾丸蛋白质相互作用网络中节点差异蛋白；

将鉴定到肾阴虚与肾阳虚小鼠睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时，以差异蛋白为节点形成蛋白互作网络图；当综合置信度≥0.7时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，发现肾阴虚组与肾阳虚组相比差异蛋白相互作用网络中可能存在的一些重要的节点差异蛋白。

如所述的方法获得的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库。

本发明具有以下优点：

本发明选取氢化可的松诱导的经典的肾阴虚和肾阳虚模型，采用iTRAQ技术、蛋白互作网络和聚类分析等手段比较氢化可的松诱导的两种肾虚睾丸表达的差异蛋白的关系，获得肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库，为肾虚证的诊疗提供蛋白质组学方面的基础，对研究男性生殖功能障碍的诊治具有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明技术流程图。

图2为肾阳虚组小鼠睾丸差异表达蛋白互作网络。

图3为肾阳虚组小鼠睾丸节点蛋白互作网络。

图4为肾阴虚组小鼠睾丸差异表达蛋白互作网络。

图5为肾阴虚组小鼠睾丸节点蛋白互作网络。

图6为肾阴虚组与肾阳虚组相比小鼠睾丸差异蛋白互作网络。

图7为肾阴虚组与肾阳虚组相比小鼠睾丸节点蛋白互作网络。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，具体由以下步骤实现：

步骤一：模型制备与分组，将小鼠30只随机分为3组，每组10只。正常组(Control)：腹腔注射生理盐水0.2ml，1次/d，连续7d；肾阳虚组(P1)：腹腔注射氢化可的松25mg/(kg·d)，连续10d；肾阴虚组(P2)：腹腔注射氢化可的松50mg/(kg·d)，连续7d，颈椎脱臼处死小鼠，取睾丸，备用。

步骤二：iTRAQ分析：还原烷基化处理提取的睾丸蛋白，充分酶解蛋白，并用Brandford法测定蛋白浓度，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。取等量蛋白Tripsin酶解每个样品，用iTRAQ试剂标记肽段，并等量混合，再用强阳离子交换色谱进行预分离，最后，液相串联质谱分析得到原始质谱数据。

步骤三：质谱分析与数据处理：原始质谱数据经过相应工具转换成mgf格式文件后，用蛋白质鉴定软件Mascot比对相应数据库搜索鉴定。判断数据合格后经过一定的筛选阈值，得到最终可信的差异蛋白鉴定结果。筛选策略具体是指1％FDR过滤：即利用target-decoy算法计算匹配地假阳性率，将假阳性率控制在1％以内，以此来提高蛋白鉴定地可信度。

步骤四：统计学方法，质谱数据采用Mascot2.3.02进行数据库搜索，数据库为Uniprot-Mus musculus。采用Confidence Interval＞95％鉴定蛋白，至少有1个肽段与库中的肽段95％以上匹配。差异蛋白是根据蛋白质丰度水平，差异倍数在1.2倍以上，且P＜0.05。

步骤五：采用STRING10.5(http://www.string-db.org/)数据库，预测肾阳虚组与正常组、肾阴虚组与正常组，肾阴虚组与肾阳虚组小鼠睾丸差异蛋白的互相作用，并绘制差异蛋白互作网络图。选择综合置信度≥0.15时STRING数据库的数据分析模式构建蛋白质互作网络图。选择综合置信度≥0.7(STRING数据库默认的高置信值)，并借助STRING的MCL方法，分析蛋白质互作网络的拓扑结构，得到差异蛋白网络模块，比对每组的核心蛋白。

步骤六：在富集分析中，超几何检验的P＜0.05，代表差异蛋白在该条目显著富集。选择综合置信度≥0.15构建差异蛋白相互作用网络。选择综合置信度≥0.7且MCL为3时STRING数据库的数据分析模式构建差异蛋白网络模块。富集分析方法通常是一组蛋白在某个功能节点尚是否出现，原理是由单个蛋白的注释分析发展为蛋白集合的注释分析。富集分析提高了研究的可靠性，能够识别出与生物现象最相关的生物学过程。

步骤七：根据蛋白的ID即可查阅相关基因表达的上调还是下调，蛋白的名称及其基因的名称，蛋白的作用及P值。使用Uniprot(https://www.uniprot.org/)网站检索蛋白ID，即可显示其具体信息。也可将蛋白或基因名称在NCBI的GENE数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中检索，得到最新研究进展。

步骤八：将肾虚小鼠睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时的差异蛋白为节点形成蛋白相互作用关系图。当综合置信度≥0.7(STRING数据库默认的最高置信值)，同时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，肾虚小鼠睾丸蛋白质相互作用网络中节点差异蛋白。

步骤九：将鉴定到肾阴虚与肾阳虚小鼠睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时，以差异蛋白为节点形成蛋白互作网络图。当综合置信度≥0.7(STRING数据库默认的最高置信值)，同时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，发现肾阴虚组与肾阳虚组相比差异蛋白相互作用网络中可能存在的一些重要的节点差异蛋白。

实施例：

1肾阳虚小鼠睾丸表达的差异蛋白

与正常组相比，肾阳虚组小鼠睾丸共鉴定出87个差异蛋白表达，其中，上调27个、下调60个。(见表1)

表1肾阳虚小鼠睾丸差异表达蛋白

2肾阳虚小鼠睾丸表达的差异蛋白互作网络

将鉴定到的87个肾阳虚组睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时，以85个差异蛋白为节点形成蛋白相互作用关系图，如图2(圆代表基因，线代表基因之间蛋白质的相互作用)。当综合置信度≥0.7(STRING数据库默认的最高置信值)，同时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，发现肾阳虚小鼠睾丸蛋白质相互作用网络中节点差异蛋白38个，分别为Glb1、Akr1b8、Hbb-b2、Hbb-b1、Ighg2c、B2m、Atp5j、Cox5a、Ubc、Ubqln2、Hist1h3e、Hist3h2ba、H2afy、Eef1b2、Rps5、Rplp2、Rps28、Rplp1、Rpl11、Rps19、Apoa4、Apoa1、Serpinc1、Hpx、Fgb、Serpina3k、Orm1、Ephx1、Gsta3、Calm1、Decr1、Sod1、Svs3a、Svs6、Svs4、Svs1、Svs2、Svs5，如图3(圆代表基因，线代表基因之间蛋白质的相互作用)。

3肾阴虚小鼠睾丸表达的差异蛋白

肾阴虚组与正常组相比，睾丸差异蛋白共177个，上调84个，下调93个。(见表2)

表2肾阴虚组小鼠睾丸差异表达蛋白

group

4肾阴虚小鼠睾丸差异蛋白互作网络

将鉴定到的177个肾阴虚组睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时，以172个差异蛋白为节点形成蛋白互作网络图，如图4(圆代表基因，线代表基因之间蛋白质的相互作用)。当综合置信度≥0.7(STRING数据库默认的最高置信值)，同时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，发现肾阴虚蛋白质相互作用网络中存在节点差异蛋白86个，分别为Khsrp、Exosc5、Srsf6、Hnrnpul1、Lsm3、Snrpc、Snrpb、Srsf3、Gstp1、Adh1、Ephx1、Dhdh、Ppp1r2、Ppp1r11、Spa17、Akap3、Cabyr、Fscb、Eno3、Tkt、Rps15、Rps28、Rpl35、Rpl23、Rpl11、Rplp2、Eef1b2、Srp9、Nedd8、Try5、Prss1、Svs6、Svs3a、Svs4、Svs1、Svs2、Svs5、Col22a1、Col6a1、Sod1、Pdia5、Pdia6、Prdx3、Txndc2、Atp5j、Cox5a、Ndufs3、Mcat、Mccc2、Apoa4、Apoa1、Hpx、Fga、Fgb、Orm1、Mcm7、Uchl1、Chmp4b、Psma3、Ubc、Ube2v2、Arhgef7、Hspb1、Ighg2c、B2m、H2-K1、Lgals1、Anxa2、Anxa1、Gnai2、Rapgef3、Igbp1b、Ppp4c、Arpc3、Nck1、Acox3、Acads、Sephs2、Marcks、Calm1、Dynlrb1、Kif3b、Mphosph8、Hist1h3e、H2afy、Rbbp4，如图5(圆代表基因，线代表基因之间蛋白质的相互作用)。

其中，与肾阳虚组节点差异蛋白相同的有Ighg2c、B2m、Atp5j、Cox5a、Ubc、Hist1h3e、H2afy、Eef1b2、Rplp2、Rps28、Rpl11、Apoa4、Apoa1、Hpx、Fgb、Orm1、Ephx1、Calm1、Sod1、Svs3a、Svs6、Svs4、Svs1、Svs2及Svs5共25个。

5肾阴虚及肾阳虚小鼠睾丸差异表达蛋白

肾阴虚组与肾阳虚组相比，睾丸差异蛋白共135个，上调70个，下调65个。(见表3)

表3肾阴虚组与肾阳虚组相比睾丸差异表达蛋白

6肾阴虚与肾阳虚小鼠睾丸差异蛋白互作网络

将鉴定到的135个肾阴虚组与肾阳虚组睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时，以131个差异蛋白为节点形成蛋白互作网络图，如图6(圆代表基因，线代表基因之间蛋白质的相互作用)。当综合置信度≥0.7(STRING数据库默认的最高置信值)，同时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，发现肾阴虚组与肾阳虚组相比差异蛋白相互作用网络中可能存在的一些重要的节点差异蛋白37个，分别为Try5、Prss1、Setx、Scaf4、Cobra1、Ercc3、Snrpb、Cd2bp2、Lsm3、mt-Atp8、Atp5j、Hbb-b2、Hbb-b1、Gm20390、Nme1、Tex12、Ube2i、Nedd8、Lcp1、Actg1、Arpc3、Ppid、Ttc12、Gpx1、Gpx3、Gpx4、Atox1、Sod1、Cyp11a1、Star、Odf2、Ssna1、Dctn3、Dync2li1、C4b、C3、Gnai3，如图7(圆代表基因，线代表基因之间蛋白质的相互作用)。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，其特征在于：

选取氢化可的松诱导的肾阴虚模型和肾阳虚模型，采用 iTRAQ 技术、蛋白互作网络和聚类分析手段比较正常模型、肾阴虚模型和肾阳虚模型睾丸表达的差异蛋白，从而获得肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库。

2.根据权利要求1所述的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，其特征在于：

具体包括以下步骤：

步骤一：获取正常组模型、肾阴虚组模型和肾阳虚组模型的睾丸蛋白；

步骤二：对提取的睾丸蛋白进行iTRAQ分析，得到原始质谱数据；

步骤三：原始质谱数据转换成mgf格式文件后，利用Mascot软件进行比对搜索鉴定，得到最终可信的差异蛋白鉴定结果；

步骤四：采用STRING数据库，预测肾阳虚组与正常组、肾阴虚组与正常组、肾阴虚组与肾阳虚组小鼠睾丸差异蛋白的互相作用，并绘制差异蛋白互作网络图，借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，分析蛋白质互作网络的拓扑结构，得到差异蛋白网络模块，比对核心蛋白，发现差异蛋白互作网络中的节点差异蛋白。

3.根据权利要求2所述的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，其特征在于：

步骤一中，正常组模型、肾阴虚组模型和肾阳虚组模型均包括相同数量的小鼠，其中肾阴虚组模型和肾阳虚组模型基于氢化可的松的作用获得。

4.根据权利要求2所述的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，其特征在于：

步骤二的具体过程为：

还原烷基化处理提取的睾丸蛋白，充分酶解蛋白，并用Brandford法测定蛋白浓度，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；取等量蛋白Tripsin酶解每个样品，用iTRAQ试剂标记肽段，并等量混合，再用强阳离子交换色谱进行预分离，最后，液相串联质谱分析得到原始质谱数据。

5.根据权利要求2所述的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，其特征在于：

步骤三中，原始质谱数据采用Mascot软件进行数据库搜索，数据库为Uniprot-Musmusculus；

采用Confidence Interval＞95%鉴定蛋白，至少有1个肽段与库中的肽段95% 以上匹配；差异蛋白根据蛋白质丰度水平获得，差异倍数在1.2倍以上，且P＜0.05。

6.根据权利要求2所述的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，其特征在于：

步骤四中，选择综合置信度≥0.15时STRING数据库的数据分析模式构建蛋白质互作网络图；选择综合置信度≥0.7，并借助STRING的MCL方法，分析蛋白质互作网络的拓扑结构，得到差异蛋白网络模块，比对每组的核心蛋白。

7.根据权利要求6所述的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库构建方法，其特征在于：

步骤四中：

将肾虚小鼠睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时的差异蛋白为节点形成蛋白相互作用关系图；当综合置信度≥0.7时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，获得肾虚小鼠睾丸蛋白质相互作用网络中节点差异蛋白；

将鉴定到肾阴虚与肾阳虚小鼠睾丸差异蛋白输入STRING数据库，当综合置信度≥0.15时，以差异蛋白为节点形成蛋白互作网络图；当综合置信度≥0.7时借助STRING数据库的MCL聚类运算功能，发现肾阴虚组与肾阳虚组相比差异蛋白相互作用网络中可能存在的一些重要的节点差异蛋白。

8.如权利要求2所述的方法获得的肾虚睾丸表达的差异蛋白质数据库。