CN109613280B - 一种血清铁测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血清铁测定试剂盒，该试剂盒含有试剂R1、试剂R2；其中试剂R1组成为：缓冲液、抗坏血酸、去干扰剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂；试剂R2中含有以下成分：缓冲液、红菲绕啉；还涉及血清铁测定试剂盒制备方法和应用。本发明稳定的血清铁为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。通过在试剂R1中加入稳定剂，有利于维持抗坏血酸的稳定性和还原性。试剂R1中加入去除干扰剂，硫脲与抗坏血酸溶液混合，既可作为还原剂又可作为掩蔽剂，去除其它离子的干扰。该试剂具有更高的灵敏度。该试剂使用方便，特异性高，准确度高，对生化仪无污染，有利于该试剂在市场中进一步推广。

Description

一种血清铁测定试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医学免疫体外诊断试剂领域，具体涉及一种血清铁测定试剂盒，还涉及所述血清铁测定试剂盒制备方法和应用。

背景技术

铁是人体最丰富的必须微量元素之一，是合成红细胞中血红蛋白的主要原料，广泛参与人体内的代谢过程。存在于正常成人体内的铁平均3-4.5g左右，全身所有的铁约70%存在于血红蛋白中少量存在于肌红蛋白中，而各种酶和血浆中运输状态的铁，仅占全身铁的极小部分，缺铁或含铁过多都会引发各种疾病。转铁蛋白又名运铁蛋白（transferrin，TRF，siderophilin）是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，以TRF-Fe³⁺的复合物形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。血清中只有三分之一的转铁蛋白与铁结合，其余三分之二未结合，转铁蛋白这种潜在的结合铁的能力称为不饱和铁结合力 UIBC(Unsaturated Iron Binding Capacity)，能结合的最大铁量称为总铁结合力TIBC(Total Iron Binding Capacity)，等于血清铁与不饱和铁结合力之和。血清铁的测定对诊断血液***、肝肾疾病、蛋白质缺乏症具有重要意义。

血清铁的测定方法有比色法、原子吸收分光光度法、溶出伏安法等。原子吸收分光光度法和溶出伏安法灵敏、快速、准确，但需要昂贵的仪器设备，操作过程也复杂，很少用来做血清铁的常规分析，比色法是测定血清铁的主要方法，比色法已经被IFCC推荐为参考方法，其特异性高、操作简便，适用于全自动生化分析仪，并适合大批量的样本检测。临床血清铁比色法测定原理为：在酸性条件下使铁离子与转铁蛋白解离，并加入还原剂例如羟胺、抗坏血酸、巯基乙酸、肼等将铁离子还原亚铁离子，再用一种能与亚铁离子络合的色原去络合亚铁离子，然后进行比色测定。临床广泛使用的色原有亚铁嗪、呋喃三嗪二钠盐 (ferene)、红菲绕啉 (BPZ)、三吡啶基三啉 (TPZ) 等，最常用的色原是亚铁嗪（例如CN 106814063 A中所公开的试剂盒），但试剂普遍存在灵敏度、特异性都不甚理想的不足之处，本发明针对现有血清铁测定试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种血清铁测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种灵敏度高、稳定性强、准确度高的液体试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种血清铁测定试剂盒，该试剂盒含有试剂R1、试剂R2；

其中试剂R1组成为：

缓冲液 50~80mmol/L

抗坏血酸 30 ~50 g/L

去干扰剂 0 ~ 100mmol/L

稳定剂 20~90 mmol/L

表面活性剂 1 ~10 g/L

防腐剂 0.1 ~10 g/L

试剂R2中含有以下成分：

缓冲液 30 ~50 mmol/L

红菲绕啉 2 ~4 g/L

优选地，所述试剂R1的pH 为 4.0-6.0；所述试剂R2 的pH为2.0-6.0。

优选地，所述试剂 R1中的稳定剂选自盐酸羟胺、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇中的一种或几种。

优选地，所述试剂 R1中的去干扰剂选自硫脲、氨基硫脲、N,N- 二甲基硫脲和异硫脲中的一种或多种。

优选地，所述试剂R1选用的缓冲液为醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐和磷酸盐-盐酸缓冲液中的一种或多种；试剂R2选用的缓冲液为醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐和磷酸盐-盐酸缓冲液中的一种或多种；

优选地，所述试剂 R1 中的表面活性剂选自曲拉通系列、吐温系列、brij-35和二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种。

优选地，所述试剂 R1中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素和硫柳汞中的一种或多种。

优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为 1~5:1，更优选体积比为4:1。

上述所述的血清铁测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：试剂R1、R2均先加入缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1的pH值调节为4.0-6.0，试剂R2的pH调节为2.0-6.0，再按照比例添加其他物质溶解，制成血清铁测定试剂盒。

上述所述的血清铁测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中铁离子的浓度。

有益效果

1）本发明稳定的血清铁为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

2）抗坏血酸在溶液状态下不稳定，容易分解，通过在试剂R1中加入稳定剂，有利于维持抗坏血酸的稳定性和还原性。试剂 R1中加入去除干扰剂，硫脲与抗坏血酸溶液混合，既可作为还原剂又可作为掩蔽剂，去除其它离子的干扰。

3）该试剂选用红菲绕啉作为色原，红菲绕啉与亚铁离子形成稳定的红色复合物，与亚铁嗪相比，该色原的摩尔吸光系数更高，使得试剂具有更高的灵敏度。

4）该试剂使用方便，特异性高，准确度高，对生化仪无污染，有利于该试剂在市场中进一步推广。

附图说明

图1为对比例1和实施例1的相关性曲线；

图2实施例1与对比例3、对比例4的稳定性对比。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用终点法进行测定，检测主波长为578nm，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品20μl，再加入200μl 的R1试剂，预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入50μl的R2试剂，反应5min后读取吸光度A2，并计算ΔA。

样品浓度=

× 标准浓度

样本要求：新鲜血清。标本4℃可保存一周。

实施例1

一种常规的血清铁测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。

试剂R1：

甘氨酸缓冲液 60mmol/L

抗坏血酸 35 g/L

硫脲 20mmol/L

盐酸羟胺 30 mmol/L

Tween-20 1 g/L

叠氮钠 1 g/L

pH 5

试剂R2：

甘氨酸缓冲液 50mmol/L

红菲绕啉 2 g/L

pH 3

本实施例所述试剂R1和试剂R2，配制时需先配制缓冲液，用盐酸和氢氧化钠调节pH，调到适当pH值后，再添加其它物质溶解后得到测定试剂。

实施例2

甘氨酸缓冲液 60mmol/L

抗坏血酸 35 g/L

氨基硫脲 30mmol/L

盐酸羟胺 35 mmol/L

Tween-20 1 g/L

叠氮钠 1 g/L

pH 5

试剂R2：

甘氨酸缓冲液 40mmol/L

红菲绕啉 3g/L

pH 3

制备方法同实施例1。

实施例3

醋酸缓冲液 50 mmol/L

抗坏血酸 35 g/L

氨基硫脲 40mmol/L

焦亚硫酸钠 35 mmol/L

Tween-20 1 g/L

叠氮钠 1 g/L

pH 5.5

试剂R2：

甘氨酸缓冲液 45mmol/L

红菲绕啉 3g/L；

pH 2.5

制备方法同实施例1。

对比例1

进口朗道铁试剂盒

对比例2

专利CN 106814063 A所采用的血清铁测定试剂盒

试剂R1组成为：

pH4.2 Tris 缓冲液 60mmol/L

抗坏血酸 100mmol/L

叠氮钠 10mmol/L

表面活性剂TritonX-100 1%

试剂R2组成为：

pH4.2 Tris 缓冲液 60mmol/L

亚铁嗪 50mmol/L

叠氮钠 10mmol/L

本实施例所述试剂R1和试剂R2，配置时需先加入缓冲物质Tris，用盐酸调到适当pH值后，再添加其它物质。

对比例3

与实施例 1 中血清铁测定试剂盒的区别仅在于试剂1不含有盐酸羟胺，其它与实施例1相同。

对比例4

与实施例 1 中血清铁测定试剂盒的区别仅在于试剂1不含有硫脲，其它与实施例1相同。

性能验证

试验一

将实施例1和对比例1进行相关性试验，试验方案为：实施例1和对比例1，同时检测了40个临床血清样本，检测结果如表2所示，对检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以比对对比例1检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差（Bias％）。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10%。

表1相关性对比实验结果

通过表1和图1的检测数据可知，实施例1 检测试剂盒与对比例1检测试剂盒的检测结果相关性分别为 0.9980，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的血清铁测定试剂盒有高度一致性，因此本发明提供的实施例1检测试剂与进口试剂盒相关性良好，完全可以替代进口试剂。

试验二

用本发明血清铁测定试剂盒测试已知浓度在17.9 µmol/L 的样本，记录吸光度差值。分别利用实施例 1和对比例1、对比例2的试剂进行检测。检测结果如表2所示。

表2 分析灵敏度检测结果

理论浓度	实施例1检测结果ΔA	对比例1检测结果ΔA	对比例2检测结果ΔA
				17.9 µmol/L	0.046	0.051	0.021

通过检测数据可知，实施例 1检测试剂盒的吸光度差值均比对比例3的高，说明该试剂改用红菲绕啉作为色原，红菲绕啉与亚铁离子形成稳定的红色复合物，扩大了响应信号，增强了反应的灵敏度，提高了检测试剂盒的分析灵敏度。

试验三

对实施例1和对比例2、3提供的血清铁测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例2、3提供的试剂，一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为19.5±1.75µmol/L L的质控品，并监测质控品测定值的变化。

表3试剂热稳定性验证结果

由表3和图2可以看出，本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下10天内基本无变化，稳定性较好；而对比例2、3试剂在37℃水浴条件下10天内变化明显。实施例1的试剂盒稳定性优于对比例2、3试剂盒的稳定性，通过在试剂中加入稳定剂盐酸羟胺，有利于维持抗坏血酸的稳定性和还原性，进而有利于维持试剂的稳定性。

试验四

对实施例1和对比例2、4提供的血清铁测定试剂盒进行抗干扰性试验，试验方案为：取靶值为靶值为19.5±1.75µmol/L的朗道生化质控品，分成4等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表3的要求，然后分别采用实施例1和对比例2、4所得的试剂，测定质控品中铁的含量，其中相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

表4抗干扰性能试验结果比较

由表4可以看出，本发明试剂盒对检测结果没有明显干扰，而对比例试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，说明本发明的试剂盒抗干扰能力优于对比例试剂，说明在试剂中加入去除干扰剂硫脲后，有效避免了其它物质的干扰，提高了试剂的抗干扰性能。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (3)

1.一种血清铁测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有试剂R1、试剂R2；

其中试剂R1组成为：

甘氨酸缓冲液 60mmol/L

抗坏血酸 35 g/L

硫脲 20mmol/L

盐酸羟胺 30 mmol/L

Tween-20 1 g/L

叠氮钠 1 g/L

pH 5；

试剂R2：

甘氨酸缓冲液 50mmol/L

红菲绕啉 2 g/L

pH 3；

所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。

2.一种权利要求1所述的血清铁测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：试剂R1、R2均先加入缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1的pH值调节为5，试剂R2的pH调节为3，再按照比例添加其他物质溶解，制成血清铁测定试剂盒。

3.一种权利要求1所述的血清铁测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中铁离子的浓度。

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