CN109609646B - 一种用于监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒，属于生物学技术领域。所述试剂盒内含基于NFE2L2基因单核苷酸多态性设计的两对特异性PCR引物。核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子标记的第522位存在单核苷酸多态性：T>G，即此序列的第522位的碱基包括碱基T和碱基G两种情况，相应基因型为TT、TG和GG三种型别，与上皮性卵巢癌易感性密切关联，利用PCR技术可以有效快速检测NFE2L2基因中的单核苷酸多态性，进而预测罹患上皮性卵巢癌的易感性，这对于上皮性卵巢癌易感人群的筛选和监测，对上皮性卵巢癌进行早期预警、早期诊断和个体化治疗具有重要的临床实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种用于监测上皮性卵巢癌易感性的分子标记及其临床应用。
背景技术
卵巢癌是一种高死亡率的女性恶性肿瘤，全世界每年死于上皮性卵巢癌的人数超过15万人。卵巢癌患者病情进展迅速，患者就诊时往往已经发展到晚期阶段，腹腔内广泛转移并且累及多个腹膜器官，大多数早期卵巢癌没有任何临床症状，到目前为止也没有很好的早期预测指标，无法进行早期的预警。
卵巢癌的治疗包括肿瘤细胞减灭术和铂类为主的联合化疗，虽然80％的卵巢癌患者最初对这种综合治疗方案均有明显反应，但大多数都会耐药后复发。在美国，治愈率从1970年代的12％仅仅提高到2000年的14％。而早期卵巢癌患者5年生存率可以高达90％，这提示我们如果找到早期监测指标，对卵巢癌易感人群进行早期预测、早期诊断和早期治疗可以大幅度提高卵巢癌的生存率，最终改善预后。
卵巢癌的发生和个体的遗传背景密切相关，具有明显的遗传性。癌症基因组图谱(TCGA)计划研究显示，10％的晚期卵巢癌病例存在30多个生长刺激基因的过度扩增，并且和TP53基因和BRCA1/2基因的异常重组和碱基突变有关，也可能和一些基因的碱基变异有关。因此寻找检测卵巢癌易感人群的遗传分子标记，对卵巢癌的疾病控制和治疗具有重要的预防和临床意义。但目前这些遗传变异研究不能完全解释上皮性卵巢癌的遗传背景和疾病的易感性。因此，需要更为广泛的遗传背景研究，力求全面的解释上皮性卵巢癌的遗传背景，同时可以更好的用分子标记物对疾病进行有效监测。
NFE2L2(Nuclear factor erythroid 2-like 2)基因也称为NRF2，是细胞对氧化和亲电应激保护机制的关键转录因子。文献报道在多种肿瘤中均表现为高表达，包括肺癌、乳腺癌和结肠癌，高表达的NFE2L2蛋白通过提高活性氧抑制酶和药物外流转运体在肿瘤细胞生长和化疗耐药中起着关键作用，可以看做是肿瘤标记物的一种，但由于是蛋白水平的检测无法对疾病进行有效的早期预测和诊断，如果能检测遗传背景的改变就能做到对疾病的早期预警和监测，但到目前为止没有文献报道NFE2L2基因在DNA水平的单核苷酸多态性(SNP)变异和肿瘤的易感性之间的关系。
发明内容
本发明旨在提供一种用于监测上皮性卵巢癌易感性的分子标记，并以此开发出用于监测上皮性卵巢癌易感性的试剂盒，为发现上皮性卵巢癌易感人群和上皮性卵巢癌患者进行有效的早期诊断和个性化治疗提供有效和敏感的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的遗传学分子标记作为检测靶点在制备监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒中的应用，所述遗传学分子标记的第522位存在单核苷酸多态性：T>G，即此序列的第522位的碱基包括碱基T和碱基G两种情况，相应基因型为TT、TG和GG三种型别。
当表现为碱基T时是正常的NFE2L2基因遗传状态，当表现为碱基G时是上皮性卵巢癌易感的NFE2L2基因遗传状态。
本发明前期研究发现肿瘤标记基因上的某些单核苷酸多态性位点与卵巢癌的发生存在相关性，首次报道NFE2L2基因特定位点的单核苷酸多态性和罹患上皮性卵巢癌密切相关，研究结果表明SEQ ID NO.1(rs17524059)中的522T>G位点和上皮性卵巢癌易感性存在显著关联，表现为522GG纯合子基因型个体罹患上皮性卵巢癌的风险明显提高，因此可以作为上皮性卵巢癌易感性监测和早期诊断的分子标记。
作为上述分子标记的应用，本发明提供了一种用于监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒，包括：特异性扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的遗传学分子标记中第522位的SNP位点的引物对。
针对上述NFE2L2基因特定位点的单核苷酸多态性，本发明设计并合成了一条特异性的下游PCR引物和两条特异性上游PCR引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的T、G碱基序列，分别和下游引物作PCR扩增，产物长度为174bp，根据相应配对引物扩增的PCR阳性条带判断对应碱基的基因型是纯合子还是杂合子。
同时为了提高特异性碱基检测的特异性，在设计上游引物时把上游引物的3’端倒数第二个碱基设计为与互补链相同的碱基，而不是互补的碱基，这能更好地避免非特异性PCR扩增条带的出现，保证了检测结果的高度特异性。
具体地，所述PCR上下游引物序列为：
上游引物1:5’-CCGCGCCCACAGACGGCCGC-3’(SEQ ID NO.2)；
上游引物2:5’-CCGCGCCCACAGACGGCCGA-3’(SEQ ID NO.3)；
下游引物:5’-GCTGCGCGGCTCCCCCGCCT-3’(SEQ ID NO.4)。
所述试剂盒还包含PCR反应液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTP混合液和TaqDNA聚合酶。PCR反应液中各组分之间的剂量关系为常规PCR条件下的比例，对所属领域技术人员是常规知识。
PCR反应体系组成包括：以总体积20μL计，含Mg2+的10×PCR缓冲液2μL，2.5mM的dNTP混合液8μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，100pmol的上游引物1μL，100pmol的下游引物1μL。
所述检测试剂盒还包括阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，所述阳性对照Ⅰ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的基因片段；所述阳性对照Ⅱ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段。
作为上述试剂盒的应用，本发明还提供了一种检测体外DNA样本是否存在NFE2L2基因的单核苷酸多态性的方法，具体步骤如下：
(1)提取外周血细胞中的基因组DNA作为模板，利用NFE2L2基因特异性上下游引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述NFE2L2基因特异性PCR引物为两对，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物阳性条带，根据结果，判断NFE2L2基因特定位点是否存在如下的单核苷酸多态性：522T>G，多态性位置序号基于SEQ ID NO.1碱基序列，从而确定外周血细胞中的NFE2L2基因特定位点是否存在单核苷酸多态性。
应用本发明提供的试剂盒对上皮性卵巢癌易感性个体进行罹患风险预测和诊断时，与正常的NFE2L2基因碱基进行比对，如存在差异，即存在单核苷酸多态性：522T>G，则说明该个体罹患上皮性卵巢癌的风险高于正常人群。
本发明具备的有益效果：
本发明提供了一种用于监测上皮性卵巢癌遗传易感性的检测试剂盒，试剂盒中含有基于NFE2L2基因单核苷酸多态性位点rs17524059设计的两对特异性PCR引物，NFE2L2基因单核苷酸多态性与上皮性卵巢癌易感性显著关联，利用特异性PCR扩增技术可以高效特异检测NFE2L2基因特定位点的单核苷酸多态性，该方法快速简便并且性价比和特异性高，无需特殊的DNA测序设备，便于在基层医院推广应用，这对于上皮性卵巢癌易感人群的监测，对上皮性卵巢癌进行早期预警、诊断和个体化治疗具有重要的临床意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明。以下的实施例中采用的方法目的是更好地理解本发明，但并不限于本发明。
如无特殊说明，实施例中涉及的实验方法均为常规方法，所用的实验试剂均为常规试剂公司购买。
实施例1.NFE2L2基因单核苷酸多态性检测和上皮性卵巢癌易感性的关联分析
1.1研究对象
病例选取时间为2007年7月到2012年12月，来自浙江大学医学院附属妇产科医院病理诊断明确的病例，随机选取上皮性卵巢癌病例136例，同时选取同时期325例正常体检的志愿者(女性)作正常对照，正常对照的入选标准为无其它妇科肿瘤和无其他实体癌或免疫性疾病。所有病例和正常对照个体均为汉族居民。所有受试人员均按照浙江大学医学院妇产科医院伦理委员会要求征得同意，所有的研究方法均遵循了批准的指导方针和条例。
抽取患者和正常志愿者外周抗凝血2ml左右，于-80℃冷冻保存待用。
1.2外周血细胞基因组DNA抽提
对100微升外周血进行基因组DNA的抽提和纯化(上海生工生物工程有限公司的外周血抽提试剂盒)，实验依照试剂盒的步骤说明进行，抽提所获基因组DNA溶解于去离子水并低温冷冻保存以备后续PCR检测使用。
1.3PCR反应液组成、特异性上下游引物和PCR条件
从GenBank的单核苷酸多态性(SNP)库下载NFE2L2基因的碱基序列(rs17524059)，并用在线引物设计软件Primer-BLAST进行引物设计，为了进一步提高检测单碱基的特异性，根据我们自己的设计原则和经验对上游引物3’端倒数第二位的碱基改为与互补链相同的碱基，最终确定我们自己设计的上游引物，具体引物碱基序列见表1。
表1 NFE2L2单核苷酸多态性检测用上下游引物和产物长度
PCR反应液组成：共20μL总体积，内含：PCR缓冲液，0.25mM dNTP，1.0U Taq DNApolymerase，上下游引物各5.0pmol，15ng基因组DNA。
PCR扩增反应条件：94℃5分钟，(94℃30秒，56.5℃35秒，72℃30秒)×40个循环，72℃延伸10分钟，10℃保温，产物长度为174bp。
PCR扩增产物检测：10μLPCR扩增产物加入2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离，50V电压电泳20分钟，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物配对的PCR产物电泳条带分析NFE2L2基因522位点(位置序号基于SEQ ID NO.1)的核苷酸多态性情况。
经实验检测和统计学分析，我们发现在所试样本中存在522T>G这样的单核苷酸多态性，表现为TT纯合子、TG杂合子和GG纯合子三种基因型。
1.4NFE2L2基因单核苷酸多态性基因型和上皮性卵巢癌的关联分析
以正常对照组为参考进行高危相关分析。对NFE2L2基因特定位点(rs17524059)单核苷酸多态性的基因型与上皮性卵巢癌罹患风险进行相关性分析，通过二元logistic回归分析得到比值比(Odds ratio,OR)、95％置信区间(confidence interval,CI)和P值。所有统计均为双侧显著性检验，显著性水平设为P值小于或等于0.05。所有统计分析均采用SPSS18.0软件(SPSS Inc.Chicago,USA)。
结果发现SEQ ID NO.1(rs17524059)中的522T>G和罹患上皮性卵巢癌存在显著相关性，522GG纯合子明显提高了个体罹患上皮性卵巢癌的风险，OR值达到了3.15(1.50-6.61)；522G等位基因频率风险值OR达到了1.60(1.15-2.21)，明显高于正常对照组，具体数据见表2。
表2.NFE2L2基因碱基变异关联分析及罹患上皮性卵巢癌的风险
实施例2.NFE2L2基因单核苷酸多态性和上皮性卵巢癌易感性检测试剂盒
1、基于实施例1的结果，我们发现SEQ ID NO.1(rs17524059)中的522T>G的碱基变异与罹患上皮性卵巢癌存在显著相关，因此我们设计了用于对NFE2L2基因特定位点(rs17524059)单核苷酸多态性进行检测的特异性PCR上下游引物，最终设计了对易感人群的外周血DNA模板进行检测的试剂盒。
2、制备专用试剂盒(100tests)，具体试剂组成见表3，如下：
表3.NFE2L2基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒试剂成分组成
| 试剂名称(浓度) | 试剂盒总量 |
| 10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM) | 200μL |
| dNTP Mixture(各2.5mM) | 800μL |
| Taq DNA polymerase(5U/μL) | 20μL |
| 上游引物1(SEQ ID NO.2)(100pmol) | 100μL |
| 上游引物2(SEQ ID NO.3)(100pmol) | 100μL |
| 下游引物(SEQ ID NO.4)(100pmol) | 100μL |
| 阳性对照Ⅰ(SEQ ID NO.5) | 10μL |
| 阳性对照Ⅱ(SEQ ID NO.6) | 10μL |
3、外周血细胞基因组DNA抽提制备：抽取受试者外周血1mL，采用常规酚氯仿抽提法，或者第三方外周血细胞基因组DNA抽提试剂盒，抽提得到的基因组DNA溶解于去离子水，低温保存待用。
4、单个检测PCR试剂配方，具体见表4：
表4
| 10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM) | 2μL |
| dNTP Mixture(各2.5mM) | 8μL |
| Taq DNA polymerase(5U/μL) | 0.2μL |
| 上游引物(100pmol) | 1μL(1,2中任选一) |
| 下游引物(100pmol) | 1μL |
| 总体积 | 20μL |
5、PCR扩增反应条件：
PCR反应液组成：共20μL总体积，内含：PCR缓冲液，0.25mM dNTP，1.0U Taq DNApolymerase，上下游引物各5.0pmol，15ng基因组DNA。
PCR扩增反应条件：94℃5分钟，(94℃30秒，56.5℃35秒，72℃30秒)×40个循环，72℃延伸10分钟，10℃保温，产物长度为174bp。
6、PCR扩增产物观察：10μLPCR扩增产物加入2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离，50V电压电泳20分钟，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物配对的PCR产物电泳条带分析NFE2L2基因522位点(位置序号基于SEQ ID NO.1)的核苷酸多态性情况。
与正常的NFE2L2基因碱基序列进行比对，存在差异即表明该个体罹患上皮性卵巢癌的风险高于正常人群。所述差异即存在单核苷酸多态性：522T>G。
申请人声明：在阅读本发明的上述内容之后，在具体实行检测时，对本发明做各种改动或者修整，如为本发明的等价形式替换同样落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种用于监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 609
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> variation
<222> (522)..(522)
<223> n is t or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (522)..(522)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
gctgtggagc tagggaaccg cggcccggga gggacagccg caaccggctt cccccacgtc 60
tggccagagc caggaccgcg gcgctgggta gagccgccgc gcttgcgccg gggcagggcg 120
gggaggggca gcggggacgc ggccgggtga tccgaccgac cacgagcccg agggcgaacg 180
ggtgggaagt tgcgggaagg tctggggact gagcccgctc gcgtgggcct tgggggagaa 240
tccagccgcg tccccgggcc cgagagctgg gactccggag cccctaagtt tgagcggccc 300
ggtgggcggc ggggcaagag ggggcggacg ctggccgtct gagccggcgc ggcccggccc 360
ttccggggct gcgcggctcc cccgcctcgg tgccggcaaa aatgtgccta gtcacggggc 420
cgctctcggg ggaactgagg tcgccttcgg gctgggaccc ggagcccctt cgccgcgccc 480
caagacctcc ttgagtgcgg gctgcgacgc gctcaccccg cngggccgtc tgtgggcgcg 540
gctttgcgaa gtcatccatc tctcggatca ctctctggca gccttgagct ctcttgaaag 600
cccagcccc 609
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgcgcccac agacggccgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgcgcccac agacggccga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctgcgcggc tcccccgcct 20
<210> 5
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgcgcggc tcccccgcct cggtgccggc aaaaatgtgc ctagtcacgg ggccgctctc 60
gggggaactg aggtcgcctt cgggctggga cccggagccc cttcgccgcg ccccaagacc 120
tccttgagtg cgggctgcga cgcgctcacc ccgctgggcc gtctgtgggc gcgg 174
<210> 6
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctgcgcggc tcccccgcct cggtgccggc aaaaatgtgc ctagtcacgg ggccgctctc 60
gggggaactg aggtcgcctt cgggctggga cccggagccc cttcgccgcg ccccaagacc 120
tccttgagtg cgggctgcga cgcgctcacc ccgcggggcc gtctgtgggc gcgg 174
Claims (5)
1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的遗传学分子标记作为检测靶点在制备监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述遗传学分子标记的第522位存在单核苷酸多态性：T>G，即此序列的第522位的碱基包括碱基T和碱基G两种情况。
2.一种用于监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒，其特征在于，包括：特异性扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的遗传学分子标记中第522位的SNP位点的引物对，所述引物对为两对，其中一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，另一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.如权利要求2所述的用于监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。
4.如权利要求3所述的用于监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒，PCR反应体系组成包括：以总体积20µL计，含Mg2+的10×PCR缓冲液 2µL，2.5 mM的dNTP混合液 8µL，5 U/µL的Taq DNA聚合酶 0.2µL，100 pmol的上游引物 1µL，100 pmol的下游引物 1µL。
5.如权利要求2所述的用于监测上皮性卵巢癌易感性的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，所述阳性对照Ⅰ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的基因片段；所述阳性对照Ⅱ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段。
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