CN109609479A

CN109609479A - 一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体

Info

Publication number: CN109609479A
Application number: CN201811633720.6A
Authority: CN
Inventors: 苏永君; 王婷婷; 徐雄峰; 文正; 胡博醇; 胡蝶; 李剑芳; 邬敏辰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109609479B

Abstract

本发明公开了一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体，属于酶工程和生物催化技术领域。本发明基于理性设计对宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)环氧化物水解酶(AuEH2)进行分子改造，结合基因的定点饱和突变方法，获得多个对映选择性提高的环氧化物水解酶突变体。本发明获得的9个对映选择性提高的突变体催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚(rac‑pMPGE)的对映体比率(E值)相比野生型，从12.7分别提高至32.4、31.1、27.8、25.8、23.5、22.4、20.2、14.1、13.6。

Description

一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体

技术领域

本发明涉及一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体，属于酶工程和生物催化技术领域。

背景技术

手性环氧化物和邻二醇是合成手性药物、农业、香料及精细化工等行业各种活性物质的重要中间体，具有广阔的应用前景和市场需求。光活性的手性化合物具有不同于外消旋体的独特性质，其在生物体内的代谢途径、代谢速率、药理及毒性等方面的差异，使其在化学和生命科学产业有着崭新和特殊的用途。20世纪60年代，震惊世界的“反应停事件”已经充分说明获得光学纯化合物的必要性。传统的化学法拆分环氧化物往往需要重金属类有毒物质作为催化剂，不仅面临着环境的巨大挑战，且很难获得高产率的手性纯化合物。环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应1,2- 二醇的水解酶类，是一种典型α/β折叠型水解酶。然而，不同来源的EHs的性质均存在很大的差异，自然界筛选到的具有EHs活性的微生物往往存在产酶活低、对映选择性较低及稳定性差等缺陷，往往不能满足工业化应用的需求。

目前，研究较多的微生物EH主要来自于黑曲霉(Aspergillus niger)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)、鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，这些EH对一些特定的底物具有较高的催化活性和高对映选择性。近年来，分子生物学技术，如定点突变、饱和突变、错易PCR和DNA shuffling等也用于改造EHs的催化活性、稳定性、对映选择性等性质，并通过高通量筛选获得优良突变酶。

目前已有宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)来源的环氧化物水解酶(AuEH2)在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中实现异源表达的技术方案(公开于公开号CN102994470A的专利申请中)，该环氧化物水解酶可对映选择性水解动力学催化多种环氧化物制备高光学纯的手性环氧化物 (J Ind Microbiol Biotechnol,2015，42(5):671-680)。但该重组酶对环氧化物的对映选择性并不高，从而限制了其在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺陷，本发明要解决的第一个技术问题是提供一种对映选择性提高的环氧化物水解酶(AuEH2)突变体，所述突变体是(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，将第250位丙氨酸(A)突变为组氨酸(H)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、或脯氨酸(P)；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述AuEH2突变体的基因工程菌，以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主，表达所述环氧化物水解酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主是E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将编码所述突变体的基因与载体连接，转化至宿主细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述携带编码宇佐美曲霉AuEH2的基因的重组质粒是携带编码宇佐美曲霉AuEH2的基因的pET-28a(+)，该重组质粒已公开于公开号CN102994470A的专利申请中。

本发明的第六个目的是提供制备所述AuEH2突变体的方法，是将表达所述AuEH2突变体的基因工程菌种子液以含卡那霉素抗性的LB培养基培养至对数中后期，加入IPTG诱导重组基因的高效表达AuEH2突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，在 25～28℃条件下IPTG诱导6～8h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，在25℃条件下IPTG诱导8h。

本发明还提供一种应用所述AuEH2突变体生产(R)-对甲基苯基缩水甘油醚的方法，是以所述突变体或表达所述突变体的基因工程菌为催化剂，在缓冲体系中催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚生成(R)-对甲基苯基缩水甘油醚。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲体系可以是单水相或者水相与有机相构成的双相体系。

在本发明的一种实施方式中，所述AuEH2突变体以0.4～1mg菌体/mM对甲基苯基缩水甘油醚的添加量加入至反应体系中。

在本发明的一种实施方式中，所述转化条件是在20～28℃，反应5～40min。

本发明还要求保护所述突变体在制备含(R)-对甲基苯基缩水甘油醚的产品中的应用。

有益效果：本发明基于理性设计对宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)环氧化物水解酶(AuEH2)进行分子改造，结合基因的定点饱和突变方法，获得多个对映选择性提高的环氧化物水解酶突变体。本发明获得的9个对映选择性提高的突变体：AuEH2^A250H、AuEH2^A250R、AuEH2^A250G、AuEH2^A250K、AuEH2^A250N、AuEH2^A250D、AuEH2^A250E、AuEH2^A250Q和AuEH2^A250P催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚(rac-pMPGE)的对映体比率(E值)分别为32.4、31.1、 27.8、25.8、23.5、22.4、20.2、14.1、13.6。应用所述AuEH2突变体水解动力学拆分外消旋对甲基苯基缩水甘油醚生产(R)-对甲基苯基缩水甘油醚的对映体过量率(ee值)>99％。该发明提供的突变体高对映选择性的特点，有利于提高其催化产物手性环氧化物和邻二醇的对映纯度和产率，从而降低生产成本，具有较大应用潜力。

附图说明

图1为AuEH2(WT)与AuEH2突变体的酶活比较。

图2位AuEH2(WT)与AuEH2突变体对映体比率(E)。

具体实施方式

(R,S)-pMPGE购自上海TCI公司；(S)-pMPGE和(R)-pMPGE购自上海安耐吉公司；其他试剂均为分析纯。手性液相色谱柱0D-H(4.6mm×250mm×5μm)为美国Waters科技公司产品。

分析条件为：手性柱OD-H，色谱条件90:10,220nm，(R)-对甲基苯基缩水甘油醚和(S)- 对甲基苯基缩水甘油醚的保留时间分别为7.556和8.811min。底物e.e._s＝[(R-S)/(R+S)]× 100％；产物e.e._p＝[(S-R)/(R+S)]×100％；E＝ln[(1-e.e._s)×(1+e.e._s/e.e._p)]/ln[(1+e.e._s)/(1+e.e._s/ e.e._p)]。其中：R和S表示(R)-和(S)-对甲基苯基缩水甘油醚。

实施例1：定点饱和突变

(1)以重组质粒pET-28a(+)-Aueh2(构建方法参见专利公开号CN102994470A的专利申请)为模板，A250X-F和pET28-R为引物，利用PrimeSTAR DNA聚合酶(购自TaKaRa)进行第一轮PCR扩增(95℃4min；98℃10s，55℃5s，72℃3min，30个循环；72℃10min)获得一段大引物A250X-1st；以大引物A250X-1st作为引物，重组质粒pET-28a(+)-Aueh2为模板进行第二轮PCR扩增(95℃4min；98℃10s，55℃15s，72℃3min，25个循环；72℃10 min)；A250X-2stPCR产物经Dpn I消化(25℃,过夜)模板pET-28a(+)-Aueh2后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板37℃培养12-16h，获得重组子文库。

A250X-F：

pET28-R：GCCTTACTGGTTAGCAGAATG

其中N代表A、T、C和G任意碱基，K代表T或G碱基，该简便并密码子可编码随机 20种氨基酸，只需筛选94个重组子可包含>95％的覆盖率。

(2)挑取上述LB平板96个单菌落于卡那霉素抗性LB培养基中37℃培养12h，一部分培养液加20％(v/v)甘油保种，-80℃保藏，另一部分培养液以2％的接种量转接至新鲜的装有含卡那霉素抗性1mL LB培养基的96孔的深孔板中，37℃条件下培养2h后，加入0.2mMIPTG诱导剂25℃培养8h，诱导重组基因的高效表达，重组细胞经8 000rpm，5min离心收集菌体，-80℃保藏。以同样诱导方法获得E.coli/pET-28a(+)-Aueh2重组菌体作为阳性对照，E.coli/pET-28a重组菌体作为空白对照。

(3)将获得的重组菌体加入1mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)悬浮，500μL菌悬液用于催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚，采用硝基苄基吡啶(NBP)的分光光度法进行酶活性进行初步筛选,获得36个具有环氧化物水解酶活性的突变子(结果如图1所示)。

实施例2

采用手性液相色谱测定实施例1制备的36个突变子的对映选择性。将实施例1制备的具有环氧化物水解酶突变子的菌悬液离心，收集菌体。在1.5mL EP管中加入5mg湿菌体和900 μL磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，25℃保温10min，再加入100μL rac-pMPGE(终浓度20mmol/L) 进行反应。定时取样100μL至1mL乙酸乙酯中萃取，样品分析采用液相色谱仪Waters-2695 (美国Waters公司)、手性液相色谱柱和紫外检测器。

结果如图2所示。突变体AuEH2^A250H、AuEH2^A250R、AuEH2^A250G、AuEH2^A250K、AuEH2^A250N、AuEH2^A250D、AuEH2^A250E、AuEH2^A250Q和AuEH2^A250P催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚 (rac-pTO)的对映体比率(E值)从12.7分别提高至32.4、31.1、27.8、25.8、23.5、22.4、20.2、 14.1、13.6。其中，AuEH2^A250E与出发酶相比，酶活提高了13％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 395

<212> PRT

<213> 宇佐美曲霉

<400> 1

Met Ala Leu Ala Tyr Ser Asn Ile Pro Leu Gly Ala Thr Val Ile Pro

1 5 10 15

Ser Pro Phe Gln Val His Ile Ser Asp Glu Gln Ile Glu Glu Leu Gln

20 25 30

Leu Leu Val Lys Leu Ser Lys Leu Ala Pro Pro Thr Tyr Glu Gly Leu

35 40 45

Gln Gln Asp Arg Arg Tyr Gly Ile Thr Asn Glu Trp Leu Ala Asn Ala

50 55 60

Lys Glu Ala Trp Lys Ser Phe Asp Trp Arg Pro Ala Glu Ser Arg Ile

65 70 75 80

Asn Ser Phe Pro Gln Phe Thr Tyr Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile His

85 90 95

Phe Val Ala Leu Phe Ser Glu Lys Lys Asp Ala Ile Pro Ile Val Leu

100 105 110

Leu His Gly Trp Pro Gly Ser Phe Leu Glu Phe Leu Pro Val Leu Thr

115 120 125

Ser Ile Arg Asp Lys Tyr Ser Pro Glu Thr Leu Pro Tyr His Ile Val

130 135 140

Val Pro Ser Leu Pro Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Gly Pro Pro Leu Asp

145 150 155 160

Val Asn Phe Asn Gly Glu Asp Thr Ala Arg Val Ile Asn Lys Val Met

165 170 175

Leu Asn Leu Gly Phe Glu Asp Gly Tyr Val Ala Gln Gly Gly Asp Ile

180 185 190

Gly Ser Lys Ile Gly Arg Ile Leu Ala Val Asp His Asp Ala Cys Lys

195 200 205

Ala Val His Leu Asn Ala Cys Tyr Met Gly Lys Pro Ser Ser Ile Pro

210 215 220

Asp Thr Ala Ile Thr Glu Glu Asp Lys Arg Ala Leu Ala Arg Ala Gln

225 230 235 240

Trp Phe Ala Thr Phe Gly Ser Gly Tyr Ala Val Glu His Gly Thr Arg

245 250 255

Pro Ser Thr Ile Gly Asn Ala Leu Ser Thr Ser Pro Val Ala Leu Leu

260 265 270

Ser Trp Ile Gly Glu Lys Phe Leu Asp Trp Ala Gly Glu Thr Ile Pro

275 280 285

Leu Glu Thr Ile Leu Glu Ser Val Thr Leu Tyr Trp Phe Thr Glu Thr

290 295 300

Phe Pro Arg Ser Ile Tyr His Tyr Arg Glu Asn Phe Pro Pro Pro Lys

305 310 315 320

Leu Arg His Thr Glu Asp Pro Arg Trp Tyr Ile Arg Lys Pro Phe Gly

325 330 335

Phe Ser Tyr Tyr Pro Met Glu Leu Val Pro Thr Pro Arg Ala Trp Val

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Asn Leu Val Phe Trp Gln Ala His Glu Lys Gly Gly

355 360 365

His Phe Ala Ala Leu Glu Arg Pro Gln Asp Tyr Leu Asp Asp Leu Thr

370 375 380

Ala Phe Cys Glu Gln Val Trp Ala Gly Arg Lys

385 390 395

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

tttggcagtg gttacnnkgt cgagcatggt ac 32

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccttactgg ttagcagaat g 21

Claims

1.一种对映选择性提高的环氧化物水解酶AuEH2突变体，其特征在于，所述突变体是(a)或(b)：

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或表达权利要求1所述突变体的细胞。

4.一种基因工程菌，其特征在于，以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述环氧化物水解酶AuEH2突变体。

5.含有权利要求1所述环氧化物水解酶AuEH2突变体或权利要求3所述细胞的组合物。

6.一种制备权利要求1所述AuEH2突变体的方法，其特征在于，培养权利要求4所述的基因工程菌，在25～28℃条件下IPTG诱导6～8h。

7.一种生产(R)-对甲基苯基缩水甘油醚的方法，其特征在于，以权利要求1所述的突变体或权利要求4所述的基因工程菌，或权利要求5所述的组合物为催化剂，在缓冲体系中催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系为单水相或者水相与有机相构成的双相体系。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，AuEH2突变体以0.4～1mg菌体/mM对甲基苯基缩水甘油醚的添加量加入至反应体系中。

10.权利要求1所述的AuEH2突变体在手性生物催化方面的应用。