CN109609467A - 一种cv-a6病毒毒种及其人用灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种CV‑A6病毒毒种及其人用灭活疫苗；毒种的分类命名为柯萨奇病毒A组6型，保藏编号为CGMCC No.16217，所制成的人用CV‑A6灭活疫苗的组成为：CV‑A6灭活纯化抗原100μg/ml，氢氧化铝1mg/ml。经动物实验该疫苗制品具有良好的免疫原和安全性。

Description

一种CV-A6病毒毒种及其人用灭活疫苗

技术领域

本发明涉及一种CV-A6病毒毒种及其人用灭活疫苗。

背景技术

手足口病（hand foot mouth disease, HFMD）在全球，尤其是亚太地区，流行规模和威胁影响日益增加，而且值得注意的是，这个疾病对儿童群体的危害日益加重的过程。迄今为止，在我国的流行病学统计表明，该病自2008年被列为丙类传染病以来，已经于2009年即成为丙类传染病发病人数之首，总体病死率约为0.05%。该传染病的防控，尤其在儿童群体中的防控，已成为一个重要的公共卫生问题。

近年来CV-A6（柯萨奇病毒A组6型）感染引起HFMD爆发或流行的趋势不断增加，有些地区已成为除肠道病毒71型（EV-A71）和CV-A16以外的主要HFMD的病原体，并且与多种其它肠道病毒包括EV-A71与CV-A16出现交替循环、混合感染的现象。这凸显了控制HFMD流行的艰巨性。

目前国内外除EV-A71疫苗外，尚无其它的特效药物治疗HFMD，而疫苗是其主要预防手段。自2008年我国HFMD大流行后，HFMD已成为我国严重的的疾病负担，疫苗成为控制疾病的急需品种，历经七年的研发工作后，EV71疫苗获得批准用于手足口病的防治。为解决EV71疫苗难以控制CV-A16及CV-A6等其它肠道病毒引起HFMD的流行，以及可能由此引发的EV-A71疫苗公众接受和质疑问题，提出研发以EV-A71、CV-A16为核心，增加CV-A6等肠道病毒为主要成分的联合HFMD疫苗的必要性。目前CV-A16疫苗正在研发中，对CV-A6疫苗的研发尚缺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上所述缺陷，提供一种CV-A6病毒毒种及其筛选方法，以及以CV-A6病毒毒种制备的安全有效的人用CV-A6灭活疫苗。

为了解决以上所述技术问题，本发明所述CV-A6病毒毒种，其分类命名为柯萨奇病毒A组6型，保藏编号为CGMCC No.16217, 该病毒毒种取名为YNKA1205；所述CV-A6病毒的毒种的制备方法包括以下步骤：

（1）分离CV-A6病毒株

取手足口病重症儿童病人粪便1g加5ml生理盐水，悬浮3000xg离心30min，上清液经无菌过滤后，接种于RD细胞（即人恶性胚胎横纹肌瘤细胞），3-5天病变后，继续在RD细胞传代3代，并经RT-PCR和测序获得该病毒全基因组序列及推测的氨基酸序列，该病毒株的基因型为D3，与目前中国流行株的CV-A6的基因型一致；

（2）毒株病毒在KMB17细胞上的适应

挑选已长成致密单层的P28代KMB17细胞，弃旧培养液（指MEM），用PBS溶液清洗细胞表面，加入0.125% 胰蛋白酶消化细胞，待轻拍细胞瓶，细胞从瓶壁流沙样滑下，加入细胞培养液，按2×10⁵细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将步骤（1）所得CV-A6病毒200μl接种于细胞面，37℃吸附1小时，随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变情况，病毒达90%收获病毒，冻存备用；

（3）病毒毒株的克隆纯化

在KMB17细胞上已适应传代到第5代次的CV-A6病毒收获液，用病毒稀释液稀释至10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度，接种于已形成单层的KMB17细胞六孔培养板，37℃吸附1小时，加入不含小牛血清的病毒维持液，48小时后去除培养液，加入含0.8%琼脂糖-MEM，待琼脂固化后，倒置于37℃培养，3天后于镜下观察蚀斑，用枪头吸取出蚀斑，置于1.5ml离心管，加入0.5mlMEM 维持液，漩涡振荡，随即接种于单层KMB17细胞，37℃培养3～4天，待细胞病变后收获病毒，同样方法再进行两次蚀斑纯化，获得经鉴定为CV-A6的纯化克隆株；所述纯化克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子，继续传3代即作为主种子，随后再传3代即为工作种子；此原始种子、主种子和工作种子即为CV-A6病毒毒种；

（4）对步骤（3）所得原始种子、主种子和工作种子的毒种分别进行鉴定，表明所述毒种均具有良好的免疫原性、遗传稳定性和在KMB17细胞上良好适应增殖能力。

本发明所述YNKA1205毒种的鉴定方法：

（1）YNKA1205毒株病毒感染性滴度测定

毒种进行10倍系列稀释（即10^-1，10^-2…….10^-8），每个稀释度加8个孔，每孔100μl，按含2×10⁵个/ml RD细胞，每孔100μl细胞悬液加至每个稀释度8孔，37℃培养5～7天，观察结果。

（2）RT-PCR和测序

病毒基因组的核酸提取按Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit操作手册进行，病毒基因RNA 逆转录采用TaKaRa公司生产的One-step RNA PCR kit (AMV)试剂盒，按操作手册进行，并根据“移步法”进行测序，测序后通过NCBI BLAST中比对，该核苷酸序列与CV-A6的同源性为75%，根据分型标准，可判断该病毒为CV-A6。

（3）不同代次毒株病毒基因组稳定性及序列比较

病毒通过在KMB17细胞传代培养，收获P1代次至P15代次的病毒收获液，病毒基因组的核酸提取按Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit提取试剂盒操作手册进行，根据CV-A6病毒基因序列设计合成针对5’非编码区基因和3’非编码基因的引物以及VP1基因两对引物，病毒基因RNA逆转录使用TaKaRa公司生产的One-step RNA PCR kit (AMV)试剂盒，按操作手册进行，根据“移步法”进行测序后，使用MEGA 软件对不同代次的全基组序列进行比较，其基准序列使用本实验室对该分离毒株接种KMB17并适应的第2代所获取的全基因序列，并比较2、5、10和15代病毒的基因序列,发现它们之间的核苷酸和氨基酸序列的同源分别高达99.6%和100%，这提示该毒株遗传稳定性较佳。

本发明所述CV-A6病毒毒种制备的人用CV-A6灭活疫苗，包括以下成分：CV-A6抗原100μg/ml，氢氧化铝1mg/ml；所述人用CV-A6灭活疫苗的制备方法如下：

（1）该病毒株接种于人二倍体细胞株KMB17，经适应后，并在KMB17细胞上通过三次蚀斑纯化，获得经鉴定为CV-A6的克隆株。该克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子，继续传3代即作为主种子，随后再传3代即为工作种子。

（2）对原始种子、主种子和工作种子的毒种分别进行鉴别实验、一步生长实验、滴度、无菌、支原体和免疫原性等检测，均表明具有良好的免疫原性以及在KMB17细胞上具有良好适应增殖能力。

（3）根据KMB17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB17细胞，弃培养液，用PBS溶液清洗细胞面，弃洗液。

（4）在KMB17细胞的细胞面中接种0.01MOI的病毒工作种子，混匀后放置37℃,30min，加入一定量不含血清的病毒维持液（根据培养瓶的大小决定所加的量），于37℃ 3-5天，病毒CPE（细胞病变效应）达90%以上收获病毒液。

（5）将所述病毒收获液按1:4000加入甲醛于37℃ 3天或所述病毒收获液按1:2000加入β-丙内酯于4℃ 2天灭活病毒，经超滤浓缩至原体积的5%，经纯化得纯化液，经鉴定所述纯化液的纯度高于96%，采用Lowry法测定其蛋白浓度不低于95%；

（6）将上述纯化液过滤除菌后，用PBS溶液调至100μg/ml，氢氧化铝1mg/ml，即得CV-A6灭活疫苗成品。

目前疫苗主要形式为减毒疫苗和灭活疫苗两种，但减毒疫苗存在毒力回复返祖及可引发疫苗相关疾病，而灭活疫苗则可克服此缺点。本发明除了筛选出一株免疫原性和安全性较好毒株外，所采用的细胞基质——KMB17，作为病毒疫苗生产载体也非常关键。目前用于人用疫苗的细胞基质主要为非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和人胚肺的二培体细胞，如2BS和KMB17。作为人用疫苗，选择来源于人的细胞作为其生产的细胞基质，不仅能够提供良好的品质，而且具有更好的安全性。因此，本发明所述的CV-A6为分离于CV-A6感染重症儿童的分离株，不仅在人源细胞KMB17具有较好增殖和适应能力，而且在小鼠上也能产生良好的免疫原性。KMB17是申请人单位特有的人源来源和已批准人用疫苗生产细胞基质。另外选用目前我国主要流行CV-A6病毒的基因型中D3亚型毒株为疫苗毒株，使疫苗更具有针对性，免疫效果更佳。

在本发明所述CV-A6病毒分离和培养方法中，通过改良传统CV-A6病毒分离和培养方法，采用不含小牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，增加CV- A 6培养效率。

本发明所述CV-A6毒种毒株YNKA1205于2018 年08 月20 日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：CGMCC No.16217 ，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

与现有技术比较，本发明具有以下特点：

1.提供一种可用于人CV-A6灭活疫苗的毒种，目前尚无疫苗上市；

2.提供一种以KMB17人源二培体细胞为细胞基质制备CV-A6灭活疫苗方法，实验表明该疫苗具有良好的免疫性和安全性；

3．在本发明的CV-A6病毒分离和培养方法中，通过改良传统CV-A6病毒分离采用悬浮培养方法，而在病毒培养采用不含小牛血清的病毒维持液，增加CV-A6分离和灭活疫苗生产效率。

附图说明

图1 a为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞产生病变形态（种毒后24h）；

图1b为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞产生病变形态（种毒后48h）；

图1c为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞产生病变形态（种毒后72h）；

图1d为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞产生病变形态（种毒后96h）；

图2为 CV-A6毒种YNKA1205在KMB17细胞上形成的蚀斑（箭头所指为形成的蚀斑）；

图3 为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞上一步生长曲线；

图4为所述原始种子、主种子和工作种子的中和抗体效价。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一：本发明所涉及毒株的分离、适应和纯化方法

（1）获取病毒样本

收集医院儿科鉴定为CV-A6感染的手足口病患***物标本，取1g粪便重悬于5mL生理盐水中，3000g离心30分钟取上清液，并使用0.45μm滤器（购自Millipore 公司）过滤，-20℃保存备用。

（2）病毒在RD细胞上的适应

挑选已长成致密单层的RD细胞，弃旧培养液，用适量PBS溶液清洗细胞表面，加入适量0.125% 胰蛋白酶消化细胞，待轻拍细胞瓶，细胞从瓶壁流沙样滑下，加入细胞培养液，按2ml每孔接种24孔板，将已过滤样品200μl接种于细胞面，37℃培养3～4天后，观察细胞病变情况病毒CPE达90%以上收获病毒，冻存备用。该CV-A6分离方法通过改良传统CV-A病毒分离方法，采用3000g离心30分钟取上清液，获得较高的病毒回收得率和除杂效果，以及悬浮培养，以增加病毒分离效率。

（3）病毒在KMB17细胞上的适应

挑选已长成致密单层的P23代KMB17细胞，弃旧培养液，用适量PBS溶液清洗细胞表面，加入适量0.125% 胰蛋白酶消化细胞，待轻拍细胞瓶，细胞从瓶壁流沙样滑下，加入细胞培养液，按2×10⁵细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将CV-A6病毒200μl接种于细胞面，37℃吸附1小时，随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变情况病毒CPE达90%收获病毒，冻存备用。该CV-A6培养和适应方法通过改良的培养方法，在KMB17细胞适应中采用不含小牛血清的病毒维持液，37℃培养并观察细胞病变，以改善了CV-A6培养效率。

（4）病毒毒株的克隆纯化

在KMB17细胞上已适应传代到第5代次的CV-A6病毒收获液，稀释至10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度，接种于已形成单层的KMB17细胞六孔培养板，37℃吸附1小时，加入不含小牛血清的病毒维持液，48小时后去除培养液，加入含0.8%琼脂糖-MEM，待琼脂固化后，倒置于37℃培养，3天后于镜下观察蚀斑，用枪头吸取出蚀斑，置于1.5ml 离心管，加入0.5mlMEM 维持液，漩涡振荡，随即接种于KMB17细胞单层，37℃培养3～4天，待细胞病变后收获病毒，收获病毒继续接种于KMB17细胞生长传代。

（5）毒种制备

将经鉴定为CV-A6的克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子，继续传3代即作为主种子，随后再传2代即为工作种子。

实施例二： CV-A6毒株YNKA1205的培养及疫苗制备方法

（1）病毒在KMB17细胞培养

挑选已长成致密单层的P28代KMB17细胞，弃旧培养液，用适量PBS溶液清洗细胞表面，加入适量0.125% 胰蛋白酶消化细胞，待轻拍细胞瓶，细胞从瓶壁流沙样滑下，加入细胞培养液，按2×10⁵细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将CV-A6病毒200μl接种于细胞面，37℃吸附1小时，随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变情况病毒CPE达90%收获病毒，冻存备用。附图1a-1d为 CV-A6 毒株在KMB17细胞产生病变形态（培养4 天），接种第二天即开始发生细胞病变，第三天细胞病变效应即可到达90%。

（2）病毒滴度测定

毒种进行10倍系列稀释，每个稀释度加8个孔，每孔100μl，按含2×10⁵个/mlRD细胞，每孔100μl细胞悬液加至每个稀释度8孔， 37℃培养5～7天，观察结果，结果计算按Reed-Muench Method公式计算；该毒种的感染性滴度可达到7.25-75CCID₅₀/L。图3为 CV-A6在KMB17细胞上一步生长曲线，在第三日，即到达对数生长期，感染性滴度达到最高7.25CCID₅₀/L。

（3）病毒纯化

病毒收获液按1:4000加入甲醛，37℃3天灭活病毒，经超滤浓缩至原体积的5%，层析柱纯化，经电泳、HPLC鉴定病毒纯化液的纯度高于96%，采用Lowry法测定其蛋白浓度。

（4）成品制备

将上述纯化液过滤除菌后，用PBS溶液调至100μg/ml，氢氧化铝1mg/ml，该产品即为所需的CV-A6灭活疫苗成品。

实施例三：毒种的鉴定方法

（1）无菌检查及支原体检测实验

取硫乙醇酸盐流体培养基4支，胰酪大豆胨液体培养基2支，每支接种0.5 ml病毒。接种后的硫乙醇酸盐流体培养基2支30～35℃培养；硫乙醇酸盐流体培养基2支和胰酪大豆胨液体培养基2支置20～25℃培养；同时以病毒培养液同法操作作为阴性对照。培养14天后判定结果。取支原体检查用半固体培养基及肉汤培养基各4支，半固体培养基煮沸融化，冷却至56℃。两种培养基每支均加入预先以4：1比例混合的灭能小牛血清和双抗混合液2.5ml，迅速摇匀，然后每支培养基各加入待检样本0.5ml作原代培养，于35℃培养观察。至第7天时，两种原代培养基各取出2支转种，每支培养基各转种同种培养基2支，0.5ml/支，于35℃培养观察至21天；原代继续培养观察至21天。

（2）病毒致病性观察

取出生后1-2天的小鼠脑内接种10⁵CCID₅₀病毒量。每天观察2次，并记录临床出现的麻痹死亡情况。共观察14天。在24小时内出现的因注射损伤致麻痹或死亡者作无效小鼠予以删除。根据临床观察结果，计算4项指标进行评价：(1)半数致麻痹剂量(PD₅₀)；(2)半数致死剂量(LD₅₀)，按Spearman-karber法计算；(3)平均临床记分(MCS)。按3个分值计算：0分表示观察期间无麻痹样症状；1分表示曾出现麻痹,但仍能存活至到期；2分表示死亡或严重麻痹需中途处死。(4)平均临床症状出现日(MFT)。指注射样品后到第1次出现临床麻痹症状的日。

（3）鉴别实验

病毒基因组的核酸提取按Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit操作手册进行，病毒基因RNA 逆转录采用TaKaRa公司生产的One-step RNA PCR kit (AMV)试剂盒，按操作手册进行，测序后通过NCBI BLAST中比对，该核苷酸序列与CV-A6的的同源性为75%，根据分型标准，可判断该病毒为CV-A6。

（4）不同代次毒株病毒基因组稳定性及序列比较。

病毒通过在KMB17细胞传代培养，收获P1 代次至P15代次的病毒收获液，病毒基因组的核酸提取按Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit提取试剂盒操作手册进行，根据CV-A6病毒基因序列设计合成针对5’非编码区基因和3’非编码基因的引物以及VP1基因两对引物，病毒基因RNA逆转录使用TaKaRa公司生产的One-step RNA PCR kit(AMV)试剂盒，按操作手册进行，根据“移步法”进行测序后，使用MEGA 软件对不同代次的全基组序列进行比较，其基准序列使用本实验室对该分离毒株接种KMB17并适应的第2代所获取的全基因序列，并比较2、5、10和15代病毒的基因序列。

实施例四：灭活疫苗的免疫学检测

（1）获得精制的病毒纯化液后，选用试剂盒对其病毒抗原含量定量检测或蛋白定量后，设定系列稀释的免疫剂量组，腹腔注射、免疫接种小鼠，在2、4、6、8周检测中和抗体，比较、评价免疫原性及抗原性。

（2）中和抗体效价的检测：将病毒稀释至100CCID₅₀／ml与等量的1:4，1：8，1：16，1：32,1：64和1:128免疫血清等量混合后，置37℃水浴60分钟，接种RD细胞，,35℃培养5～7天判定结果。无细胞病变为阳性；同时设血清和细胞对照均为阴性。

（3）实验苗免疫观察组

接种疫苗后二周、四周检测其抗体水平，如有必要四周后加强免疫一次，定期检测抗体效价，评价抗体应答的动态变化特征。

（4）母传抗体乳鼠保护试验组

根据实验需要设计剂量分组，分组免疫，每组免疫成年小鼠雌鼠4只，雄鼠2只，隔开饲养，初免四周后，进行加强免疫，二免一周后，雌鼠4只，雄鼠2只配窝饲养，待雌鼠产下乳鼠后，采用致死病毒剂量LD50脑内注射一日龄乳鼠，观察、记录临床出现的麻痹死亡情况，评价母传抗体乳鼠保护效应。结果表明母传抗体能保护乳鼠免于感染CV-A6病毒。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> CV-A6病毒毒株YNKA1205全基因组序列

<130> PCT/CN2018/111833

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7442

<212> DNA

<213> coxsackievirus A6

<400> 1

TTAAAACAGCCCTGTGGGTTGTACCCACCCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACACTGATTCTATGGAATCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTTCCCCAAAACTGTAACTTAGAAGAATATCACACTACCGATCAATAGCAGGCATGGCGCGCCAGTCATGTCTAGATCAAGCACTTCTGTCTCCCCGGATTGAGTATCAATAGACTGCTAGCGCGGTTGAAGGAGAAAACGTCCGTTACCCGGCTAACTACTTCGAGAAACTTAGTAGCACCATTGAAGCTGCGGAGTGTTTCGCTCAGCACTCTCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACTGCACTCCCCACGGGCGACCGTGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCTATGGGGCAACCCATAGGACGCTCTAAAGTGGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCCCTCAATCCAGGGGGTGGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTTTTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCAGTGACAAACAGAGCTTTGATATACTTGTTCGTGGGTTTCGTTCCACTCATCAGTCGTACAGTTCATACTTTAAAGTACATTCTGATTCTGAACAATAGAAAATGGGCGCCCAAGTTTCAACAGAAAAATCTGGGTCGCACGAGACAAAGAATGTAGCGACCGAAGGGTCTACTATCAACTTCACCAACATTAATTACTATAAGGATTCTTATGCAGCGTCAGCTAGTAAACAGGACTTTGCACAAGATCCTGCAAAGTTCACACGCCCTGTCTTGGATACCATCAGGGAGGTTGCAGCCCCCTTGCAATCCCCTTCTGTTGAGGCGTGCGGTTATAGTGACCGAGTCGCACAGTTGACTGTGGGCAACTCAACCATTACTACCCAAGAGGCAGCCAACATTGTGTTGAGTTACGGAGAGTGGCCAGAATATTGTCCCTCCACGGACGCTACAGCTGTGGACAAACCTACTCGCCCTGACGTGTCAGTAAATAGGTTCTACACACTGTCAACTAAGAGTTGGAAGACAGAATCTACTGGCTGGTACTGGAAATTCCCTGATGTGCTAAACGACACAGGAGTGTTCGGTCAAAACGCCCAATTCCACTACTTGTACCGCTCGGGTTTCTGCATGCACGTTCAGTGCAATGCAAGCAAGTTCCATCAGGGGGCCCTCTTAGTGGCTGCAATCCCCGAGTTTGTGATTGCTGCAAGCAGCCCTCCCGCGAAGCCTAATGGACGAGGGTTATACCCAGATTTCACTCACACTAACCCAGGTAAAAATGGCCAAGAGTTTCGAGATCCTTATGTCTTGGATGCTGGTGTCCCCCTAAGTCAAGCACTGGTTTACCCCCATCAATGGATCAATCTACGAACTAATAACTGCGCGACCATCATCATGCCCTATGTCAATGCGCTTCCATTTGATTCGGCGCTTAACCACTCAAATTTTGGATTGGTTGTGATCCCTATTAGCCCTTTAAAATATTGTAATGGAGCTACCACAGAGGTGCCAATCACACTAACTATTGCCCCACTTAACTCGGAGTTTAGCGGCCTCCGACAAGCAATAAAACAAGGGTTTCCCACAGAGCTTAAGCCTGGGACCAATCAATTTCTTACAACTGACGACGGGACATCCCCACCAATACTGCCCGGTTTTGAACCAACTCCATTGATTCACATTCCTGGCGAGTTCACTTCTTTGTTAGATTTGTGCCAAATAGAAACCATACTAGAAGTCAATAATACCACTGGCACCACCGGGGTCAATAGATTACTAATCCCCGTTCGAGCACAGAACAATGTGGACCAGTTGTGCGCATCATTCCAAGTAGACCCTGGGCGCAATGGCCCGTGGCAATCCACAATGGTCGGTCAGATCTGCAGGTATTACACTCAATGGTCAGGTTCTCTTAAGGTAACCTTTATGTTCACGGGTTCTTTTATGGCCACAGGGAAAATGCTGATAGCCTACACACCACCTGGTAGTGCTCAGCCCGCTACAAGGGAAGCAGCAATGCTTGGGACTCATATAGTGTGGGATTTTGGTTTGCAATCATCGGTTACCCTAGTTATACCTTGGATTAGTAATACTCATTTTAGAGCAGTTAAGACTGGAGGGGTATATGACTACTACGCAACCGGGATTGTCACCATTTGGTACCAAACCAACTTTGTAGTGCCACCAGACACCCCCACTGAGGCTAATATTATAGCTCTTGGAGCAGCACAGAAAAACTTTACTCTAAAGTTGTGCAAGGACACTGACGAGATCCAGCAAACAGCAGAGTACCAAAATGATCCCATTACAAATGCAGTGGAAAGCGCTGTGAGCGCGCTTGCTGACACCACAATATCCCGGGTGACCGCAGCTAACACTGCAGCTAGCACCCACTCCCTGGGAACAGGGCGTGTACCAGCATTGCAAGCCGCAGAAACGGGAGCAAGCTCTAATGCTAGTGATGAGAACCTTATTGAGACTCGCTGTGTGATGAATCGAAACGGGGTTAATGAGGCGAGTGTGGAACACTTTTACTCTCGTGCAGGGCTGGTAGGAGTTGTGGAGGTGAAGGACTCGGGCACTAGCCCGGATGGGTACACAGTCTGGCCCATAGATGTGATGGGCTTCGTGCAACAGCGGCGCAAGCTAGAGCTGTCAACATACATGCGCTTTGATGCCGAGTTCACTTTTGTGTCCAACCTCAGTGACAGTACGACGCCCGGGATGCTGCTGCAGTATATGTATGTACCACCAGGGGCTCCTAAGCCGGATAGCAGGAAATCATATCAATGGCAGACTGCTACTAACCCGTCGGTATTTGCAAAATTGAGAGATCCACCCCCCCAGGTATCTGTTCCGTTCATGTCGCCAGCAACAGCTTATCAGTGGTTTTATGATGGTTACCCTACATTTGGTGAGCACAAACAAGCTACCAATTTGCAATATGGGCAGTGTCCTAATAACATGATGGGCCATTTTGCCATCCGAACAGTTAGTGAATCTACCACCGGGAGAAACGTCCACGTTCGGGTGTACATGAGAATTAAGCACGTGAGAGCTTGGGTACCTAGACCCCTTCGATCCCAAGCTTATATGGTCAAGAACTACCCGACATACAGCCAAACAATAACTAACACTGCAACTGACCGTGCAAGCATAACCACCACGGATTATGAAGGCGGGATACCAGCAAACCCACAAAGGACATTTGGTAGGTTTGGCCAACAGTCCGGGGCTATCTATGTAGGTAACTTCAGAGTGGTGAACCGACACCTCGCCACTCATAATGATTGGGCAAATCTAGTATGGGAAAGTAGCTCACGAGATCTTCTGGTGTCCTCCACCACTGCTCAGGGATGTGATACCATTGCCCGATGTGATTGTCAAACAGGAGTGTATTACTGCAACTCTAGAAGGAAACACTACCCGGTTAGTTTTTCTAAGCCTAGCCTCGTCTTCGTGGAAGCTAGTGAGTATTACCCTGCCAGGTATCAGTCGCACCTCATGCTTGCGAAGGGACATTCTGAACCCGGGGACTGTGGTGGCATTCTTAGGTGCCAACATGGCGTGATTGGTATCGTGTCCACTGGTGGTAATGGACTTGTCGGATTTGCAGATGTCAGAGATCTTTTGTGGCTGGATGAAGAAGCTATGGAACAGGGTGTGTCAGATTACATCAAAGGGCTTGGTGACGCATTCGGAACTGGTTTTACTGATGCAGTGTCTAGGGAGGTGGAGGCTCTTAAGAACTACCTTATAGGATCTGAAGGGGCTGTTGAAAAGATCTTGAAGAATTTAATTAAATTGATCTCAGCATTAGTCATAGTGATCAGAAGTGATTATGACATGGTAACCCTCACAGCAACCTTGGCACTCATAGGGTGTCATGGCAGCCCCTGGGCGTGGATCAAGGCTAAGACAGCATCCATCTTAGGCATCCCTATCGCCCAGAAGCAGAGTGCGTCATGGCTTAAGAAGTTTAACGACATGGCCAATGCTGCCAAGGGATTTGAGTGGATTTCCAATAAGATTAGCAAATTTATTGATTGGCTTAAGGAGAAAATTATACCAGCAGCTAGAGAGAAGGTTGAGTTTTTGAACAACCTAAAACAACTGCCATTGTTGGAGAACCAAATCTCAAACCTGGAGCAGTCCGCCGCTTCGCAAGAAGACCTTGAAGCAATGTTTGGGAATGTATCGTATCTCGCTCACTTCTGCCGTAAATACCAACCACTTTATGCTACAGAAGCCAAAAGAGTTTATGCTTTGGAAAAGAGGATGAACAATTACATGCAGTTCAAGAGCAAACACCGTATTGAACCTGTATGTCTTATCATCAGAGGCTCCCCAGGTACCGGAAAGTCCTTGGCAACCGGTATAATTGCCCGAGCAATAGCTGACAAGTACCACTCTAGTGTGTACTCACTTCCGCCAGATCCAGACCACTTTGATGGTTACAAACAGCAAGTGGTCACAGTTATGGACGATCTATGCCAAAATCCTGATGGCAAGGATATGTCACTCTTTTGCCAGATGGTATCCACCGTAGATTTTATCCCACCAATGGCTTCTTTAGAAGAGAAAGGGGTCTCATTCACATCTAAATTTGTTATTGCATCCACTAATGCTAGCAATATCATAGTGCCAACAGTGTCTGATTCTGATGCTATCCGCCGCAGGTTCTATATGGACTGCGACATCGAGGTGACGGACTCATATAAAACAGATTTGGGTAGGTTAGACGCTGGAAGAGCTGCCAAATTATGCTCTGAAAATAACACAGCAAACTTCAAACGCTGCAGCCCACTAGTGTGTGGGAAGGCCATCCAATTAAGAGATAGGAAGTCCAAAG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18

Claims (2)

1.一种CV-A6病毒毒种，其特征在于，所述毒种的分类命名为柯萨奇病毒A组6型，保藏编号为CGMCC No.16217；所述CV-A6病毒的毒种的制备方法包括以下步骤：

（1）分离CV-A6病毒株

取手足口病重症儿童病人粪便1g加5ml生理盐水，悬浮3000xg离心30min，上清液经无菌过滤后，接种于RD细胞，3-5天病变后，继续在RD细胞传代3代，并经RT-PCR和测序获得该病毒全基因组序列及推测的氨基酸序列，该病毒株的基因型与目前中国流行株的CV-A6的基因型一致；

（2）毒株病毒在KMB17细胞上的适应

挑选已长成致密单层的P28代KMB17细胞，弃旧培养液，用PBS溶液清洗细胞表面，加入0.125% 胰蛋白酶消化细胞，待轻拍细胞瓶，细胞从瓶壁流沙样滑下，加入细胞培养液，按2×10⁵细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将步骤（1）所得CV-A10病毒200μl接种于细胞面，37℃吸附1小时，随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变情况，病毒达90%收获病毒，冻存备用；

（3）病毒毒株的克隆纯化

在KMB17细胞上已适应传代到第5代次的CV-A6病毒收获液，用病毒稀释液稀释至10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度，接种于已形成单层的KMB17细胞六孔培养板，37℃吸附1小时，加入不含小牛血清的病毒维持液，48小时后去除培养液，加入含0.8%琼脂糖-MEM，待琼脂固化后，倒置于37℃培养，3天后于镜下观察蚀斑，用枪头吸取出蚀斑，置于1.5ml离心管，加入0.5mlMEM 维持液，漩涡振荡，随即接种于单层KMB17细胞，37℃培养3～4天，待细胞病变后收获病毒，同样方法再进行两次蚀斑纯化，获得经鉴定为CV-A6的纯化克隆株；所述纯化克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子，继续传3代即作为主种子，随后再传3代即为工作种子；此原始种子、主种子和工作种子即为CV-A6病毒毒种；

（4）对步骤（3）所得原始种子、主种子和工作种子的毒种分别进行鉴定，表明所述毒种均具有良好的免疫原性、遗传稳定性和在KMB17细胞上良好适应增殖能力。

2.一种由权利要求1所述CV-A6病毒毒种制备的人用CV-A6灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗包括以下成分：CV-A6抗原100μg/ml，氢氧化铝1mg/ml；所述人用CV-A6灭活疫苗的制备方法如下：

（1）根据KMB17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB17细胞，弃培养液，用PBS溶液清洗细胞面，弃洗液；

（2）在所述KMB17细胞的细胞面中接种0.01MOI的所述病毒工作种子，混匀后放置于37℃ 30min，加入不含血清的病毒维持液，于37℃ 3-5天，病毒细胞病变效应达90%以上得病毒收获液；

（3）将步骤（2）所述病毒收获液按1:4000加入甲醛于37℃ 3天或所述病毒收获液按1:2000加入β-丙内酯于4℃ 2天，经超滤浓缩至原体积的5%，经纯化得纯化液，纯度高于96%，采用Lowry法测定其蛋白浓度不低于95%；

（4）将步骤（3）所述纯化液过滤除菌后，用PBS溶液调至100μg/ml，氢氧化铝1mg/ml，即得CV-A6灭活疫苗成品。