CN109609467A - 一种cv-a6病毒毒种及其人用灭活疫苗 - Google Patents
一种cv-a6病毒毒种及其人用灭活疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109609467A CN109609467A CN201811496292.7A CN201811496292A CN109609467A CN 109609467 A CN109609467 A CN 109609467A CN 201811496292 A CN201811496292 A CN 201811496292A CN 109609467 A CN109609467 A CN 109609467A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- virus
- seed
- culture
- viruses
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32311—Enterovirus
- C12N2770/32321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32311—Enterovirus
- C12N2770/32334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32311—Enterovirus
- C12N2770/32351—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种CV‑A6病毒毒种及其人用灭活疫苗;毒种的分类命名为柯萨奇病毒A组6型,保藏编号为CGMCC No.16217,所制成的人用CV‑A6灭活疫苗的组成为:CV‑A6灭活纯化抗原100μg/ml,氢氧化铝1mg/ml。经动物实验该疫苗制品具有良好的免疫原和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种CV-A6病毒毒种及其人用灭活疫苗。
背景技术
手足口病(hand foot mouth disease, HFMD)在全球,尤其是亚太地区,流行规模和威胁影响日益增加,而且值得注意的是,这个疾病对儿童群体的危害日益加重的过程。迄今为止,在我国的流行病学统计表明,该病自2008年被列为丙类传染病以来,已经于2009年即成为丙类传染病发病人数之首,总体病死率约为0.05%。该传染病的防控,尤其在儿童群体中的防控,已成为一个重要的公共卫生问题。
近年来CV-A6(柯萨奇病毒A组6型)感染引起HFMD爆发或流行的趋势不断增加,有些地区已成为除肠道病毒71型(EV-A71)和CV-A16以外的主要HFMD的病原体,并且与多种其它肠道病毒包括EV-A71与CV-A16出现交替循环、混合感染的现象。这凸显了控制HFMD流行的艰巨性。
目前国内外除EV-A71疫苗外,尚无其它的特效药物治疗HFMD,而疫苗是其主要预防手段。自2008年我国HFMD大流行后,HFMD已成为我国严重的的疾病负担,疫苗成为控制疾病的急需品种,历经七年的研发工作后,EV71疫苗获得批准用于手足口病的防治。为解决EV71疫苗难以控制CV-A16及CV-A6等其它肠道病毒引起HFMD的流行,以及可能由此引发的EV-A71疫苗公众接受和质疑问题,提出研发以EV-A71、CV-A16为核心,增加CV-A6等肠道病毒为主要成分的联合HFMD疫苗的必要性。目前CV-A16疫苗正在研发中,对CV-A6疫苗的研发尚缺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服以上所述缺陷,提供一种CV-A6病毒毒种及其筛选方法,以及以CV-A6病毒毒种制备的安全有效的人用CV-A6灭活疫苗。
为了解决以上所述技术问题,本发明所述CV-A6病毒毒种,其分类命名为柯萨奇病毒A组6型,保藏编号为CGMCC No.16217, 该病毒毒种取名为YNKA1205;所述CV-A6病毒的毒种的制备方法包括以下步骤:
(1)分离CV-A6病毒株
取手足口病重症儿童病人粪便1g加5ml生理盐水,悬浮3000xg离心30min,上清液经无菌过滤后,接种于RD细胞(即人恶性胚胎横纹肌瘤细胞),3-5天病变后,继续在RD细胞传代3代,并经RT-PCR和测序获得该病毒全基因组序列及推测的氨基酸序列,该病毒株的基因型为D3,与目前中国流行株的CV-A6的基因型一致;
(2)毒株病毒在KMB17细胞上的适应
挑选已长成致密单层的P28代KMB17细胞,弃旧培养液(指MEM),用PBS溶液清洗细胞表面,加入0.125% 胰蛋白酶消化细胞,待轻拍细胞瓶,细胞从瓶壁流沙样滑下,加入细胞培养液,按2×105细胞/瓶接种小方瓶,37℃培养3~4天后,将步骤(1)所得CV-A6病毒200μl接种于细胞面,37℃吸附1小时,随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液,37℃培养并观察细胞病变情况,病毒达90%收获病毒,冻存备用;
(3)病毒毒株的克隆纯化
在KMB17细胞上已适应传代到第5代次的CV-A6病毒收获液,用病毒稀释液稀释至10-3、10-4、10-5三个稀释度,接种于已形成单层的KMB17细胞六孔培养板,37℃吸附1小时,加入不含小牛血清的病毒维持液,48小时后去除培养液,加入含0.8%琼脂糖-MEM,待琼脂固化后,倒置于37℃培养,3天后于镜下观察蚀斑,用枪头吸取出蚀斑,置于1.5ml离心管,加入0.5mlMEM 维持液,漩涡振荡,随即接种于单层KMB17细胞,37℃培养3~4天,待细胞病变后收获病毒,同样方法再进行两次蚀斑纯化,获得经鉴定为CV-A6的纯化克隆株;所述纯化克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子,继续传3代即作为主种子,随后再传3代即为工作种子;此原始种子、主种子和工作种子即为CV-A6病毒毒种;
(4)对步骤(3)所得原始种子、主种子和工作种子的毒种分别进行鉴定,表明所述毒种均具有良好的免疫原性、遗传稳定性和在KMB17细胞上良好适应增殖能力。
本发明所述YNKA1205毒种的鉴定方法:
(1)YNKA1205毒株病毒感染性滴度测定
毒种进行10倍系列稀释(即10-1,10-2…….10-8),每个稀释度加8个孔,每孔100μl,按含2×105个/ml RD细胞,每孔100μl细胞悬液加至每个稀释度8孔,37℃培养5~7天,观察结果。
(2)RT-PCR和测序
病毒基因组的核酸提取按Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit操作手册进行,病毒基因RNA 逆转录采用TaKaRa公司生产的One-step RNA PCR kit (AMV)试剂盒,按操作手册进行,并根据“移步法”进行测序,测序后通过NCBI BLAST中比对,该核苷酸序列与CV-A6的同源性为75%,根据分型标准,可判断该病毒为CV-A6。
(3)不同代次毒株病毒基因组稳定性及序列比较
病毒通过在KMB17细胞传代培养,收获P1代次至P15代次的病毒收获液,病毒基因组的核酸提取按Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit提取试剂盒操作手册进行,根据CV-A6病毒基因序列设计合成针对5’非编码区基因和3’非编码基因的引物以及VP1基因两对引物,病毒基因RNA逆转录使用TaKaRa公司生产的One-step RNA PCR kit (AMV)试剂盒,按操作手册进行,根据“移步法”进行测序后,使用MEGA 软件对不同代次的全基组序列进行比较,其基准序列使用本实验室对该分离毒株接种KMB17并适应的第2代所获取的全基因序列,并比较2、5、10和15代病毒的基因序列,发现它们之间的核苷酸和氨基酸序列的同源分别高达99.6%和100%,这提示该毒株遗传稳定性较佳。
本发明所述CV-A6病毒毒种制备的人用CV-A6灭活疫苗,包括以下成分:CV-A6抗原100μg/ml,氢氧化铝1mg/ml;所述人用CV-A6灭活疫苗的制备方法如下:
(1)该病毒株接种于人二倍体细胞株KMB17,经适应后,并在KMB17细胞上通过三次蚀斑纯化,获得经鉴定为CV-A6的克隆株。该克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子,继续传3代即作为主种子,随后再传3代即为工作种子。
(2)对原始种子、主种子和工作种子的毒种分别进行鉴别实验、一步生长实验、滴度、无菌、支原体和免疫原性等检测,均表明具有良好的免疫原性以及在KMB17细胞上具有良好适应增殖能力。
(3)根据KMB17细胞生产检定规程,挑选生长致密的第28代KMB17细胞,弃培养液,用PBS溶液清洗细胞面,弃洗液。
(4)在KMB17细胞的细胞面中接种0.01MOI的病毒工作种子,混匀后放置37℃,30min,加入一定量不含血清的病毒维持液(根据培养瓶的大小决定所加的量),于37℃ 3-5天,病毒CPE(细胞病变效应)达90%以上收获病毒液。
(5)将所述病毒收获液按1:4000加入甲醛于37℃ 3天或所述病毒收获液按1:2000加入β-丙内酯于4℃ 2天灭活病毒,经超滤浓缩至原体积的5%,经纯化得纯化液,经鉴定所述纯化液的纯度高于96%,采用Lowry法测定其蛋白浓度不低于95%;
(6)将上述纯化液过滤除菌后,用PBS溶液调至100μg/ml,氢氧化铝1mg/ml,即得CV-A6灭活疫苗成品。
目前疫苗主要形式为减毒疫苗和灭活疫苗两种,但减毒疫苗存在毒力回复返祖及可引发疫苗相关疾病,而灭活疫苗则可克服此缺点。本发明除了筛选出一株免疫原性和安全性较好毒株外,所采用的细胞基质——KMB17,作为病毒疫苗生产载体也非常关键。目前用于人用疫苗的细胞基质主要为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和人胚肺的二培体细胞,如2BS和KMB17。作为人用疫苗,选择来源于人的细胞作为其生产的细胞基质,不仅能够提供良好的品质,而且具有更好的安全性。因此,本发明所述的CV-A6为分离于CV-A6感染重症儿童的分离株,不仅在人源细胞KMB17具有较好增殖和适应能力,而且在小鼠上也能产生良好的免疫原性。KMB17是申请人单位特有的人源来源和已批准人用疫苗生产细胞基质。另外选用目前我国主要流行CV-A6病毒的基因型中D3亚型毒株为疫苗毒株,使疫苗更具有针对性,免疫效果更佳。
在本发明所述CV-A6病毒分离和培养方法中,通过改良传统CV-A6病毒分离和培养方法,采用不含小牛血清的MEM细胞维持液,37℃培养并观察细胞病变,增加CV- A 6培养效率。
本发明所述CV-A6毒种毒株YNKA1205于2018 年08 月20 日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提交保藏,编号:CGMCC No.16217 ,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
与现有技术比较,本发明具有以下特点:
1.提供一种可用于人CV-A6灭活疫苗的毒种,目前尚无疫苗上市;
2.提供一种以KMB17人源二培体细胞为细胞基质制备CV-A6灭活疫苗方法,实验表明该疫苗具有良好的免疫性和安全性;
3.在本发明的CV-A6病毒分离和培养方法中,通过改良传统CV-A6病毒分离采用悬浮培养方法,而在病毒培养采用不含小牛血清的病毒维持液,增加CV-A6分离和灭活疫苗生产效率。
附图说明
图1 a为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞产生病变形态(种毒后24h);
图1b为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞产生病变形态(种毒后48h);
图1c为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞产生病变形态(种毒后72h);
图1d为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞产生病变形态(种毒后96h);
图2为 CV-A6毒种YNKA1205在KMB17细胞上形成的蚀斑(箭头所指为形成的蚀斑);
图3 为CV-A6毒株YNKA1205在KMB17细胞上一步生长曲线;
图4为所述原始种子、主种子和工作种子的中和抗体效价。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一:本发明所涉及毒株的分离、适应和纯化方法
(1)获取病毒样本
收集医院儿科鉴定为CV-A6感染的手足口病患***物标本,取1g粪便重悬于5mL生理盐水中,3000g离心30分钟取上清液,并使用0.45μm滤器(购自Millipore 公司)过滤,-20℃保存备用。
(2)病毒在RD细胞上的适应
挑选已长成致密单层的RD细胞,弃旧培养液,用适量PBS溶液清洗细胞表面,加入适量0.125% 胰蛋白酶消化细胞,待轻拍细胞瓶,细胞从瓶壁流沙样滑下,加入细胞培养液,按2ml每孔接种24孔板,将已过滤样品200μl接种于细胞面,37℃培养3~4天后,观察细胞病变情况病毒CPE达90%以上收获病毒,冻存备用。该CV-A6分离方法通过改良传统CV-A病毒分离方法,采用3000g离心30分钟取上清液,获得较高的病毒回收得率和除杂效果,以及悬浮培养,以增加病毒分离效率。
(3)病毒在KMB17细胞上的适应
挑选已长成致密单层的P23代KMB17细胞,弃旧培养液,用适量PBS溶液清洗细胞表面,加入适量0.125% 胰蛋白酶消化细胞,待轻拍细胞瓶,细胞从瓶壁流沙样滑下,加入细胞培养液,按2×105细胞/瓶接种小方瓶,37℃培养3~4天后,将CV-A6病毒200μl接种于细胞面,37℃吸附1小时,随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液,37℃培养并观察细胞病变情况病毒CPE达90%收获病毒,冻存备用。该CV-A6培养和适应方法通过改良的培养方法,在KMB17细胞适应中采用不含小牛血清的病毒维持液,37℃培养并观察细胞病变,以改善了CV-A6培养效率。
(4)病毒毒株的克隆纯化
在KMB17细胞上已适应传代到第5代次的CV-A6病毒收获液,稀释至10-3、10-4、10-5三个稀释度,接种于已形成单层的KMB17细胞六孔培养板,37℃吸附1小时,加入不含小牛血清的病毒维持液,48小时后去除培养液,加入含0.8%琼脂糖-MEM,待琼脂固化后,倒置于37℃培养,3天后于镜下观察蚀斑,用枪头吸取出蚀斑,置于1.5ml 离心管,加入0.5mlMEM 维持液,漩涡振荡,随即接种于KMB17细胞单层,37℃培养3~4天,待细胞病变后收获病毒,收获病毒继续接种于KMB17细胞生长传代。
(5)毒种制备
将经鉴定为CV-A6的克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子,继续传3代即作为主种子,随后再传2代即为工作种子。
实施例二: CV-A6毒株YNKA1205的培养及疫苗制备方法
(1)病毒在KMB17细胞培养
挑选已长成致密单层的P28代KMB17细胞,弃旧培养液,用适量PBS溶液清洗细胞表面,加入适量0.125% 胰蛋白酶消化细胞,待轻拍细胞瓶,细胞从瓶壁流沙样滑下,加入细胞培养液,按2×105细胞/瓶接种小方瓶,37℃培养3~4天后,将CV-A6病毒200μl接种于细胞面,37℃吸附1小时,随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液,37℃培养并观察细胞病变情况病毒CPE达90%收获病毒,冻存备用。附图1a-1d为 CV-A6 毒株在KMB17细胞产生病变形态(培养4 天),接种第二天即开始发生细胞病变,第三天细胞病变效应即可到达90%。
(2)病毒滴度测定
毒种进行10倍系列稀释,每个稀释度加8个孔,每孔100μl,按含2×105个/mlRD细胞,每孔100μl细胞悬液加至每个稀释度8孔, 37℃培养5~7天,观察结果,结果计算按Reed-Muench Method公式计算;该毒种的感染性滴度可达到7.25-75CCID50/L。图3为 CV-A6在KMB17细胞上一步生长曲线,在第三日,即到达对数生长期,感染性滴度达到最高7.25CCID50/L。
(3)病毒纯化
病毒收获液按1:4000加入甲醛,37℃3天灭活病毒,经超滤浓缩至原体积的5%,层析柱纯化,经电泳、HPLC鉴定病毒纯化液的纯度高于96%,采用Lowry法测定其蛋白浓度。
(4)成品制备
将上述纯化液过滤除菌后,用PBS溶液调至100μg/ml,氢氧化铝1mg/ml,该产品即为所需的CV-A6灭活疫苗成品。
实施例三:毒种的鉴定方法
(1)无菌检查及支原体检测实验
取硫乙醇酸盐流体培养基4支,胰酪大豆胨液体培养基2支,每支接种0.5 ml病毒。接种后的硫乙醇酸盐流体培养基2支30~35℃培养;硫乙醇酸盐流体培养基2支和胰酪大豆胨液体培养基2支置20~25℃培养;同时以病毒培养液同法操作作为阴性对照。培养14天后判定结果。取支原体检查用半固体培养基及肉汤培养基各4支,半固体培养基煮沸融化,冷却至56℃。两种培养基每支均加入预先以4:1比例混合的灭能小牛血清和双抗混合液2.5ml,迅速摇匀,然后每支培养基各加入待检样本0.5ml作原代培养,于35℃培养观察。至第7天时,两种原代培养基各取出2支转种,每支培养基各转种同种培养基2支,0.5ml/支,于35℃培养观察至21天;原代继续培养观察至21天。
(2)病毒致病性观察
取出生后1-2天的小鼠脑内接种105CCID50病毒量。每天观察2次,并记录临床出现的麻痹死亡情况。共观察14天。在24小时内出现的因注射损伤致麻痹或死亡者作无效小鼠予以删除。根据临床观察结果,计算4项指标进行评价:(1)半数致麻痹剂量(PD50);(2)半数致死剂量(LD50),按Spearman-karber法计算;(3)平均临床记分(MCS)。按3个分值计算:0分表示观察期间无麻痹样症状;1分表示曾出现麻痹,但仍能存活至到期;2分表示死亡或严重麻痹需中途处死。(4)平均临床症状出现日(MFT)。指注射样品后到第1次出现临床麻痹症状的日。
(3)鉴别实验
病毒基因组的核酸提取按Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit操作手册进行,病毒基因RNA 逆转录采用TaKaRa公司生产的One-step RNA PCR kit (AMV)试剂盒,按操作手册进行,测序后通过NCBI BLAST中比对,该核苷酸序列与CV-A6的的同源性为75%,根据分型标准,可判断该病毒为CV-A6。
(4)不同代次毒株病毒基因组稳定性及序列比较。
病毒通过在KMB17细胞传代培养,收获P1 代次至P15代次的病毒收获液,病毒基因组的核酸提取按Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit提取试剂盒操作手册进行,根据CV-A6病毒基因序列设计合成针对5’非编码区基因和3’非编码基因的引物以及VP1基因两对引物,病毒基因RNA逆转录使用TaKaRa公司生产的One-step RNA PCR kit(AMV)试剂盒,按操作手册进行,根据“移步法”进行测序后,使用MEGA 软件对不同代次的全基组序列进行比较,其基准序列使用本实验室对该分离毒株接种KMB17并适应的第2代所获取的全基因序列,并比较2、5、10和15代病毒的基因序列。
实施例四:灭活疫苗的免疫学检测
(1)获得精制的病毒纯化液后,选用试剂盒对其病毒抗原含量定量检测或蛋白定量后,设定系列稀释的免疫剂量组,腹腔注射、免疫接种小鼠,在2、4、6、8周检测中和抗体,比较、评价免疫原性及抗原性。
(2)中和抗体效价的检测:将病毒稀释至100CCID50/ml与等量的1:4,1:8,1:16,1:32,1:64和1:128免疫血清等量混合后,置37℃水浴60分钟,接种RD细胞,,35℃培养5~7天判定结果。无细胞病变为阳性;同时设血清和细胞对照均为阴性。
(3)实验苗免疫观察组
接种疫苗后二周、四周检测其抗体水平,如有必要四周后加强免疫一次,定期检测抗体效价,评价抗体应答的动态变化特征。
(4)母传抗体乳鼠保护试验组
根据实验需要设计剂量分组,分组免疫,每组免疫成年小鼠雌鼠4只,雄鼠2只,隔开饲养,初免四周后,进行加强免疫,二免一周后,雌鼠4只,雄鼠2只配窝饲养,待雌鼠产下乳鼠后,采用致死病毒剂量LD50脑内注射一日龄乳鼠,观察、记录临床出现的麻痹死亡情况,评价母传抗体乳鼠保护效应。结果表明母传抗体能保护乳鼠免于感染CV-A6病毒。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> CV-A6病毒毒株YNKA1205全基因组序列
<130> PCT/CN2018/111833
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7442
<212> DNA
<213> coxsackievirus A6
<400> 1
TTAAAACAGCCCTGTGGGTTGTACCCACCCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACACTGATTCTATGGAATCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTTCCCCAAAACTGTAACTTAGAAGAATATCACACTACCGATCAATAGCAGGCATGGCGCGCCAGTCATGTCTAGATCAAGCACTTCTGTCTCCCCGGATTGAGTATCAATAGACTGCTAGCGCGGTTGAAGGAGAAAACGTCCGTTACCCGGCTAACTACTTCGAGAAACTTAGTAGCACCATTGAAGCTGCGGAGTGTTTCGCTCAGCACTCTCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACTGCACTCCCCACGGGCGACCGTGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCTATGGGGCAACCCATAGGACGCTCTAAAGTGGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCCCTCAATCCAGGGGGTGGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTTTTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCAGTGACAAACAGAGCTTTGATATACTTGTTCGTGGGTTTCGTTCCACTCATCAGTCGTACAGTTCATACTTTAAAGTACATTCTGATTCTGAACAATAGAAAATGGGCGCCCAAGTTTCAACAGAAAAATCTGGGTCGCACGAGACAAAGAATGTAGCGACCGAAGGGTCTACTATCAACTTCACCAACATTAATTACTATAAGGATTCTTATGCAGCGTCAGCTAGTAAACAGGACTTTGCACAAGATCCTGCAAAGTTCACACGCCCTGTCTTGGATACCATCAGGGAGGTTGCAGCCCCCTTGCAATCCCCTTCTGTTGAGGCGTGCGGTTATAGTGACCGAGTCGCACAGTTGACTGTGGGCAACTCAACCATTACTACCCAAGAGGCAGCCAACATTGTGTTGAGTTACGGAGAGTGGCCAGAATATTGTCCCTCCACGGACGCTACAGCTGTGGACAAACCTACTCGCCCTGACGTGTCAGTAAATAGGTTCTACACACTGTCAACTAAGAGTTGGAAGACAGAATCTACTGGCTGGTACTGGAAATTCCCTGATGTGCTAAACGACACAGGAGTGTTCGGTCAAAACGCCCAATTCCACTACTTGTACCGCTCGGGTTTCTGCATGCACGTTCAGTGCAATGCAAGCAAGTTCCATCAGGGGGCCCTCTTAGTGGCTGCAATCCCCGAGTTTGTGATTGCTGCAAGCAGCCCTCCCGCGAAGCCTAATGGACGAGGGTTATACCCAGATTTCACTCACACTAACCCAGGTAAAAATGGCCAAGAGTTTCGAGATCCTTATGTCTTGGATGCTGGTGTCCCCCTAAGTCAAGCACTGGTTTACCCCCATCAATGGATCAATCTACGAACTAATAACTGCGCGACCATCATCATGCCCTATGTCAATGCGCTTCCATTTGATTCGGCGCTTAACCACTCAAATTTTGGATTGGTTGTGATCCCTATTAGCCCTTTAAAATATTGTAATGGAGCTACCACAGAGGTGCCAATCACACTAACTATTGCCCCACTTAACTCGGAGTTTAGCGGCCTCCGACAAGCAATAAAACAAGGGTTTCCCACAGAGCTTAAGCCTGGGACCAATCAATTTCTTACAACTGACGACGGGACATCCCCACCAATACTGCCCGGTTTTGAACCAACTCCATTGATTCACATTCCTGGCGAGTTCACTTCTTTGTTAGATTTGTGCCAAATAGAAACCATACTAGAAGTCAATAATACCACTGGCACCACCGGGGTCAATAGATTACTAATCCCCGTTCGAGCACAGAACAATGTGGACCAGTTGTGCGCATCATTCCAAGTAGACCCTGGGCGCAATGGCCCGTGGCAATCCACAATGGTCGGTCAGATCTGCAGGTATTACACTCAATGGTCAGGTTCTCTTAAGGTAACCTTTATGTTCACGGGTTCTTTTATGGCCACAGGGAAAATGCTGATAGCCTACACACCACCTGGTAGTGCTCAGCCCGCTACAAGGGAAGCAGCAATGCTTGGGACTCATATAGTGTGGGATTTTGGTTTGCAATCATCGGTTACCCTAGTTATACCTTGGATTAGTAATACTCATTTTAGAGCAGTTAAGACTGGAGGGGTATATGACTACTACGCAACCGGGATTGTCACCATTTGGTACCAAACCAACTTTGTAGTGCCACCAGACACCCCCACTGAGGCTAATATTATAGCTCTTGGAGCAGCACAGAAAAACTTTACTCTAAAGTTGTGCAAGGACACTGACGAGATCCAGCAAACAGCAGAGTACCAAAATGATCCCATTACAAATGCAGTGGAAAGCGCTGTGAGCGCGCTTGCTGACACCACAATATCCCGGGTGACCGCAGCTAACACTGCAGCTAGCACCCACTCCCTGGGAACAGGGCGTGTACCAGCATTGCAAGCCGCAGAAACGGGAGCAAGCTCTAATGCTAGTGATGAGAACCTTATTGAGACTCGCTGTGTGATGAATCGAAACGGGGTTAATGAGGCGAGTGTGGAACACTTTTACTCTCGTGCAGGGCTGGTAGGAGTTGTGGAGGTGAAGGACTCGGGCACTAGCCCGGATGGGTACACAGTCTGGCCCATAGATGTGATGGGCTTCGTGCAACAGCGGCGCAAGCTAGAGCTGTCAACATACATGCGCTTTGATGCCGAGTTCACTTTTGTGTCCAACCTCAGTGACAGTACGACGCCCGGGATGCTGCTGCAGTATATGTATGTACCACCAGGGGCTCCTAAGCCGGATAGCAGGAAATCATATCAATGGCAGACTGCTACTAACCCGTCGGTATTTGCAAAATTGAGAGATCCACCCCCCCAGGTATCTGTTCCGTTCATGTCGCCAGCAACAGCTTATCAGTGGTTTTATGATGGTTACCCTACATTTGGTGAGCACAAACAAGCTACCAATTTGCAATATGGGCAGTGTCCTAATAACATGATGGGCCATTTTGCCATCCGAACAGTTAGTGAATCTACCACCGGGAGAAACGTCCACGTTCGGGTGTACATGAGAATTAAGCACGTGAGAGCTTGGGTACCTAGACCCCTTCGATCCCAAGCTTATATGGTCAAGAACTACCCGACATACAGCCAAACAATAACTAACACTGCAACTGACCGTGCAAGCATAACCACCACGGATTATGAAGGCGGGATACCAGCAAACCCACAAAGGACATTTGGTAGGTTTGGCCAACAGTCCGGGGCTATCTATGTAGGTAACTTCAGAGTGGTGAACCGACACCTCGCCACTCATAATGATTGGGCAAATCTAGTATGGGAAAGTAGCTCACGAGATCTTCTGGTGTCCTCCACCACTGCTCAGGGATGTGATACCATTGCCCGATGTGATTGTCAAACAGGAGTGTATTACTGCAACTCTAGAAGGAAACACTACCCGGTTAGTTTTTCTAAGCCTAGCCTCGTCTTCGTGGAAGCTAGTGAGTATTACCCTGCCAGGTATCAGTCGCACCTCATGCTTGCGAAGGGACATTCTGAACCCGGGGACTGTGGTGGCATTCTTAGGTGCCAACATGGCGTGATTGGTATCGTGTCCACTGGTGGTAATGGACTTGTCGGATTTGCAGATGTCAGAGATCTTTTGTGGCTGGATGAAGAAGCTATGGAACAGGGTGTGTCAGATTACATCAAAGGGCTTGGTGACGCATTCGGAACTGGTTTTACTGATGCAGTGTCTAGGGAGGTGGAGGCTCTTAAGAACTACCTTATAGGATCTGAAGGGGCTGTTGAAAAGATCTTGAAGAATTTAATTAAATTGATCTCAGCATTAGTCATAGTGATCAGAAGTGATTATGACATGGTAACCCTCACAGCAACCTTGGCACTCATAGGGTGTCATGGCAGCCCCTGGGCGTGGATCAAGGCTAAGACAGCATCCATCTTAGGCATCCCTATCGCCCAGAAGCAGAGTGCGTCATGGCTTAAGAAGTTTAACGACATGGCCAATGCTGCCAAGGGATTTGAGTGGATTTCCAATAAGATTAGCAAATTTATTGATTGGCTTAAGGAGAAAATTATACCAGCAGCTAGAGAGAAGGTTGAGTTTTTGAACAACCTAAAACAACTGCCATTGTTGGAGAACCAAATCTCAAACCTGGAGCAGTCCGCCGCTTCGCAAGAAGACCTTGAAGCAATGTTTGGGAATGTATCGTATCTCGCTCACTTCTGCCGTAAATACCAACCACTTTATGCTACAGAAGCCAAAAGAGTTTATGCTTTGGAAAAGAGGATGAACAATTACATGCAGTTCAAGAGCAAACACCGTATTGAACCTGTATGTCTTATCATCAGAGGCTCCCCAGGTACCGGAAAGTCCTTGGCAACCGGTATAATTGCCCGAGCAATAGCTGACAAGTACCACTCTAGTGTGTACTCACTTCCGCCAGATCCAGACCACTTTGATGGTTACAAACAGCAAGTGGTCACAGTTATGGACGATCTATGCCAAAATCCTGATGGCAAGGATATGTCACTCTTTTGCCAGATGGTATCCACCGTAGATTTTATCCCACCAATGGCTTCTTTAGAAGAGAAAGGGGTCTCATTCACATCTAAATTTGTTATTGCATCCACTAATGCTAGCAATATCATAGTGCCAACAGTGTCTGATTCTGATGCTATCCGCCGCAGGTTCTATATGGACTGCGACATCGAGGTGACGGACTCATATAAAACAGATTTGGGTAGGTTAGACGCTGGAAGAGCTGCCAAATTATGCTCTGAAAATAACACAGCAAACTTCAAACGCTGCAGCCCACTAGTGTGTGGGAAGGCCATCCAATTAAGAGATAGGAAGTCCAAAGTTAGATACAGTGTGGATACGGTGGTTTCAGAGCTCATAAGGGAGTACAATAACAGATCTGCCATTGGAAACACAATTGAAGCGTTGTTCCAGGGGCCACCCAAGTTTAGACCTATTAGGATTAGTCTTGAGGAGGCGCCAGCACCAGATGTTATTAGTGATCTTCTTGCCAGTGTGGATAGTGAAGAGGTGCGCCAATACTGTAGAGACCAAGGTTGGATCATACCAGAAACCCCTACCAACGTTGAGCGACATCTAAGTAGGGCTGTGCTAATTATGCAATCCATCGCCACGGTCGTTGCAGTAGTCTCACTAGTGTATGTTATCTACAAACTTTTTGCTGGATTTCAGGGTGCATATTCTGGCGCTCCTAAGCAAGTGCTCAAGAAACCTATCCTCCGTACGGCAACAGTGCAGGGGCCTAGCCTTGATTTTGCCCTATCCCTACTGAGAAGGAACATCAGGCAGGTTCAGACAGATCAAGGGCACTTCACTATGTTGGGTGTCAGGGATCGCTTAGCAGTTCTCCCGCGCCACTCACAGCCCGGAAAAACAATCTGGGTGGAGCACAAACTCGTGAACATCCTGGATGCTGTCGAGTTGGTGGATGAGCAAGGGGTCAATCTAGAGCTCACTCTAATCACTCTTGATACCAATGAGAAATTCAGAGATATCACCAAGTTCATTCCAGAAAACATCAGCGCTGCTAGTGACGCCACCCTAGTGATTAATACAGAACACATGCCCTCAATGTTTGTACCTGTGGGAGATGTCGTACAATACGGTTTCCTGAATCTCAGTGGAAAACCCACCCACCGCACCATGATGTACAACTTCCCTACTAAGGCAGGACAGTGTGGAGGAGTGGTGACATCAGTTGGAAAGGTTATTGGAATTCACATAGGAGGCAATGGTAGGCAAGGTTTCTGTGCGGGACTTAAGAGGAGCTACTTTGCTAGTGAGCAAGGAGAGATCCAATGGGTAAAGCCTAACAAAGAAACTGGGAGACTTAACATCAACGGGCCAACTCGCACCAAGCTCGAACCTAGTGTGTTCCATGATGTCTTTGAGGGTAACAAGGAGCCAGCGGTCTTACATAGTAAGGACCCTCGCCTTGAGGTGGACTTCGAGCAGGCGTTGTTCTCTAAGTATGTAGGGAACACACTCCATGAACCTGATGAGTATATCAGAGAAGCAGCCCTTCACTATGCAAATCAGTTGAAACAGCTGGACATAGACACCACCCAGATGAGCATGGAGGAGGCTTGTTATGGGACAGACAATCTTGAAGCTATCGACCTTCAAACTAGTGCAGGTTATCCCTACAGTGCTCTGGGAATAAAGAAAAGAGATATTTTAGACCCTACCACCAGAGACGTCAGTAGGATGAAGTTCTACATGGACAAGTATGGTCTCGACCTTCCATATTCTACCTATGTCAAAGACGAGCTTCGCTCGATAGACAAGATCAAGAAAGGGAAGTCTCGTCTGATTGAGGCCAGCAGTTTGAATGACTCGGTCTATCTCAGAATGGCCTTCGGGCACCTCTATGAAACTTTCCATGCAAATCCTGGGACAGTAACTGGCTCGGCTGTGGGGTGTAACCCAGATGTGTTTTGGAGTAAGCTACCAATTCTGCTCCCTGGGTCCCTCTTTGCCTTTGACTATTCAGGCTACGATGCTAGCCTTAGCCCAGTTTGGTTTAGAGCACTGGAATTAGTCCTTAGAGAGATAGGCTATAGTGATGAGGCAGTCTCGCTCATTGAAGGAATCAACCACACGCACCATGTGTACCGTAACAAAACCTACTGCGTACTTGGTGGAATGCCCTCAGGTTGCTCAGGAACATCCATCTTTAACTCAATGATTAATAACGTCATTATCAGAGCATTACTCATTAAAACATTCAAGGGCATTGATCTGGATGAACTCAACATGGTTGCCTACGGGGACGATGTGCTCGCTAGTTACCCCTTTCCAATTGACTGCCTAGAGCTAGCAAAAACAGGTAAGGAGTACGGTCTAACCATGACTCCTGCAGACAAGTCCCCTTGCTTCAATGAAGTTAATTGGGAAAACGCAACCTTCCTCAAGAGAGGCTTCTTGCCTGATGAGCAATTTCCGTTTTTGATCCACCCCACCATGCCAATGAAGGAAATTCATGAATCCATTCGGTGGACCAAGGATGCACGCAATACTCAAGATCACGTGCGGTCCCTATGCCTATTGGCGTGGCACAATGGTAAGCAAGAATACGAAAAATTTGTGAACTCAATTAGATCCGTCCCAGTAGGAAGAGCATTGGCAATCCCCAATTATGAAAATCTGAGACGTAAGTGGCTCGAATTGTTTTAGAGGTTGAACAAACCTCAACCCCACCAGAAATCTGGTCGTGAATATAACTGGTGGGGGTAAATTTGTTATACCCAGAATAGCAAAATCA 18
Claims (2)
1.一种CV-A6病毒毒种,其特征在于,所述毒种的分类命名为柯萨奇病毒A组6型,保藏编号为CGMCC No.16217;所述CV-A6病毒的毒种的制备方法包括以下步骤:
(1)分离CV-A6病毒株
取手足口病重症儿童病人粪便1g加5ml生理盐水,悬浮3000xg离心30min,上清液经无菌过滤后,接种于RD细胞,3-5天病变后,继续在RD细胞传代3代,并经RT-PCR和测序获得该病毒全基因组序列及推测的氨基酸序列,该病毒株的基因型与目前中国流行株的CV-A6的基因型一致;
(2)毒株病毒在KMB17细胞上的适应
挑选已长成致密单层的P28代KMB17细胞,弃旧培养液,用PBS溶液清洗细胞表面,加入0.125% 胰蛋白酶消化细胞,待轻拍细胞瓶,细胞从瓶壁流沙样滑下,加入细胞培养液,按2×105细胞/瓶接种小方瓶,37℃培养3~4天后,将步骤(1)所得CV-A10病毒200μl接种于细胞面,37℃吸附1小时,随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液,37℃培养并观察细胞病变情况,病毒达90%收获病毒,冻存备用;
(3)病毒毒株的克隆纯化
在KMB17细胞上已适应传代到第5代次的CV-A6病毒收获液,用病毒稀释液稀释至10-3、10-4、10-5三个稀释度,接种于已形成单层的KMB17细胞六孔培养板,37℃吸附1小时,加入不含小牛血清的病毒维持液,48小时后去除培养液,加入含0.8%琼脂糖-MEM,待琼脂固化后,倒置于37℃培养,3天后于镜下观察蚀斑,用枪头吸取出蚀斑,置于1.5ml离心管,加入0.5mlMEM 维持液,漩涡振荡,随即接种于单层KMB17细胞,37℃培养3~4天,待细胞病变后收获病毒,同样方法再进行两次蚀斑纯化,获得经鉴定为CV-A6的纯化克隆株;所述纯化克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子,继续传3代即作为主种子,随后再传3代即为工作种子;此原始种子、主种子和工作种子即为CV-A6病毒毒种;
(4)对步骤(3)所得原始种子、主种子和工作种子的毒种分别进行鉴定,表明所述毒种均具有良好的免疫原性、遗传稳定性和在KMB17细胞上良好适应增殖能力。
2.一种由权利要求1所述CV-A6病毒毒种制备的人用CV-A6灭活疫苗,其特征在于,所述疫苗包括以下成分:CV-A6抗原100μg/ml,氢氧化铝1mg/ml;所述人用CV-A6灭活疫苗的制备方法如下:
(1)根据KMB17细胞生产检定规程,挑选生长致密的第28代KMB17细胞,弃培养液,用PBS溶液清洗细胞面,弃洗液;
(2)在所述KMB17细胞的细胞面中接种0.01MOI的所述病毒工作种子,混匀后放置于37℃ 30min,加入不含血清的病毒维持液,于37℃ 3-5天,病毒细胞病变效应达90%以上得病毒收获液;
(3)将步骤(2)所述病毒收获液按1:4000加入甲醛于37℃ 3天或所述病毒收获液按1:2000加入β-丙内酯于4℃ 2天,经超滤浓缩至原体积的5%,经纯化得纯化液,纯度高于96%,采用Lowry法测定其蛋白浓度不低于95%;
(4)将步骤(3)所述纯化液过滤除菌后,用PBS溶液调至100μg/ml,氢氧化铝1mg/ml,即得CV-A6灭活疫苗成品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811496292.7A CN109609467A (zh) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | 一种cv-a6病毒毒种及其人用灭活疫苗 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811496292.7A CN109609467A (zh) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | 一种cv-a6病毒毒种及其人用灭活疫苗 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109609467A true CN109609467A (zh) | 2019-04-12 |
Family
ID=66008700
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811496292.7A Pending CN109609467A (zh) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | 一种cv-a6病毒毒种及其人用灭活疫苗 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109609467A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110184242A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-08-30 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 柯萨奇病毒a组6型(cva6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用 |
CN114807060A (zh) * | 2022-06-23 | 2022-07-29 | 北京民海生物科技有限公司 | 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用 |
CN117230026A (zh) * | 2023-08-24 | 2023-12-15 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 柯萨奇病毒a6型cva6-km-j33及应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090317796A1 (en) * | 2008-06-20 | 2009-12-24 | Centers For Disease Control Department Of Health | Indirect immunofluorescence assay typing kit for coxsackievirus A group and method for typing coxsackievirus A group |
CN104878126A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-09-02 | 安阳市疾病预防控制中心 | 一种柯萨奇病毒a6型核酸的检测试剂盒及检测方法 |
CN106867974A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-06-20 | 泰山医学院 | 柯萨奇病毒a6型感染动物模型及其制备方法与应用 |
CN106947745A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-07-14 | 泰山医学院 | 柯萨奇病毒a6型毒株wf057r及其应用 |
US20180187165A1 (en) * | 2014-11-07 | 2018-07-05 | Takeda Vaccines, Inc. | Hand, foot, and mouth vaccines and methods of manufacture and use thereof |
-
2018
- 2018-12-07 CN CN201811496292.7A patent/CN109609467A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090317796A1 (en) * | 2008-06-20 | 2009-12-24 | Centers For Disease Control Department Of Health | Indirect immunofluorescence assay typing kit for coxsackievirus A group and method for typing coxsackievirus A group |
US20180187165A1 (en) * | 2014-11-07 | 2018-07-05 | Takeda Vaccines, Inc. | Hand, foot, and mouth vaccines and methods of manufacture and use thereof |
CN104878126A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-09-02 | 安阳市疾病预防控制中心 | 一种柯萨奇病毒a6型核酸的检测试剂盒及检测方法 |
CN106867974A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-06-20 | 泰山医学院 | 柯萨奇病毒a6型感染动物模型及其制备方法与应用 |
CN106947745A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-07-14 | 泰山医学院 | 柯萨奇病毒a6型毒株wf057r及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
HEEJI LIM ET AL.: "The immunogenicity and protection effect of an inactivated coxsackievirus A6, A10, and A16 vaccine against hand, foot, and mouth disease", 《VACCINE》 * |
ZHENJIE ZHANG ET AL.: "A Neonatal Murine Model of Coxsackievirus A6 Infection for Evaluation of Antiviral and Vaccine Efficacy", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 * |
刘红波 等: "一株柯萨奇病毒A组6型毒株RYN-A1205 的分子特征及其在细胞上的遗传稳定性研究", 《中国病毒病杂志》 * |
尹志超 等: "柯萨奇病毒A组6型抗体中和试验Nt-ELSPOT方法的建立", 《中国病原生物学杂志》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110184242A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-08-30 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 柯萨奇病毒a组6型(cva6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用 |
CN110184242B (zh) * | 2019-06-11 | 2021-08-20 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 柯萨奇病毒a组6型(cva6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用 |
CN114807060A (zh) * | 2022-06-23 | 2022-07-29 | 北京民海生物科技有限公司 | 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用 |
CN114807060B (zh) * | 2022-06-23 | 2022-09-30 | 北京民海生物科技有限公司 | 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用 |
WO2023246639A1 (zh) * | 2022-06-23 | 2023-12-28 | 北京民海生物科技有限公司 | 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用 |
CN117230026A (zh) * | 2023-08-24 | 2023-12-15 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 柯萨奇病毒a6型cva6-km-j33及应用 |
CN117230026B (zh) * | 2023-08-24 | 2024-02-02 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 柯萨奇病毒a6型cva6-km-j33及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109536460A (zh) | 一种cv-a10病毒毒种及其人用灭活疫苗 | |
JP4161017B2 (ja) | ベロ細胞に適応させた弱毒化日本脳炎ウィルスおよび日本脳炎ワクチン | |
CN103031258B (zh) | 新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物 | |
CN101897963B (zh) | 一种手足口病病毒疫苗 | |
CN104099301B (zh) | 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法 | |
CN108486067B (zh) | 猪流行性腹泻病毒变异株及其制备的灭活疫苗和应用 | |
CN101402944A (zh) | 一种ev-71病毒毒种、人用灭活疫苗及其制备方法 | |
CN109609467A (zh) | 一种cv-a6病毒毒种及其人用灭活疫苗 | |
CN114807060B (zh) | 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用 | |
CN112500458B (zh) | 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
CN114774372B (zh) | 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用 | |
CN102352347A (zh) | Pcv2重组杆状病毒构建及其亚单位疫苗制备方法 | |
CN104450559B (zh) | 新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物 | |
CN111411086A (zh) | 一种能够有效感染大日龄幼鼠的柯萨奇a组5型病毒株 | |
CN102559606B (zh) | 一种柯萨奇病毒a16型病毒株及其应用 | |
CN102839159A (zh) | 一种CoxA16病毒株和人用CoxA16灭活疫苗 | |
CN102533671A (zh) | 一种柯萨奇病毒a16型病毒株及其应用 | |
CN102167735A (zh) | 日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其制备方法和用途 | |
CN116769733B (zh) | 一种柯萨奇病毒b组4型毒株及应用 | |
CN106367398B (zh) | 一种人柯萨奇病毒a组16型病毒株及其在制备灭活疫苗中的应用 | |
CN103087994A (zh) | 一种柯萨奇病毒a16型病毒株及其应用 | |
CN104388396B (zh) | 猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用 | |
CN103865884A (zh) | 鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法和应用 | |
CN103160475B (zh) | 一种肠道病毒71型病毒株及其用途、疫苗和制备方法 | |
CN103834617B (zh) | 人肠道病毒71型c4亚型致死株sd095及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190412 |