CN109593878A - 与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记，所述的分子标记P‑05‑112的引物序列为：P‑05‑112F：5’‑ACTGGGGAACACTTACGGC‑3’；P‑05‑112R：5’‑TCTCAGCAAGGGATTAAAGGC‑3’；本发明还公开了其应用方法。本发明的有益效果为：不仅可以提高辣椒细胞核雄性不育在育种当中的利用效率，提高育种中选择的准确性和效率，显著缩短育种周期，还能降低育种制种成本。

Description

与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及遗传育种和分子生物学领域，具体来说，涉及一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
辣椒是茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)一年生或多年生草本植物。广泛栽培于全球各地，是一种世界范围内具有重要经济价值的蔬菜作物，也是人们饮食生活中非常重要的一种调味品。据中国•遵义第二届国际辣椒博览会发布的相关信息，我国辣椒种植面积占世界辣椒种植总面积的 35%；近 3 年平均年产量 2800 万吨，占世界辣椒总产量的46%；年产值逾 700 亿元，辣椒产业已成为我国最大的蔬菜产业。
辣椒杂种优势非常明显，利用雄性不育系制种可以省去人工去雄，有效地降低杂种种子生产成本，保证种子的纯度，并有利于保护知识产权。大多数蔬菜作物自然突变的雄性不育仅有一种遗传类型，但在辣椒上同时存在细胞核不育型和核质互作不育型（细胞质不育），因此辣椒是研究植物雄性不育育性表达很好的试验材料。细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）的育性由细胞质和细胞核基因共同控制，可以育成100% 不育的雄性不育系，利用较方便，但父本的恢复基因主要分布在小果型辣椒中，普遍栽培的大果型辣椒中恢复系较难找到，选育优良的杂交品种较困难；辣椒细胞核雄性不育（genic male sterility，GMS）育性仅受细胞核基因控制，不受细胞质影响，目前报道的大多为 1 对隐性核基因控制，只能育成雄性不育两用系，在制种时需拨除 50% 的可育株，但辣椒细胞核雄性不育育性较稳定，遗传简单便于利用，且普通的自交系均能使杂种的育性全部恢复，育种中父本来源广泛，便于育成优良的杂交品种。
到目前为止，国内外研究者已发现的辣椒细胞核雄性不育基因近 20 个（ms1 --ms15, msk, msc-1，msc-2），其中msc-1 和 msc-2是由国内学者发现并利用的不育基因，但是这些基因之间的关系、基因是否相同等均不清楚。目前仅有ms1 和msc-1育性控制基因被克隆出来，在连锁标记开发方面，国内外研究者对 5 个 ms 基因（ms1、 ms3 、ms8 、ms10、msc-1）进行了定位或开发了连锁标记。除了msc-1开发了一个基因标记之外，其余与ms基因连锁的分子标记要么连锁距离较远要么标记使用成本较高，在适用性上还有待提高。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明的目的是提供一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记及其应用，克服现有产品中上述方面的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记，所述的分子标记P-05-112的引物序列为：
P-05-112F：5’- ACTGGGGAACACTTACGGC-3’；
P-05-112R：5’- TCTCAGCAAGGGATTAAAGGC-3’。
一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记P-05-112的应用，所述分子标记应用于辣椒细胞核雄性不育品系的辅助选择育种。
进一步的，所述分子标记应用的方法包括以下步骤：
1）提取待测样品的DNA；
2）采用分子标记进行PCR扩增；
3）进行电泳测试。
进一步的，所述步骤2）中PCR扩增反应体系为：DNA工作液2μL、10×Buffer缓冲液2μL、dNTPs 0.8μL、DNA聚合酶0.4μL、正向引物和反向引物各0.2μL，用14.4μL ddH2O将总体积补齐至20μL；PCR扩增反应程序：94℃预变性5 分钟；94℃变性30 秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸7 分钟。
进一步的，所述步骤3）中电泳测试用7%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，硝酸银染色后观察。能检测出243、256和258bp片段的为雄性可育辣椒品系，而片段大小为256和258bp片段的则是雄性不育的辣椒品系。
进一步的，：所述步骤3）中能检测出三带条带片段的为雄性可育辣椒品系，而检测出两带条带则是雄性不育的辣椒品系。
本发明的有益效果为：不仅可以提高辣椒细胞核雄性不育在育种当中的利用效率，提高育种中选择的准确性和效率，显著缩短育种周期，还能降低育种制种成本。
附图说明
下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
图1是本发明实施例分子标记P-05-112在可育和不育池的扩增结果图，图中：S：不育池；F：可育池；
图2是本发明实施例分子标记P-05-112与不育基因的遗传距离图；
图3是本发明实施例分子标记P-05-112对已知基因型材料的测试结果图。
具体实施方式
本发明实施例所述的一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记及其应用。
实施例1：提供一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记P-05-112，其引物序列为：
P-05-112F：5’- ACTGGGGAACACTTACGGC-3’；
P-05-112R：5’- TCTCAGCAAGGGATTAAAGGC-3’。
定位群体的构建
本试验两用系不育源由冀研 16 号分离得到，父本为本实验室纯合自交系；以辣椒细胞核雄性不育两用系群体18C2655为试验材料，获得一个包含280个单株的两用系群体，单株统计花粉育性。
分子标记开发
在5号染色体特定区域上开发SSR标记，共98对。
分子标记P-05-112在可育和不育池的扩增结果如图1所示。
图1表明：分子标记P-05-112可育池基因组DNA扩增产物含有大小为243、256和258bp的片段，在不育池DNA扩增产物含有大小为256和258bp的片段。
利用筛选所得的多态性分子标记P-05-112分析两用系群体的280个单株的基因型，并结合群体单株的田间育性鉴定结果，利用JoinMap4.0软件绘制辣椒细胞核不育基因的遗传连锁图谱；图谱如图2所示；
图2结果表明分子标记P-05-112与不育基因的遗传距离均为1.5cM。
实施例2：提供一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记的应用，对41份已知基因型（MsMs）的辣椒自交系和品种进行基因型检测，具体步骤如下：
1）采用改良CTAB法提取辣椒基因组DNA；
2）采用分子标记进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为：DNA工作液2μL、10×Buffer缓冲液2μL、dNTPs 0.8μL、DNA聚合酶0.4μL、正向引物和反向引物各0.2μL（10uM/L），用14.4μLddH2O将总体积补齐至20μL；PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7 min。
3）扩增产物用7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相，并对PCR扩增产物进行测序，检测结果如图3所示，结果显示，P-05-112的成功率为78%，表明这个标记的适用性强，育种应用中可以对育性进行快速鉴定。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
<110> 绿亨科技股份有限公司
<120> 与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记及其应用
<130> 2019
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actggggaac acttacggc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctcagcaag ggattaaagg c 21

Claims (6)

1.一种与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述的分子标记P-05-112的引物序列为：
P-05-112F：5’- ACTGGGGAACACTTACGGC-3’；
P-05-112R：5’- TCTCAGCAAGGGATTAAAGGC-3’。
2.一种权利要求1所述的与辣椒细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记应用于辣椒细胞核雄性不育品系的辅助选择育种。
3.如权利要求2所述的分子标记的应用，其特征在于：具体方法包括以下步骤：
1）提取待测样品的DNA；
2）采用分子标记进行PCR扩增；
3）进行电泳测试。
4.根据权利要求3所述的分子标记的应用，其特征在于：所述步骤2）中PCR扩增反应体系为：DNA工作液2μL、10×Buffer缓冲液2μL、dNTPs 0.8μL、DNA聚合酶0.4μL、正向引物和反向引物各0.2μL，用14.4μL ddH2O将总体积补齐至20μL；PCR扩增反应程序：94℃预变性5 分钟；94℃变性30 秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸7 分钟。
5.根据权利要求3所述的分子标记的应用，其特征在于：所述步骤3）中电泳测试用7%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，硝酸银染色后观察。
6.根据权利要求3所述的分子标记的应用，其特征在于：所述步骤3）中能检测出三带条带片段的为雄性可育辣椒品系，而检测出两带条带则是雄性不育的辣椒品系。
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