一种乳腺癌标志物hMAM检测试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及乳腺癌诊断技术领域,具体涉及一种乳腺癌标志物hMAM检测试纸条及其制备方法。
背景技术
乳腺癌(breast cancer)是由多种致癌因素引起的复杂和异质性疾病,占女性癌症发生总数的29%,居女性癌症死亡率的第二位(14%)。虽然目前乳腺癌的治疗方法与效果有了很大改进与提升,但像三阴性乳腺癌等的预后效果仍不理想。因此,乳腺癌的早期筛查与治疗历来是研究的热点,但是既往一直缺乏特异性的检测指标及理想的检测方法。
对乳腺癌来说,目前临床上检测乳腺癌的指标主要有细胞角蛋白19(CK19)、癌胚抗原(CEA)、CA153、P53、BRCA-1(乳腺癌易感基因-1)、BRCA-2(乳腺癌易感基因-2)等,但这些肿瘤标志物均缺乏乳腺癌特异性和敏感性。研究表明人乳腺珠蛋白(humanmammaglobin,hMAM)是一种较为理想的诊断早期乳腺癌的肿瘤标志物,因此建立基于hMAM检测的乳腺癌检测试剂,对乳腺癌的诊断、转移、预后等方面具有重要的意义。
人乳腺珠蛋白,属于子宫珠蛋白(uteroglobin,UG)超家族,是93个氨基酸构成的多肽,分子量为10.5kDa。大多数研究都证实hMAM基因只在成人乳腺中表达,在很多乳腺肿瘤中过度表达,因而可作为乳腺及乳腺癌特异性标志物。由于乳腺组织血供丰富,乳腺癌癌细胞浸润血管并沿血路转移是乳腺癌转移的一种主要模式,甚至在手术切除肿瘤后仍可存在于全身循环中,而且hMAM是一种潜在分泌蛋白,在乳腺癌患者血清中可以检测到它的存在,这就使基于的乳腺癌血清学检查成为可能。因此建立外周血hMAM蛋白快速检测方法,可用于乳腺癌复发及转移的监测,尤其可以预测微小转移的发生,指导临床医生对乳腺癌疾病的早发现、早诊断和早治疗。
目前尚无有效的hMAM快速检测方法。癌转移是致使乳腺癌患者死亡的首要原因。但目前即使高分辨率的成像技术也不能检测到肿瘤细胞的早期转移。流式细胞术、RT-PCR、ELISA等具有较高敏感性的检测方法可以用来筛查外周血中扩散的癌细胞以及癌基因的表达。利用RT-PCR检测血清中hMAM mRNA表达以筛查乳腺癌微转移比较常见,但该方法也有一定的缺陷:mRNA易降解,致使血液标本不能长时间保存,而在短时间内又不能得到大量的乳腺癌患者血液标本用于较大规模的检测、统计及分析。ELISA方法可以定量检测,但在每次检测时均需要建立标准曲线,不适合乳腺癌小样本检测。因此,迫切需要建立一种适合基层医疗机构hMAM快速检测方法。
POCT是血清学检测的重要发展方向,POCT(Point Of Care Testing)是检验医学发展的新领域,作为一种新的临床检测手段,具有快速简便、现场分析等特点,得以顺应现代社会快节奏的工作方式并满足个性化的服务要求。时间分辨荧光免疫层析(TRFIA)是利用含有镧系元素的荧光微球直接对抗体进行标记,通过荧光的强弱来分析待检物质的浓度,可准确定量,检测的灵敏度高,且可通过简易的荧光层析仪实现快速定量,现已成为血清学检测重要方法之一,是一种较好的体外诊断方法。
CN 104931701A一种用于乳腺癌筛查的综合检测盒,其权利要求1中虽然记载了将乳腺珠蛋白单克隆抗体包被于硝酸纤维素膜作为其中一条检测线,并采用胶体金结合垫的反应卡,但是其说明书中并未记载与乳腺珠蛋白相关的具体实施方案。目前尚未见有用于检测乳腺癌珠蛋白hMAM的快速检测方法公开。
发明内容
本发明提供一种乳腺癌标志物hMAM检测试纸条,以实现乳腺癌标志物hMAM的快速检测。
本发明还提供了上述乳腺癌标志物hMAM检测试纸条的制备方法。
本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条采用如下技术方案:一种乳腺癌标志物hMAM检测试纸条,包括底板、样品垫、微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述样品垫、微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接设置在所述底板上,所述微球垫上固定有hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物,所述硝酸纤维素膜上包被有检测线T线和质控线C线,所述T线处包被有hMAM单克隆抗体Ab1,所述C线处包被有羊抗鼠抗体Ab2。
优选的,所述样品垫与微球垫的搭接处、所述微球垫与硝酸纤维素膜的搭接处以及所述硝酸纤维素膜与吸水垫的搭接处均重叠1-2mm。
优选的,所述hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物由荧光微球于缓冲液中经EDC和NHS活化后制得的活化液与hMAM单克隆抗体Ab1’震荡偶联,加复溶液复溶,再加封闭液封闭制成。
优选的,所述缓冲液为硼酸缓冲液。
优选的,所述复溶液包括缓冲液、生物活性保护剂、表面活性剂和微生物抑制剂,所述表面活性剂选自PVP、PEG-200、Triton X-100、或甘氨酸中的任意一种或几种,所述生物活性保护剂选自BSA和海藻糖/蔗糖,所述微生物抑制剂为NaN3。复溶液可起到溶解单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物的作用,性能良好的复溶液可在溶解单克隆抗体Ab1’-
荧光微球复合物时溶解的更均匀,进而使乳腺癌标志物hMAM检测试纸条检测的线性范围更宽,非特异性吸附更少。例如复溶液可为:复溶液配方1:0.05M PH 8.0Tris-HCL、0.1%
PVP(质量百分数)、1%BSA(质量百分数)、3%海藻糖(质量百分数)、0.5%甘氨酸(质量百分数)、0.1%Tween-20(质量百分数)、0.05%PEG-200(质量百分数)和0.05%
NaN3(质量百分数,上述各组分的浓度均为终浓度);复溶液配方2:0.05M PH8.0Tris-HCl、0.1%PVP(质量百分数)、0.5%BSA(质量百分数)、3%海藻糖(质量百分数)、1%
Triton X-100(质量百分数)和0.05%NaN3(质量百分数,上述各组分的浓度均为终浓度)等。
优选的,所述封闭液为质量分数5%-15%BSA。
优选的,所述微球垫有玻璃纤维膜经处理液处理后,再在所述玻璃纤维膜上固定单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物制成,所述处理液包括缓冲液、蔗糖/海藻糖、BSA和表面活性剂,所述表面活性剂选自PVP、PEG-200、Triton X-100、或甘氨酸中的任意一种或几种。例如,处理液的配方可为:处理液配方1:0.1M PH 8.0Tris-Hcl、0.1%Tween-20(质量百分数)、0.5%~1%BSA(质量百分数)、3%海藻糖(质量百分数)、0.05%NaN3(质量百分数,上述各组分的浓度均为终浓度);配方2为0.05M PH 8.0Tris-HCL、0.5%BSA(质量百分数)、0.1%Tween-20(质量百分数)、3%蔗糖(质量百分数)、0.05%NaN3(质量百分数,上述各组分的浓度均为终浓度);处理液具有促进玻璃纤维膜和单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物结合的作用,使荧光微球在玻璃纤维膜上的分布更均匀。实验证明,处理液配方2(0.05M PH8.0Tris-HCL、0.5%BSA、0.1%Tween-20、3%蔗糖、0.05%NaN3)的效果更好。
优选的,所述T线处hMAM单克隆抗体Ab1的浓度为1.0mg/mL-2.0mg/mL,所述C线处羊抗鼠抗体Ab2的浓度为1.0mg/mL-2.0mg/mL。
一种如上所述的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条的制备方法,包括如下步骤:(1)分别制备微球垫和包被有T线和C线的硝酸纤维素膜;(2)分别在所述硝酸纤维素膜的两端粘贴微球垫和吸水垫,所述微球垫和吸水垫分别叠压在所述硝酸纤维素膜两端端部的上方;(4)将样品垫叠压在所述微球垫远离所述硝酸纤维素膜的一端的上方。
优选的,所述微球垫的制备包括如下步骤:(1)活化微球:向缓冲液中加入荧光微球,超声;加入EDC和NHS活化剂超声,涡旋混匀;振荡活化;离心,去上清,并加入缓冲液复溶,得到荧光微球活化液;(2)将hMAM单克隆抗体Ab1’与荧光微球活化液偶联:
向所述荧光微球活化液中加入hMAM单克隆抗体Ab1’涡旋混匀,超声;振荡偶联,离心,
去上清,向沉淀中加入复溶液复溶,超声;加入封闭液,振荡,涡旋混匀,得hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物;(3)将hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物固定在所述微球垫上:向预先经处理液处理后得到的玻璃纤维膜上匀速滴加hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物,干燥,即得微球垫。超声处理(在缓冲液中加入微球后、加入活化剂EDC和NHS后、加入hMAM单克隆抗体Ab1’后)可使荧光微球与hMAM单克隆抗体Ab1’的结合更均匀,进而使得所制得的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条的精密性更好。
本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条还可制成检测卡或检测盒:将乳腺癌标志物hMAM检测试纸条设置在塑料卡壳内,塑料卡壳对应样品垫的位置处设置加样孔,对应硝酸纤维素膜的位置处设置观察窗,以更好的保护乳腺癌标志物hMAM检测试纸条,减少由于操作环境中的其他物质对试纸条的污染对检测结果造成的影响,也便于检测时手持试纸条。
此外,本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条也可用于和一次性采血针、消毒装置、样品收集瓶、移液管和荧光免疫层析读数仪等检测过程中用到的仪器组合在一起做成检测盒,以使使用时更方便。
本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条的原理:根据双抗体夹心法的原理,当待测样本中含有hMAM时,hMAM-hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物将同时被T线(包被有hMAM单克隆抗体Ab1,单克隆抗体Ab1和单克隆抗体Ab1’可与hMAM的不同抗原表位结合)和C线(包被有羊抗鼠抗体Ab2)捕获,生成有荧光标记的复合物,紫外灯照射下T线和C线处均有荧光条带,检测结果为阳性;反之,检测样本中不含hMAM时,则只在C线位置出现荧光条带,检测结果为阴性;如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效(参见说明书附图图5)。T线处条带颜色越深说明待测样本中含有的hMAM含量越高。
本发明的有益效果是:(1)本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条可快速定量/定性检测人血清中hMAM含量,检测时间大大缩短,为乳腺癌早期诊断提供依据;本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条无需借助大型医疗检测设备,可应用于社区基层医院,可提升乳腺癌早期筛查率,应用范围广。
(2)本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条的检测灵敏度好、线性范围宽且精密性好。线性范围为6.25ng/ml-400ng/ml,cut off值为:8.63ng/ml。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条的结构示意图;
图2为按照本发明的方法分别两种复溶液配方(其余处理均相同)得到的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条的检测结果对比图;
图3为在制备hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物制备过程中超声处理与不超声处理(其余处理均相同)得到的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条的检测结果对比图;
图4为采用本发明的方法制备的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条绘制的hMAM浓度-T/C值标准曲线图;
图5为本发明的乳腺癌标志物hMAM检测试纸条制成检测卡后样品检测的结果判断图;
图6为本发明与市面上已有的检测hMAM的ELISA试剂盒检测结果拟合线性比对图;
图中:1-样品垫;2-结合垫;3-硝酸纤维素膜;4-T线;5-C线;6-吸水垫;7-底板。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1 hMAM的免疫层析试纸条的制备
1.1微球垫的制备
1.1.1 hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物制备
取400ul 0.05M pH 8.0硼酸缓冲液加入5ul微球,超声2分钟。加10ul活化剂1mg/ml EDC(现配现用)、1mg/ml NHS,超声1分钟,旋涡混匀,放入摇床低速振荡活化30min;活化后15000r/min离心15min,弃上清,加入500ul 0.05M pH8.0硼酸缓冲液复溶沉淀,旋涡混匀,超声5分钟。加入5ug hMAM单克隆抗体(Ab1’),涡旋混匀,超声1分钟。放入摇床低速振荡偶联2h。15000r/min离心15min,弃上清,加入1250ul复溶液复溶,再用20ul封闭液(10%BSA)封闭30min,所述复溶液的组成(复溶液配方1)为0.05M PH 8.0Tris-HCL、0.1%PVP(质量分数)、1%BSA(质量分数)、3%海藻糖(质量分数)、0.5%甘氨酸(质量分数)、0.1%Tween-20(质量分数)、0.05%PEG-200(质量分数)和0.05%NaN3(质量分数,上述各组分的浓度均为终浓度)。
1.1.2将hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合固定在玻璃纤维膜上
将玻璃纤维膜裁成30mm*7mm宽大小,按照每1cm加64ul处理液进行浸泡处理,捞出后置于电热鼓风干燥箱中干燥2h,采用三维点膜喷金仪将制备的hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物,按照每1cm加60ul的比例均匀喷涂于处理好的玻璃纤维膜上,置于干燥间,于温度37℃、湿度10%下干燥2h,制备成结合垫;处理液的组成为0.05M PH 8.0Tris-HCL、0.5%BSA(质量分数)、0.1%Tween-20(质量分数)、3%蔗糖(质量分数,上述各组分的浓度均为终浓度)。
1.2在硝酸纤维素膜上包被T线和C线
采用0.05M PBS稀释hMAM单克隆抗体(Ab1)并标记;将硝酸纤维素膜粘贴在底板(PVC板)的中间位置,设置三维点膜喷金仪划线速度10cm/s,划线浓度1.0ul/cm。在T线处包被1mg/ml~2.0mg/ml hMAM单克隆抗体(Ab1)、在C线处包被1mg/ml~2.0mg/ml羊抗鼠二抗(Ab2),然后置于37℃下干燥2h。
1.3试纸条组装:
将样品垫、微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接组装在底板(PVC板)上,其中,吸水垫和结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端(分别重叠1-2mm),并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区;样品垫交叠压在结合垫上(重叠1-2mm),组装后切割成宽3.9mm的试纸条,放入加有干燥剂的铝箔袋中。
1.4试纸条的检测限及线性范围:配置一系列浓度梯度的hMAM标准液:0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400(ng/ml),取70uL滴加到免疫层析试纸条上,5min后用检测仪读取T线和C线的荧光强度,分别将T/C的荧光强度及对应的hMAM标准液浓度做拟合曲线,得到荧光强度与浓度对应的公式。线性拟合曲线见说明书附图2中用三角形标记的线条,标准曲线方程为y=0.032x+0.25,R2=0.992。
实施例2:将复溶液替换为:0.05M PH 8.0Tris-HCl、0.1%PVP、0.5%BSA、3%海藻糖、1%Triton X-100、0.05%NaN3(复溶液配方2),其余操作和所用到的试剂均与实施例一相同,对下述浓度梯度的hMAM标准液:0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400(ng/ml)进行检测(检测方法同实施例一),分别将T/C的荧光强度(纵坐标)及对应的hMAM标准液浓度(横坐标)做拟合曲线,得到荧光强度与浓度对应的公式。标准曲线方程为y=0.026x+0.2319,R2=0.9793,线性拟合曲线见说明书附图2中用圆点标记的线条(复溶液为复溶液配方1时所得到的标准曲线方程和线性拟合曲线见说明书附图图2中用三角形标记的线条。复溶液配方1为0.05M PH 8.0Tris-HCL、0.1%PVP、1%BSA、3%海藻糖、0.5%甘氨酸、0.1%Tween-20、0.05%PEG-200、0.05%NaN3)。
结论:复溶液的组分为复溶液配方1(0.05M PH 8.0Tris-HCL、0.1%PVP、1%BSA、3%海藻糖、0.5%甘氨酸、0.1%Tween-20、0.05%PEG-200、0.05%NaN3)时,hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球的溶解更均匀,所制得的试纸条的检测线性范围更宽,非特异性吸附较少。详见说明书附图图2。
实施例3:用50ng/ml的标准品分别检测hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物制备过程中超声和不超声两种处理情况下得到的试纸条(试纸条的其他制备方法和所用试剂均与实施例1相同),分别检测10次。由CV=SD/X,得出若hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物制备过程中不进行超声,试验10次得到的CV值为7.2%;若hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物制备过程中进行超声处理(在缓冲液中加入微球后、加入活化剂EDC和NHS后、加入hMAM单克隆抗体Ab1’后),试验10次得到的CV值为3.2%,具体实验数据详见说明书附图图3。由此可知,超声处理可使荧光微球与hMAM单克隆抗体Ab1’的结合更均匀,试纸条的精密性更好。
实施例4:本发明的试纸条性能验证:
4.1线性范围:
采用实施例1制备得到的试纸条分别对各浓度线性质控品(0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400ng/mL)重复检测10次,绘制校准曲线,经数据拟合和统计分析,得标准曲线方程y=0.0339x+0.2246,R2=0.9962(详见说明书附图图4),本发明试纸线性检测范围为6.25ng/ml-400ng/ml。将上述标准曲线预先设置在荧光免疫层析读数仪中,定量检测时,取血清样品65μL加入加样孔中,将试纸条放入荧光免疫层析读数仪中,5min后试纸条在荧光层析读数仪读取荧光强度值,根据标准曲线(绘制出标准曲线后可预先存储于荧光免疫层析读数仪中,即可直接读出所检测样品中hMAM的含量)计算hMAM含量。
4.2定性检测:已知酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乳腺癌血清hMAM的cut off值为:8.63ng/ml,若样本中hMAM的浓度大于8.63ng/mL,采用本发明的试纸条定性检测时,T线和C线处均有荧光,因此本发明制备的试纸条可以满足正常人及乳腺癌患者血清hMAM的检测。检测时取血清样品65μL加入加样孔中,5min后将试纸条置于紫外灯下,判读结果。根据双抗体夹心法的原理,当待测样本中含有hMAM时,hMAM-hMAM单克隆抗体Ab1’-荧光微球复合物将同时被T线和C线捕获,生成有荧光标记的复合物,紫外灯照射下T线和C线处均有荧光条带,检测结果为阳性;反之,检测样本中不含hMAM时,则只在C线位置出现荧光条带,检测结果为阴性;如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效(参见说明书附图图5)。T线处条带颜色越深说明待测样本中含有的hMAM含量越高。
4.2精密性:
采用实施例1制备的hMAM荧光免疫层析试纸条分别检测3种精密性质控品:hMAM低值(5ng/ml)、中值(10ng/ml)和高值(50ng/ml),分别重复检测10次,进行精密性测定。利用T线荧光强度的变异系数计算得出高值CV=5.1%,中值CV=7.3%,低值CV=8.8%,结果下表1所示:
表1
精密性 |
均数 |
标准差 |
CV |
50ng/mL |
2.082020795 |
0.106564228 |
0.051183076 |
10ng/mL |
0.581519233 |
0.04261381 |
0.073280138 |
5ng/mL |
0.404216816 |
0.035750341 |
0.088443479 |
本发明制备的试纸条检测结果CV值均小于15%,说明该试纸条精密性良好。
实施例5:方法学比对
取20份经市面上已有的人乳腺珠蛋白(hMAM)ELISA试剂盒检测过的不同浓度的血清标本,用实施例1制备的试纸条进行检测,以实施例1自制的试纸条检测的hMAM浓度为纵坐标,以ELISA试剂盒检测到的hMAM浓度为横坐标,建立相关线性分析,如图6所示,拟合获得的方程为y=0.9367x+7.7372,相关系数R2为0.989,两者相关性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。