CN109580942B - Qx型ibv的细胞适应株mj在制备全病毒抗原elisa检测试剂盒中的应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种QX型IBV的细胞适应株MJ在制备全病毒抗原ELISA检测试剂盒中的应用及试剂盒，属于病毒抗体检测技术领域。本发明所述应用中，采用的QX型IBV的细胞适应株MJ的保藏编号为CGMCC No.14681，该细胞适应株MJ不含其它病毒抗原、只与IBV阳性血清特异性结合并且与其它病毒阳性血清不发生交叉反应，在Vero细胞中有效增殖，应用这一细胞适应株MJ有效地解决了IBV全病毒纯化难以及非特异性高的问题。本发明还提供基于细胞适应株MJ构建的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，检测灵敏度高、特异性强，可用于检测QX型IBV的早期感染，还可用于检测弱毒苗免疫后鸡群的早期抗体水平。

Description

QX型IBV的细胞适应株MJ在制备全病毒抗原ELISA检测试剂盒 中的应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒抗体检测技术领域，具体涉及QX型IBV的细胞适应株 MJ在制备全病毒抗原ELISA检测试剂盒中的应用及试剂盒。

背景技术

鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的急性高度接触性的呼吸道传染病。该病在世界范围内广泛流行，是严重危害养禽业的主要病毒性传染病之一。由于IBV极易发生变异，导致新的变异株不断出现，且不同毒株之间交叉保护性弱，使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发，造成了巨大的经济损失，严重制约了我国养禽业的健康发展。

目前IBV的实验室诊断方法主要有：病毒分离鉴定、鸡胚中和试验、琼扩实验、血凝抑制试验(HI)、间接免疫荧光试验(IFA)和酶联免疫吸附试验 (ELISA)。常规的病毒分离鉴定以及鸡胚中和试验操作繁琐，试验周期较长。琼扩实验的灵敏度较低。血凝抑制试验中，由于IBV不具备天然凝集红细胞的能力，其血凝抗原需经过卵磷脂酶C的处理，与此同时，为了降低血清中的非特异性，检测血清还需经过高岭土的预处理，因此试验操作复杂，且具有不稳定性。IFA试验虽可以有效检测病料中的病毒抗原，但荧光标签的抗体成本较高，且对实验仪器要求高，不具备通用性。

ELISA检测作为血清学检测方法，灵敏度高，成本低且操作方便，适用于大规模的检测。目前市场上多以重组表达IBV的一种或多种结构蛋白或抗原表位为主，如2010年山东省农业科学院家禽研究所团队通过原核表达IBV N蛋白包被的IBV抗体的间接ELISA试剂盒，和2016年浙江大学周继勇团队原核表达 IBV非结构蛋白nsp5构建的nsp5ELISA抗体检测试剂盒，以及2017年四川大学王红宁团队发明的一种基于IBV串联抗原S-M-N的免疫磁性微球-ELISA检测 IBV抗体的方法。这些方法虽然回避了IBV病毒纯化难度大的问题，但是原核表达病毒蛋白抗原容易影响蛋白的天然结构从而影响抗原抗体结合效率。另外，由于IBV的纤突蛋白在超速离心过程中容易脱落，该病毒的提纯难度较大，全病毒抗原包被的ELISA检测方法存在灵敏度较低的问题，而未经提纯的全病毒尿囊液中的杂蛋白含量较高，同样影响了检测的特异性。虽然2012年江苏省农科院侯继波团队通过制备的IBV单抗包被的酶标板对IBV全病毒进行纯化去除尿囊液中的杂蛋白来制备检测IBV抗体的间接ELISA试剂盒，但该方法的生产成本较高，且操作相对繁琐。因此，目前市场上仍然缺乏生产工艺简单、敏感性好、特异性高的IBV全病毒抗原ELISA检测试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明为了解决现有的IBV的ELISA检测试剂盒特异性较低的问题，提供一种QX型IBV的细胞适应株MJ在制备全病毒抗原ELISA检测试剂盒中的应用，利用该细胞适应株MJ特异性高、不含有其它病毒抗原、纯化简单的特点，可以制备得到灵敏度高、特异性强的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种QX型IBV的细胞适应株MJ在制备全病毒抗原ELISA 检测试剂盒中的应用，所述QX型IBV的细胞适应株MJ的保藏编号为 CGMCC No.14681。

本发明还提供了一种QX型IBV的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，包括以下组分：

包被有灭活的细胞适应株MJ的检测板；所述细胞适应株MJ的保藏编号为CGMCCNo.14681；

包被缓冲液；

抗体稀释液；

洗涤液；

标准阳性血清；

标准阴性血清；

酶标二抗；

显色液；

终止液。

优选的，所述包被缓冲液为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液；

所述抗体稀释液为质量体积浓度1％～5％脱脂奶的PBS缓冲液；

所述洗涤液为体积浓度0.05～0.2％吐温-20的PBS缓冲液；

所述标准阳性血清为抗QX型IBV株和M41毒株的SPF鸡血清；

所述标准阴性血清为7日龄阴性SPF鸡血清；

所述酶标二抗为HRP标记的羊抗鸡IgG抗体；

所述显色液为TMB底物显色液；

所述终止液为2mol/L硫酸溶液。

优选的，所述细胞适应株MJ的灭活方法包括加温灭活法、BEI灭活法或β-丙内酯灭活法。

优选的，灭活的细胞适应株MJ的包被浓度为100～300μg/mL。

优选的，所述包被灭活的细胞适应株MJ的检测板制备方法如下：

(1)制备灭活的全病毒抗原：将细胞适应株MJ接种Vero细胞，培养后收集上清液；对所得上清液灭活，得到灭活的细胞适应株MJ；

(2)将灭活的细胞适应株MJ按照100μL/孔添加到检测板的孔中， 35～38℃孵育2h，弃去剩余灭活的细胞适应株MJ，洗涤液洗涤2～4次，加入封闭液在37℃下孵育1h，洗涤液洗涤2～4次，即得包被有灭活的细胞适应株 MJ的检测板。

优选的，所述QX型IBV株为IBYZ分离株，保藏编号为CGMCC No.14682。

优选的，所述标准阳性血清的制备方法包括：

将M41毒株与IBYZ分离株均以10⁴EID50/只的浓度免疫1日龄SPF雏鸡， 14日龄时重复上述步骤再次免疫，30日龄时分离该SPF雏鸡的血清，得到标准阳性血清。

优选的，所述标准阳性血清和标准阴性血清的稀释度独立地为1:50～400。

本发明还提供了上述技术方案所述全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)以抗体稀释液1:50～400稀释待测血清，将稀释的待测血清加入包被有灭活的细胞适应株MJ的检测板，同时设置标准阳性血清和标准阴性血清作为对照，35～38℃第一孵育0.5～1.5h，第一洗涤3～6次；

(2)以抗体稀释液稀释酶标二抗，稀释后的酶标二抗添加至洗涤后检测板中，35～38℃第二孵育0.5～1.5h，第二洗涤3～6次；

(3)向检测板中添加显色液，35～38℃避光孵育10～25min，加入终止液；

(4)测定终止后溶液的OD_450nm下读值，计算S/P值：

S/P值＝(待检血清OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)/(阳性对照 OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)；

如待检血清样品的S/P值大于0.2，则判定为抗体阳性，反之判定为阴性。

本发明提供了一种QX型IBV的细胞适应株MJ在制备全病毒抗原ELISA 检测试剂盒中的应用，所述QX型IBV的细胞适应株MJ的保藏编号为 CGMCC No.14681。发明人提供的细胞适应株MJ不含其它病毒抗原、只与IBV 阳性血清特异性结合并且与其它病毒阳性血清不发生交叉反应的分子克隆株，能够在Vero细胞中有效增殖，以该细胞适应株MJ作为全病毒抗原制备试剂盒可解决了IBV全病毒纯化难以及非特异性高的问题。

本发明提供了一种基于QX型IBV的细胞适应株MJ构建的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，包括包被有灭活的所述细胞适应株MJ的检测板、包被缓冲液、抗体稀释液、洗涤液、标准阳性血清、标准阴性血清、酶标二抗、显色液和终止液。本发明首次采用所述细胞适应株MJ作为全病毒包被抗原，检测灵敏度高、特异性强、重现性好，可用于检测QX型IBV的早期感染，还可用于检测弱毒苗免疫后鸡群的早期抗体水平。本试剂盒比现有的 IDEXX试剂盒检测灵敏度更优、特异性更强，并且成本低廉，适合批量样品检测。

生物材料保藏说明

QX型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的细胞适应株MJ，于2017年8月 31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No.14681，分类命名为传染性支气管炎病毒，拉丁文名称为 InfectiousBronchitis Virus。

IBYZ分离株于2017年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No.14682，分类命名为传染性支气管炎病毒，拉丁文名称为InfectiousBronchitis Virus。

附图说明

图1为实施例6中绘制的ROC曲线；

图2为实施例8中不同检测试剂盒对不同免疫时间下的样品检出数；

图3为实施例8中不同检测试剂盒对不同免疫时间下的阳性样品检出率。

具体实施方式

本发明提供了一种QX型IBV的细胞适应株MJ在制备全病毒抗原ELISA 检测试剂盒中的应用，所述QX型IBV的细胞适应株MJ的保藏编号为 CGMCC No.14681。在本发明中，所述QX型IBV的细胞适应株MJ作为全病毒抗原应用于试剂盒的制备，该细胞适应株MJ只含有IBV的抗原，不与其它病毒发生交叉反应，杂蛋白干扰少，纯化操作简单、特异性高。

本发明还提供了上述技术方案所述QX型IBV的细胞适应株MJ在制备全病毒抗原ELISA检测试剂盒中的应用。所述QX型IBV的细胞适应株MJ 在ELISA试剂盒中作为抗原使用，相对于以一种或多种结构蛋白或抗原表位的IBV检测试剂盒而言，全病毒抗原包被的试剂盒检测灵敏度更高且适用的检测范围更广。

具体的，本发明还提供了一种QX型IBV的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，包括以下组分：

包被有灭活的前述技术方案所述细胞适应株MJ的检测板；

包被缓冲液；

抗体稀释液；

洗涤液；

标准阳性血清；

标准阴性血清；

酶标二抗；

显色液；

终止液。

在本发明中，所述包被有灭活的前述技术方案所述细胞适应株MJ的检测板中，灭活的所述细胞适应株MJ包被浓度优选为100～300μg/mL，更优选为 220～240μg/mL。在本发明中，所述细胞适应株MJ的灭活方法包括但不限于加温灭活法、BEI灭活法或β-丙内酯灭活法；更优选的，采用β-丙内酯1:1000 对所述细胞适应株MJ进行灭活，此时的P/N值(灭活剂的阳性平均值P/阴性平均值N)更高，操作更为简易和安全。

在本发明中，所述包被灭活的细胞适应株MJ的检测板优选的制备方法如下：

(1)制备灭活的全病毒抗原：将前述技术方案所述细胞适应株MJ接种 Vero细胞，培养后收集上清液；对所得上清液灭活，得到灭活的细胞适应株 MJ；

(2)将灭活的细胞适应株MJ按照100μL/孔添加到检测板的孔中， 35～38℃孵育2h，弃去剩余灭活的细胞适应株MJ，洗涤液洗涤2～4次，加入封闭液在37℃下孵育1h，洗涤液洗涤2～4次，即得包被有灭活的细胞适应株 MJ的检测板。

本发明取所述细胞适应株MJ的病毒尿囊液，优选的按照0.5～2×10⁷病毒拷贝数/瓶接种Vero细胞，以无血清DMEM培养基进行培养，收集培养的上清液。在本发明中，所述培养温度优选为35～38℃，更优选为37℃；所述培养时间优选为32～40h，更优选为36h。在本发明中，所述收集上清液的方法优选为离心分离，所述离心速率优选为2600～3000×g、更优选为2850×g，所述离心时间优选为8～15min、更优选为10min。

分离得到上清液后，本发明对所述上清液进行灭活，所述灭活方式如前所述，在此不再赘述。

本发明优选的在灭活后的上清液中添加聚乙二醇6000和氯化钠进行纯化，所述聚乙二醇6000优选的添加至上清液中终浓度6～10％，更优选为8％；所述氯化钠优选的添加至上清液中终浓度为0.3～0.8mol/L，更优选为 0.5mol/L。添加聚乙二醇6000和氯化钠纯化后，本发明对纯化后的上清液进行离心，弃去上清，取沉淀重悬，得到灭活的细胞适应株MJ。在本发明中，所述离心条件优选为：7000～10000×g离心25～40min，更优选为8000×g离心30min。在本发明中，重悬所述沉淀的溶液优选为PBS缓冲液。本发明所述细胞适应株MJ的纯化步骤简单，成本低，重复性好。

得到灭活的细胞适应株MJ后，本发明将所述灭活的细胞适应株MJ稀释至包被浓度，按照100μL/孔添加到检测板的孔中，35～38℃孵育2h进行包被，反应结束后以洗涤液洗涤检测板2～4次；再加入封闭液在37℃下孵育1h，洗涤液洗涤2～4次，即得包被有灭活的细胞适应株MJ的检测板。在本发明的具体实施例中，采用37℃下作用2h的抗原包被条件，其P/N值显著高于35～38℃孵育1h以及4℃下过夜包被条件。

在本发明中，所述封闭液优选为质量体积浓度1％～5％脱脂奶的PBS缓冲液，更优选为质量体积5％脱脂奶的PBS缓冲液。本发明的具体实施方式表明，与质量浓度1％的BSA溶液、质量浓度2％的BSA溶液以及体积浓度10％的小牛血清作为封闭液相比，质量体积浓度1％～5％脱脂奶的PBS缓冲液为缓冲液的P/N值显著高于其它。

在本发明中，所述包被缓冲液优选为pH9.6的碳酸盐缓冲液；具体的，所述pH9.6的碳酸盐缓冲液(1000mL)为碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.93g的水溶液。本发明所述包被缓冲液用于稀释抗原。

在本发明中，所述抗体稀释液优选为质量体积浓度1％～5％脱脂奶的PBS 缓冲液，更优选为2％脱脂奶的PBS缓冲液。本发明的具体实施方式表明，当脱脂奶质量浓度达到5％时，阳性血清值下降显著，因而选择本发明所述浓度下的抗体稀释液作为最佳抗体稀释液。本发明所述抗体稀释液用于稀释标准阳性血清、标准阴性血清、待测血清和酶标二抗。

在本发明中，所述洗涤液优选为体积浓度0.05～0.2％吐温-20的PBS缓冲液，更优选为0.05％吐温-20的PBS缓冲液。在本发明中，所述洗涤液用于 ELISA检测时的各步骤清洗。

在本发明中，所述标准阳性血清优选为抗QX型IBV株和M41毒株的SPF 鸡血清；所述QX型IBV株更优选为IBYZ分离株，保藏编号为CGMCC No.14682。该IBYZ分离株为QX型强毒株的分子克隆株，由于市场上多数 QX型IBV株存在抗原不纯的问题，可能混杂有其它病毒株或病毒无法纯化，本发明为了进一步确保检测结果的稳定性和特异性，采用保藏编号为CGMCC No.14682的IBYZ分离株。所述IBYZ分离株中仅含有QX型IBV的抗原，制备的标准血清特异性更有保障。

在本发明中，所述标准阳性血清制备方法优选为：将抗QX型IBV株和 M41毒株以10⁴EID₅₀/只的浓度通过免疫1日龄的SPF雏鸡，14日龄时以相同方式再次免疫，待30日龄时采血分离血清，即得。

在本发明中，所述标准阴性血清优选为7日龄阴性SPF鸡血清，具体制备方法优选为：取7日龄健康的SPF雏鸡，采血分离血清，即得。

在本发明中，所述标准阳性血清和标准阴性血清的稀释度独立地优选为 1:50～400，更优选为1:200。

在本发明中，所述酶标二抗优选为HRP标记的羊抗鸡IgG抗体。在本发明中，所述显色液优选为TMB底物显色液。在本发明中，所述终止液优选为 2mol/L硫酸溶液。酶标二抗中的过辣根过氧化物酶(HRP)催化TMB显色，添加终止液后停止催化反应，以酶标仪等测定显色溶液的OD值即可实现ELISA 的定量检测。本发明对所述酶标二抗、显色液和终止液的来源无特殊限定，购买市售商品或自行制备均可。

采用本发明提供的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒进行检测时，与新城疫病毒、禽流感病毒以及传染性法氏囊病毒均不发生交叉反应，特异性高；检测灵敏度99.58％，同一批次内以及批次间的重复性好；与市售的IDEXX 试剂盒相比阳性检出率差异显著，并且IDEXX试剂盒对于QX型IBV弱毒苗免疫后短期内(14d和21d)的检出率较低，而本发明所述全病毒抗原间接 ELISA检测试剂盒可有效检出IBV弱毒苗免疫14d后的鸡体内抗体水平，表明本发明所述ELISA检测试剂盒的灵敏度更高，可适宜对早期感染的鸡进行检测。

本发明还提供了上述技术方案所述全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)以抗体稀释液1:50～400稀释待测血清，将稀释的待测血清加入包被有灭活的细胞适应株MJ的检测板，同时设置标准阳性血清和标准阴性血清作为对照，35～38℃第一孵育0.5～1.5h，第一洗涤3～6次；

(2)以抗体稀释液稀释酶标二抗，稀释后的酶标二抗添加至洗涤后检测板中，35～38℃第二孵育0.5～1.5h，第二洗涤3～6次；

(3)向检测板中添加显色液，35～38℃避光孵育10～25min，加入终止液；

(4)测定终止后溶液的OD_450nm下读值，计算S/P值：

S/P值＝(待检血清OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)/(阳性对照 OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)；

如待检血清样品的S/P值大于0.2，则判定为抗体阳性，反之判定为阴性。

本发明将待测血清以抗体稀释液1:50～400进行稀释，将稀释后的待测血清加入包被有灭活的所述细胞适应株MJ的检测板中，同时设置标准阳性血清和标准阴性血清作为对照，35～38℃第一孵育0.5～1.5h，第一洗涤3～6次。在本发明中，所述待测样本包括血清或血浆等可能含有待测病毒抗体的生物离体样本。本发明所述待测血清的稀释度优选为1:200，并且标准阳性血清和标准阴性血清的稀释度与待测血清的稀释度相同。

本发明设置标准阳性血清和标准阴性血清是为了使检测结果准确可信。所述稀释后的待测血清、标准阳性血清和标准阴性血清的每个反应孔添加液体量应保持一致。本发明优选的，所述稀释后的待测血清每孔添加量优选为 50～200μL，更优选为100μL。

在本发明中，所述第一孵育的温度优选为37℃，所述第一孵育的时间优选为1h。在本发明中，所述第一洗涤的次数优选为4～5次，所述第一洗涤的温度优选为18-30℃，更优选为20～25℃；本发明优选的，所述第一洗涤的多次洗涤间隔时间优选为0～5min(下同)。

第一洗涤完成后，本发明以抗体稀释液将酶标二抗稀释，稀释后的酶标二抗添加至洗涤后检测板中，35～38℃第二孵育0.5～1.5h，第二洗涤3～6次。在本发明中，所述酶标二抗的稀释度优选为5000～20000，更优选为1:10000. 在本发明中，所述稀释后的酶标二抗添加量优选为100μL。在本发明中，所述第二孵育时间优选为1h，第二孵育温度优选为37℃；本发明所述第二洗涤与第一洗涤相同，在此不再赘述。

第二洗涤完成后，本发明向第二洗涤后的检测板孔中添加显色液， 35～38℃避光孵育10～25min，加入终止液，得到显色的检测板。在本发明中，所述显色液的添加量优选为100μL/孔。在本发明中，所述避光孵育温度优选为37℃，所述避光孵育时间优选为15min。

观察或检测所述得到的显色的检测板，得到定性结果。本发明测定显色的检测板中每孔OD_450nm下读值，计算S/P值：

S/P值＝(待检血清OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)/(阳性对照 OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)；

如待检血清样品的S/P值大于0.2，则判定为抗体阳性，反之判定为阴性。

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

QX型IBV的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒包括以下组分：

包被有灭活的细胞适应株MJ(生物保藏编号CGMCC No.14681)的检测板；

所述包被缓冲液：pH9.6的碳酸盐缓冲液；

所述抗体稀释液：质量体积浓度2％脱脂奶的PBS缓冲液；

所述洗涤液：体积浓度0.05％吐温-20的PBS缓冲液(PBST)；

所述标准阳性血清：抗IBYZ分离株(保藏编号为CGMCC No.14682) 和M41毒株的SPF鸡血清；

所述标准阴性血清：7日龄阴性SPF鸡血清；

所述酶标二抗：HRP标记的羊抗鸡IgG抗体；

所述显色液：TMB底物显色液；

所述终止液为2mol/L硫酸溶液。

(1)制备灭活的QX型IBV细胞适应株MJ

取QX型IBV细胞适应株MJ的病毒尿囊液，通过q-PCR测定该尿囊液中的病毒拷贝数，选择1×10⁷病毒拷贝数/瓶接种Vero细胞，加入无血清DMEM 培养基于37℃培养36h，收集细胞上清。2850×g离心10min，弃除细胞沉淀，得到病毒上清液，按照β-丙内酯与病毒上清液体积比1:1000的比例加入β-丙内酯，置于4℃作用24h。将灭活后的病毒上清液置于37℃水浴2h，水解剩余的灭活剂β-丙内酯。

向灭活后的病毒上清液中加入聚乙二醇6000至终浓度为8％，加入NaCl 至终浓度为0.5mol/L，8000×g离心30min，弃上清，沉淀用一定量的PBS悬浮，得到灭活的细胞适应株MJ溶液；测定灭活的细胞适应株MJ溶液中的总蛋白含量，-70℃保存备用。

(2)制备包被有灭活的细胞适应株MJ的检测板

用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液(0.05mol/LNa₂CO₃和NaHCO₃)将抗原1:4 稀释，按照100μL/孔包被96孔酶标板，37℃包被2h，PBST洗涤3次；

每孔加入封闭液100μL，所述封闭液为质量体积浓度5％脱脂奶的PBS缓冲液。37℃封闭2h，PBST洗涤3次，即得。

(3)制备标准阳性血清和标准阴性血清

将M41毒株与IBYZ分离株(保藏编号为CGMCC No.14682)以10⁴EID₅₀/ 只通过滴鼻点眼同时免疫1日龄SPF雏鸡，14日龄以同样的方式进行二免， 30日龄采血分离收集血清待用，该血清即为标准阳性血清。

取7日龄健康SPF雏鸡采血，分离收集血清待用，该血清即为标准阴性血清。

对比例1

除不灭活外，其余操作均与实施例1相同。

对比例2

除灭活采用加温灭活法外，其余操作均与实施例1相同；

加温灭活法：将病毒上清液置于56℃水浴30min。

对比例3

除灭活采用BEI灭活法外，其余操作均与实施例1相同；

BEI灭活法：取BEA4.1g和0.2mol/L的NaOH溶液100mL混合，37℃水浴1h，即为质量浓度2％的BEI溶液。将上清液按体积比100:1的比例加入质量浓度2％的BEI溶液，室温灭活28h，以体积比50:1的比例加入质量体积浓度2％的硫代硫酸钠终止。

对比例4

除灭活时按照1:2000的比例加入β-丙内酯外，其余均与实施例1相同。

对比例5

除灭活时按照1:4000的比例加入β-丙内酯外，其余均与实施例1相同。

实施例2

QX型IBV的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒使用方法

(1)使用抗体稀释液1:200稀释待检血清，加入100μL/孔一抗，同时加入标准阳性血清和阴性血清对照，37℃作用1h，300μL/孔PBST洗板5次；

(2)使用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记的羊抗鸡IgG二抗，加入 100μL/孔，37℃作用1h，300μL/孔PBST洗板5次；

(3)显色：加入100μL/孔TMB显色液，37℃避光作用15min；

(4)终止：加入50μL/孔终止液；

(5)结果判定：

对酶标仪OD_450nm的读值进行S/P值的计算：

S/P值＝(待检血清OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)/(阳性对照 OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)。

实施例3

分别取实施例1和对比例1～4中制备的灭活后的病毒上清液，以pH9.6 的碳酸盐缓冲液按照体积比1:40稀释后，分别加入96孔酶标板中，4℃包被 24h后与标准阳性血清、标准阴性血清反应，按照实施例2所示的使用方法进行检测，结果如表1所示。

表1不同抗原灭活方法的ELISA读值比较

从检测结果来看(表1)，56℃灭活后，ELISA阳性读值最低，BEI灭活法阳性血清读值最高，β-丙内酯1:1000灭活后的阳性读值虽有所下降，但P/N 值最高。可见本发明选择β-丙内酯1:1000灭活方法制备ELISA检测的包被抗原的操作简易型以及安全性最好。

实施例4ELISA检测条件的优化

(1)抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定

对抗原抗体反应的最佳浓度使用方阵试验进行优化。使用碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)对包被抗原进行1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640 稀释，对阳性血清和阴性血清使用抗体稀释液进行1:50、1:100、1:200、1:400 稀释。ELISA反应后，测定OD_450nm吸光度值，计算P/N值(阳性血清OD_450nm均值/阴性血清OD_450nm均值)。

结果：如表2所示，纯化获得的抗原经稀释后，方阵试验的初始浓度为 938μg/mL，随着抗原和抗体稀释度的不断增加，阳性血清和阴性血清的OD 值均呈现出一定的下降趋势，说明阴性血清中存在一定的非特异性读值。

在P/N值≥2.1的基础上，综合考虑阳性血清和阴性血清读值，选择阳性读值OD_450nm为1.0左右的测试孔，即此时的抗原稀释度为1:40，抗原浓度为 234.5μg/mL，阳性血清和阴性血清的稀释度均为1:200。

表2不同抗原、抗体稀释度的方阵试验

(2)抗原最佳包被条件的确定

使用抗原最佳包被量，分别以37℃1h、37℃2h和4℃过夜3种不同的条件包被抗原，其余条件参照ELISA基本程序，选择1:200血清稀释度的阳性血清和阴性血清进行ELISA反应，确定抗原的最佳包被条件。

结果：如表3所示，37℃包被2h的OD_450nm阳性读值最高，且P/N值也显著高于其余两组。因此，选择37℃2h作为抗原的最佳包被条件。

表3不同抗原包被条件的ELISA读值分析

(3)封闭液的确定

使用最佳包被浓度经37℃2h包被检测抗原后，PBST洗涤3次，加入PBS 稀释的5％脱脂奶、1％BSA、2％BSA和10％小牛血清不同封闭液200μL/孔，37℃封闭2.5h后，其余条件不变，进行ELISA检测，确定封闭液的种类。

结果：如表4所示，选择5％脱脂奶、1％BSA、2％BSA和10％小牛血清作为封闭液进行ELISA检测，分析P/N值可以看出，5％脱脂奶的P/N值显著高于其它组，因此选择5％脱脂奶作为ELISA检测的封闭液。

表4不同类型封闭液的ELISA读值分析

(4)封闭时间的确定

以最佳抗原包被浓度和包被条件包被酶标板后，PBST洗涤5次，加入含 5％脱脂奶的PBS 200μL/孔作为封闭液，37℃1h、37℃2h和4℃封闭过夜，使用标准阳性血清和阴性血清进行检测，其它试验条件不变，测定ELISA读值，以确定封闭的最佳条件。

结果：经5％脱脂奶封闭液在不同条件下对酶标板进行封闭后，读值如表 5所示，阳性读值差异不明显的情况下，37℃封闭1h时，P/N值最大，因此选择该条件作为ELISA检测的最佳封闭条件。

表5不同封闭条件的ELISA读值分析

(5)抗体稀释液的选择

在确定了封闭液和封闭条件的基础上，分别配制浓度1％脱脂奶、2％脱脂奶和5％脱脂奶的PBS作为一抗、二抗的抗体稀释液，其它条件不变，计算 P/N值，以确定最佳抗体稀释液。

结果：如表6所示，虽然5％脱脂奶作为抗体稀释液后的P/N值最大，但阳性血清值下降显著，因此选择2％脱脂奶作为最佳抗体稀释液，此时的P/N 值为27。

表6不同抗体稀释液的ELISA读值分析

(6)一抗血清最佳反应时间的确定

以最佳抗原包被浓度和包被条件包被酶标板后，PBST洗涤3次，加入5％脱脂奶作为封闭液37℃封闭1h后，PBST洗涤3次，拍干，加入1:200稀释的阳性血清和阴性血清，置于37℃分别作用30min、60min和120min，其它作用条件不变，检测获取ELISA读值，计算分析P/N值后，确定最佳的一抗反应时间。

结果：如表7所示，虽然血清作用30min时，P/N的平均值最大，但其阳性血清读值显著低于作用60min和120min；而作用120min时，P/N值下降显著，非特异性反应增多。因此，综合考虑阳性血清读值和P/N值，选择一抗血清的最佳反应条件为37℃60min。

表7不同一抗作用时间的ELISA读值分析

(7)酶标二抗稀释度的确定

对HRP标记的羊抗鸡抗体分别按照1:5000、1:8000、1:10000和1:20000 稀释，37℃作用1h后，PBST洗涤5次，加入TMB底物显色液和终止液，进行ELISA检测，计算P/N值，综合分析，确定二抗的最佳稀释度。

结果：经不同浓度二抗作用后的结果如表8所示，1:8000和1:10000稀释组的阳性血清读值差异不大，1:10000稀释组P/N值略高，因此选择二抗的最佳稀释度为1:10000。

表8不同二抗作用浓度的ELISA读值分析

(8)酶标二抗作用时间的选择

确定酶标二抗的稀释浓度后对其作用时间进行选择。每孔加入 100μL1:10000稀释的酶标二抗，分别于37℃作用30min、45min、60min和 90min。在其它条件不变的情况下，进行ELISA检测，分析OD_450nm读值和P/N 值。

结果：如表9所示，虽然作用30min和45min时，P/N读值较高，但此时的阳性读值偏低。因此综合考虑阳性血清读值和P/N值，选择二抗的最佳作用时间为60min，此时的P/N值为29.883。

表9不同二抗作用时间的ELISA读值分析

(9)TMB底物反应时间的确定

选择TMB作为底物反应液，将其分别在37℃避光条件下显色5、7、10、 15、20min。其它反应条件不变，进行ELISA检测，比较分析阴阳性血清读值和P/N值，确定最佳底物反应时间。

结果：综合考虑阴阳性血清读值和P/N值，发现TMB作用15min时，阳性血清读值较高，且P/N值为28.565，选择该时间为TMB的底物反应时间。

表10不同TMB作用时间的ELISA读值分析

实施例5特异性试验

以建立的ELISA检测方法，分别对鸡新城疫病毒(NDV)阳性血清、禽流感病毒H5亚型阳性血清、禽流感病毒H7亚型阳性血清、禽流感病毒H9 亚型阳性血清以及传染性法氏囊病毒(IBDV)阳性血清(由扬州大学兽医学院传染病实验室提供)进行1:200稀释，同时设立IBV阳性血清和阴性血清作为对照，按照实施例2所示的使用方法，应用实施例1所示的ELISA检测试剂盒对上述血清样本进行检测，确定IBV ELISA的特异性。

结果：通过检测，AIV-H5Re-8株、AIV-H5Re-10株、AIV-H7、AIV-H9、 NDV和IBDV的阳性血清读值分别为0.0413、0.0455、0.109、0.05、0.02、0.028， S/P值均小于0.2；由此可见，该IBV ELISA检测方法与上述血清不发生交叉反应，具有良好的特异性。

表11不同种类病毒血清的特异性试验

实施例6ELISA检测临界值的确定

对已知背景的不同血清型的IBV阳性血清236份和阴性血清82份(其中部分为免疫后禽场的部分鸡的血清和本单位动物实验的进行免疫后获得的血清)，按照实施例2所示的ELISA检测方法进行检测，以标准阳性血清和标准阴性血清作为对照，测得OD₄₅₀值。根据测得的OD值计算S/P，公式为： S/P＝(样品OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值)/(阳性对照OD_450nm均值- 阴性对照OD_450nm均值)。待测样品的S/P值＞临界值则判定为阳性，S/P值≤临界值则判定为阴性。

通过SPSS软件绘制ROC曲线，分析获得QX型IBV抗体检测的间接 ELISA检测方法的灵敏度(Sensitivity)和特异性(Specificity)。经数据处理分析后，选择其最大约登指数所对应的S/P值，设为阴阳性血清的临界值 (Cut-offvalue)。

结果：对已知背景的318份临床样品进行IBV ELISA检测，以标准阳性血清和标准阴性血清作为参考，经SPSS软件绘制ROC曲线分析得出(如图 1所示)，在最大约登指数0.9958时，IBV ELISA的灵敏度为99.58％，特异性为100％，此时的S/P值约为0.2，因此设定临界值为0.2。

表12 ROC分析中部分灵敏度、特异性值及约登指数数值

实施例7重复性试验

1.批内重复性试验

按照实施例1所示的试剂盒组成，制备同一批抗原包被的酶标板，分别检测10份血清，重复试验4次，分别计算每个样品OD_450nm平均值(Mean)、标准差(SD)和变异系数(CV)，确定同批抗原的变异系数范围。结果如下表所示，同批抗原检测的10份样品的OD_450nm读值的变异系数介于2％～14％之间，说明抗原的批内重复性较好。

表13批内重复试验结果

2.批间重复性试验

按照实施例1所示的ELISA检测试剂盒制备3个不同批次的灭活抗原、在不同时间包被酶标板，同样使用10份血清，在相同试验条件下进行检测，每份血清平行做3个重复，对检测结果进行统计学分析。

结果表明，不同批次制备的抗原包被的酶标板，经检测后，批间重复试验的变异系数范围在5％-13％之间，显示出良好的重复性。

表14批间重复试验结果

实施例8IBV ELISA试剂盒与进口IDEXX试剂盒比对

选择不同来源的QX型IBV分离株按10⁴EID50接种1日龄SPF雏鸡共 266只，以PBS免疫组作为阴性对照的SPF雏鸡共67只，并于14日龄以后的每7d采集一次血清，收集共333份已知背景的血清。

分别以实施例1所示的QX型IBV ELISA试剂盒和进口IDEXX试剂盒(购自北京爱德士元亨生物科技有限公司)对上述已知背景的血清进行检测。结果如表15所示，在333份血清中，QX型IBV ELISA试剂盒的检测出阳性血清266份，阴性血清67份。进口IDEXX试剂盒检出阳性血清48份，阴性血清285份。两种试剂盒的检出率差异较大。

如图2和图3所示，对照动物实验的免疫背景，通过比较分析发现，IDEXX 试剂盒对于QX型IBV弱毒苗免疫后短期内(14d和21d)的检出率较低，而 QX型IBV ELISA试剂盒可以有效的检测出IBV弱毒苗免疫14d后的鸡体内的抗体水平。

表15与IDEXX公司的ELISA试剂盒检测结果的对比

综上所述，可以看出，本发明提供的细胞适应株MJ作为全病毒抗原包被制成的ELISA检测试剂盒，检测灵敏度高、特异性好，易于纯化，可适用于早期感染IBV或免疫后早期抗体的检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种灭活的QX型IBV的细胞适应株MJ在制备全病毒抗原ELISA检测试剂盒中的应用，所述QX型IBV的细胞适应株MJ的保藏编号为CGMCCNo.14681；

所述QX型IBV的细胞适应株MJ的灭活方法为β-丙内酯灭活法；

按照β-丙内酯与病毒上清液体积比1:1000的比例加入β-丙内酯。

2.一种QX型IBV的全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，包括以下组分：

包被有灭活的细胞适应株MJ的检测板；所述细胞适应株MJ的保藏编号为CGMCCNo.14681；所述QX型IBV的细胞适应株MJ的灭活方法为β-丙内酯灭活法；按照β-丙内酯与病毒上清液体积比1:1000的比例加入β-丙内酯；

包被缓冲液；

抗体稀释液；

洗涤液；

标准阳性血清；

标准阴性血清；

酶标二抗；

显色液；

终止液。

3.根据权利要求2所述全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，

所述包被缓冲液为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液；

所述抗体稀释液为质量体积浓度1％～5％脱脂奶的PBS缓冲液；

所述洗涤液为体积浓度0.05～0.2％吐温-20的PBS缓冲液；

所述标准阳性血清为抗QX型IBV株和M41毒株的SPF鸡血清；

所述标准阴性血清为7日龄阴性SPF鸡血清；

所述酶标二抗为HRP标记的羊抗鸡IgG抗体；

所述显色液为TMB底物显色液；

所述终止液为2mol/L硫酸溶液。

4.根据权利要求2所述全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，灭活的细胞适应株MJ的包被浓度为100～300μg/mL。

5.根据权利要求2～4任意一项所述全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被灭活的细胞适应株MJ的检测板制备方法如下：

(1)制备灭活的全病毒抗原：将细胞适应株MJ接种Vero细胞，培养后收集上清液；对所得上清液灭活，得到灭活的细胞适应株MJ；

(2)将灭活的细胞适应株MJ按照100μL/孔添加到检测板的孔中，35～38℃孵育2h，弃去剩余灭活的细胞适应株MJ，洗涤液洗涤2～4次，加入封闭液在37℃下孵育1h，洗涤液洗涤2～4次，即得包被有灭活的细胞适应株MJ的检测板。

6.根据权利要求3所述全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述QX型IBV株为IBYZ分离株，保藏编号为CGMCC No.14682。

7.根据权利要求6所述全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清的制备方法包括：

将M41毒株与IBYZ分离株均以10⁴EID 50/只的浓度免疫1日龄SPF雏鸡，14日龄时重复上述步骤再次免疫，30日龄时分离该SPF雏鸡的血清，得到标准阳性血清。

8.根据权利要求3、6或7所述全病毒抗原间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清和标准阴性血清的稀释度独立地为1:50～400。

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