CN109576176A - 一种纳米硒长双歧杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种纳米硒长双歧杆菌及其制备方法和应用。本发明制备的一种纳米硒长双歧杆菌在制备延缓糖尿病进程的药物或食品中的应用，包括：改善糖尿病生理指标的代谢状况、改善糖尿病肝脏、胰腺和肾脏的病理变化、改善糖尿病血清肌酐和血尿素氮水平、预防糖尿病肾脏并发症或肾功能损害的药物或食品中的应用。

Description

一种纳米硒长双歧杆菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种纳米硒长双歧杆菌及其制备方法和在制备延缓糖尿病进程的药物或食品中的应用。

背景技术

双歧杆菌是一种能够在人类胃肠道中自然生长，并且能保护宿主抵御病毒感染的细菌属，属于革兰氏阳性、非运动性、支链厌氧菌属。双歧杆菌已被作为益生菌使用来帮助消化。之前的研究表明，长双歧杆菌作为一种厌氧菌，对肝癌细胞有抗癌作用。一些研究报道了益生菌在包括糖尿病在内的代谢紊乱方面能起作用。

硒是人类和动物健康所需要的基本微量元素，主要以硒蛋白的形式积极参与到动物生理学过程中。据报道，在糖尿病患者中，补充硒剂能够降低血浆葡萄糖水平。事实证明，在糖尿病人体内，硒剂能持续改善葡萄糖的稳态代谢，从而调节糖代谢过程，如调节糖酵解和葡萄糖的生成。胰岛素和硒之间有协同作用，胰岛素和硒协同治疗能控制糖尿病大鼠的血糖。流行病学数据表明，硒状态与糖尿病风险之间存在正相关关系。大量的研究表明，有机硒与无机硒相比，其毒性较低，生物活性较高，可以迅速被吸收和利用，所以它成为近年来研究者所关注的焦点。目前研究表明，纳米红元素硒在改善肝脏保护、肿瘤抑制和小鼠免疫功能方面可以起到一定的作用。硒蛋白在某些退化性疾病中起着预防作用，包括癌症、炎症性疾病、神经***疾病、衰老、不育和感染等疾病等。尽管目前还没有完全了解治疗糖尿病的机制，但目前认为可能与抗氧化保护和免疫***的激活有关。本发明提供一种纳米硒长双歧杆菌及其制备方法和在制备延缓糖尿病进程的药物或食品中的应用。

发明内容

为解决现有技术中存在的糖尿病的改善效果不好，且易引起肾脏功能不好的缺点，本发明目的在于提供一种纳米硒长双歧杆菌及其制备方法，并将其应用于制备延缓糖尿病进程以及改善糖尿病生理指标和代谢状况(禁食血糖、体重、血清胰岛素水平、葡萄糖耐量测试、食物摄入量、摄水量和尿量等)、改善糖尿病胰岛素信号通路、改善糖尿病肝脏、胰腺和肾脏的病理变化、预防糖尿病肾脏并发症或肾功能损害、改善糖尿病血清肌酐和血尿素氮水平的药物或食品。

本发明公开的纳米硒长双歧杆菌在延缓糖尿病进程以及改善糖尿病生理指标和代谢状况、改善糖尿病胰岛素信号通路、改善糖尿病肝脏、胰腺和肾脏的病理变化、预防糖尿病肾脏并发症或肾功能损害、改善糖尿病血清肌酐和血尿素氮的药物或食品上的应用通过以下技术解决措施来进一步实现：

一种纳米硒长双歧杆菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)将红色纳米硒元素溶解在TPY培养基中，得到含纳米硒的TPY培养基；

(2)将长双歧杆菌菌液接种到上述纳米硒的TPY培养基中，得到纳米硒-双歧杆菌的TPY培养基；

(3)将上述纳米硒-双歧杆菌的TPY培养基于培养箱中过夜培养，得到纳米硒长双歧杆菌。

优选地，步骤(1)中所述含纳米硒的TPY培养基中纳米硒的浓度为1～10g/mL。

优选地，步骤(2)中长双歧杆菌菌液与TPY培养基的质量比为1:20～30。

优选地，步骤(3)中培养的条件为：37℃恒温培养，直至OD600值不低于0.2。

优选地，纳米硒富集在长双歧杆菌上，所述的纳米硒的尺寸为40～44nm。

本发明的有益效果：

(1)本发明比较了三种双歧杆菌对糖尿病的保护作用，即长双歧杆菌、富硒长双歧杆菌、富纳米硒长双歧杆菌(即纳米硒长双歧杆菌)，结果表明纳米硒长双歧杆菌对糖尿病小鼠的保护作用效果最好，经纳米硒长双歧杆菌给药的小鼠禁食血糖较低，体重增加，血清胰岛素水平较高；葡萄糖耐量测试(IPGTT)水平降低；在链脲佐菌素(STZ)致糖尿病模型的8周期间，纳米硒长双歧杆菌还降低了24小时的食物摄入、水摄入量和尿量等代谢状况，此结果说明纳米硒长双歧杆菌能够预防糖尿病性高血糖。

(2)正常的小鼠接受了最大剂量的纳米硒长双歧杆菌后，与正常小鼠相比，没有显著差异，显示出纳米硒长双歧杆菌良好的安全性。

(3)纳米硒长双歧杆菌可以保护由于STZ诱导的糖尿病导致的血糖以及肾脏功能，其保护作用是由于胰岛素信号通路的改变引起的，胰岛素信号通路控制了肝细胞的葡萄糖转运，胰岛素与靶细胞表面的胰岛素受体结合，依次激活胰岛素受体和胰岛素受体底物1(IRS1)，从而招募磷酸肌醇三激酶(PI3K)，在肝细胞葡萄糖摄取中，PI3K的一个重要靶蛋白是蛋白质激酶B(AKT/PKB)。本发明结果表明，与模型组(STZ诱导后的小鼠)相比，纳米硒长双歧杆菌上调了p-IRS1和p-AKT的表达，下调p-GSK-3β的表达，p-IRS1和p-AKT的上调能提高葡萄糖的摄取，减少血浆葡萄糖水平。因此，纳米硒长双歧杆菌通过增强胰岛素信号传导途径提高了胰岛素的敏感性，降低了血糖水平。

(4)本发明还测量了血清中肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)的水平，以测试其对肾功能的影响。糖尿病可引起严重的健康问题，包括大血管和微血管并发症，其中一种是肾脏组织的损伤，会导致肾功能不全，在STZ糖尿病诱导8周后，会出现一些肾损害的指标，如尿素氮的增加。本发明发现纳米硒长双歧杆菌在STZ诱导小鼠中的肾脏中起保护作用。纳米硒长双歧杆菌可以通过降低小鼠血清尿素氮和肌酸酐来降低肾功能不全的危害，减少肾脏病理病变。本发明中，采用长期灌胃纳米硒长双歧杆菌后用STZ诱导小鼠糖尿病模型，结果发现纳米硒长双歧杆菌在延缓STZ诱导的糖尿病和肾功能的发作中能够起到保护作用。

(5)本发明中纳米硒长双歧杆菌给药后，糖尿病模型中肝脏和胰腺病理损伤的进展速度减慢。

(6)本发明提供了一种制备经济的、可行的、效果良好的制备延缓糖尿病进程的药物或食品的方法。

1.附图说明

图1为长双歧杆菌、硒长双歧杆菌和纳米硒长双歧杆菌对血糖的影响的比较；

其中，1-正常组(未注射STZ)；2-模型组(注射STZ)；3-纳米硒长双歧杆菌；4-硒长双歧杆菌；5-长双歧杆菌；小鼠注射STZ后分别在-1w、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w测量禁食血糖水平(n＝8)；(^##P<0.01，^###P<0.001，与正常组相比；*p<0.05，**p<0.01，与模型组相比)；

结果分析：给予长双歧杆菌、硒长双歧杆菌和纳米硒长双歧杆菌三种菌液灌胃1个月，然后用STZ诱导小鼠糖尿病模型。结果显示纳米硒长双歧杆菌对引起糖尿病的保护作用效果最好。与模型组相比，纳米硒长双歧杆菌处理的空腹血糖水平最低。因此后续实验中选择纳米硒长双歧杆菌来研究对糖尿病的影响。

图2为小鼠注射STZ后分别在-1w、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w的空腹血糖(A)、体重(B)以及STZ注射后8周小鼠的血清胰岛素水平(C)状况；

其中，1-正常组(未注射STZ)；2-模型组(注射STZ)；3-低剂量组；4-中剂量组；5-高剂量组；6-毒性试验组(n＝8)；(^##P<0.01，^###P<0.001，与正常组相比；*p<0.05，**p<0.01，与模型组相比)；

结果分析：由于血糖水平是糖尿病亚临床诊断的黄金标准，所以评估了纳米硒长双歧杆菌对STZ诱导的糖尿病小鼠血糖的作用，本发明还评估了实验小鼠的体重，结果发现纳米硒长双歧杆菌组与模型组小鼠相比，长时间灌胃纳米硒长双歧杆菌的小鼠表现出明显降低的空腹血糖水平(图2A)和较高的体重(图2B)；因为体内葡萄糖平衡主要由胰岛素调节，本发明也检测了胰岛素在血清中的浓度，与模型组小鼠相比，给药组(3、4、5、6)的空腹胰岛素水平更高(图2C)。

图3为纳米硒长双歧杆菌对体内葡萄糖平衡的影响比较；

其中，1-正常组(未注射STZ)；2-模型组(注射STZ)；3-低剂量组；4-中剂量组；5-高剂量组；6-毒性试验组。按1.0g/kg的剂量向小鼠腹腔注射葡萄糖，隔特定的时间间隔检测葡萄糖水平(每组3只小鼠)；(^###P<0.001，与正常组相比；*p<0.05，**p<0.01，与模型组相比)；

结果分析：本发明探讨了纳米硒长双歧杆菌对体内葡萄糖平衡的影响。在IPGTT试验中，模型组小鼠的葡萄糖水平呈显著下降趋势(图3)，这表明在纳米硒长双歧杆菌给药之后，葡萄糖的清除量有所提高。

图4为纳米硒长双歧杆菌对小鼠代谢状况的影响比较；

其中，1-正常组(未注射STZ)；2-模型组(注射STZ)；3-高剂量组；4-中剂量组；5-低剂量组；6-毒性试验组；图4A：小鼠的食物摄入量；图4B：摄水量；图4C：尿量；(^##P<0.01，^###P<0.001，与正常组相比；*p<0.05，**p<0.01，与模型组相比)；

结果分析：与未注射STZ的正常组相比，注射STZ的模型组小鼠的24小时的食物摄入量、水摄入量和尿量均增加明显。而且，从剂量上看，24小时的食物摄入量、水摄入量和尿量与纳米硒长双歧杆菌剂量的增加呈负相关的关系。

图5为纳米硒长双歧杆菌对肝和胰腺组织形态的作用(H&E染色；20×10)；

其中，1-正常组(未注射STZ)；2-毒性试验组；3-模型组(注射STZ)；4-低剂量组；5-中剂量组；6-高剂量组；图5A：小鼠的肝脏组织病理学切片图；图5B：小鼠胰腺病理学切片图；

结果分析：肝脏和胰脏的组织学分析结果表明，纳米硒长双歧杆菌与模型组之间有显著的差异，经纳米硒长双歧杆菌给药后，通过HE进行病理分析，如图5A，在正常组和毒性测试组中没有明显的病理损害；在模型组中，肝细胞水肿，胞浆松散，而随着纳米硒长双歧杆菌剂量的增加，病变程度逐渐减弱，在模型组的组织中可见少量的炎症细胞，随着纳米硒长双歧杆菌剂量的增加，浸润性炎症细胞的程度被削弱。如图5B，正常组小鼠和毒性试验组小鼠没有明显的病理改变；高剂量组中只观察到胰腺含有少量的脂肪液泡；低中剂量组发现除了脂肪液泡之外，部分腺泡排列疏松。随着纳米硒长双歧杆菌的剂量增加，胰腺的病变程度逐渐减弱。总的来说，在纳米硒长双歧杆菌给药后，肝脏和胰腺病理损伤的进展速度减慢。

图6为纳米硒长双歧杆菌对胰岛素信号通路的影响比较；

其中，Western blotting分析肝组织中：图6A：p-IRS1；图6B：pGSK-3β；图6C：pAKT蛋白水平，分别与总IRS1、GSK-3和AKT的比值；1-正常组(未注射STZ)；2-毒性试验组；3-低剂量组；4-中剂量组；5-高剂量组；6-模型组(注射STZ)(^#P<0.05，与正常组相比；*p<0.05，与模型组相比，p<0.05)；

结果分析：胰岛素信号通路在葡萄糖的体内平衡中起着至关重要的作用，因此，为了研究纳米硒长双歧杆菌预防糖尿病血糖的分子机制，本发明研究了肝脏胰岛素的信号通路，研究结果如图6A、6B和6C所示，与模型组相比，p-IRS1和pAKT的表达在肝脏中显著增加，而pGSK-3β的表达却显著减少，胰岛素信号通路相关蛋白的表达水平增强，这表明了纳米硒长双歧杆菌能有效改善肝胰岛素的信号的敏感性。

图7为纳米硒长双歧杆菌对肾脏功能的保护作用；

其中，1-正常组(未注射STZ)；2-模型组(注射STZ)；3-低剂量组；4-中剂量组；5-高剂量组；6-毒性试验组；图7A：肾脏的H&E染色结果；图7B：血清的尿素氮水平；图7C：血清肌酐水平(^##P<0.01，与正常组相比；*p<0.05，与模型组相比)；

结果分析：肾脏的功能主要受肾管和肾小球的影响，肾组织检查表明，组织中可见部分肾小管坏死，上皮细胞胞浆淡染，核固缩其次是组织中可见肾小球囊腔消失，球体与囊壁黏连，系膜细胞增生；系膜细胞增生和肾小球萎缩随着纳米硒长双歧杆菌剂量的增加而逐渐减弱(图7A)；纳米硒长双歧杆菌的处理与模型组小鼠相比，其血清尿素氮(图7B)和尿肌酐(图7C)水平降低。以上结果表明纳米硒长双歧杆菌可以改善因糖尿病而受损的肾脏功能。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明作进一步的详细表述：

实施例1

(1)菌液的制备

长双歧杆菌是在37℃下的TPY培养基进行厌氧培养的：将红色纳米硒元素溶解在200mL的TPY培养基中，其最终浓度为5g/mL(尝试了纳米硒的浓度分别为1、2.5、5、7.5、10g/mL，其效果相近)；然后，将长双歧杆菌菌液从4℃的冰箱中取出，按质量份计，长双歧杆菌菌液量:培养基＝1:25接种到新的TPY培养基中(尝试了长双歧杆菌菌液量与TPY培养基的质量比分别为1:20、1:22.5、1:25、1:27.5、1:30，其效果相近)，放入37℃恒温培养箱过夜培养，直到OD600值达到0.2，以备次日灌胃使用；最后，收集培养的菌株，然后用5％的葡萄糖生理盐水清洗3次，清洗的离心条件为3500rpm，4℃下，5min；所收集的菌液重悬在0.1mL的牛奶中，给予小鼠灌胃。对照组给予100μL的13％脱脂牛奶/只。

(2)糖尿病模型小鼠的建立

4-5周龄的雄性小鼠(C57BL/6J)购自南京大学的南京模型动物研究所，将小鼠每天灌胃菌液，连续灌胃25天后，小鼠禁食12小时，自由饮水，连续5天注射溶于0.1M的冷柠檬酸缓冲(pH＝4.5)的STZ溶液(50mg/kg)中，对照组小鼠注射柠檬酸盐。3天后使用血糖仪测量小鼠空腹血糖水平，每周监测小鼠的血糖水平和体重，结果如图1所示。

(3)比较三种长双歧杆菌的效果

为说明纳米硒长双歧杆菌对糖尿病小鼠模型的保护作用，本发明将长双歧杆菌、硒长双歧杆菌对糖尿病小鼠模型的保护作用作为两个对比例，与之进行对比，并进行比较说明。每只小鼠每天给予菌液0.1mL，灌胃时间为4w。50只小鼠被随机分为5组，其中，对照组：正常组；模型组：STZ诱导的糖尿病小鼠；野生型长双歧杆菌、硒长双歧杆菌、纳米硒长双歧杆菌：STZ诱导的糖尿病小鼠造模前分别给予3.0×10¹⁰个/kg的菌液灌胃。

(4)纳米硒长双歧杆菌的剂量依赖性效应

每只小鼠每天给予纳米硒-长双歧杆菌0.1mL，灌胃时间为4w，60只小鼠被随机分为6组，分组分别为正常组，模型组，双歧杆菌低剂量组(0.75×10¹⁰个/kg)，中剂量组(1.5×10¹⁰个/kg)，高剂量组(3.0×10¹⁰个/kg)，毒性测试组(3.0×10¹⁰个/kg灌胃正常小鼠)；STZ注射后的第3天到8周内，监测小鼠的血糖水平和体重(如图2)。将小鼠放入小鼠代谢笼中，收集小鼠24h食物的摄入量、水量和尿量(如图4)。在实验结束时，测量血清Scr和BUN的水平。其中，血清胰岛素水平采用小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定。当STZ注射第8周时，在葡萄糖耐受实验中，小鼠饥饿过夜后，腹腔注射葡萄糖(1.0g/kg)，于注射后0、15、30、60、90min从尾静脉分别取血，并用血糖仪检测血糖含量(如图3)。

将小鼠肝脏迅速放入液氮以备后用。肝组织在细胞裂解液中匀浆，冰上裂解30min后，离心10min，离心条件为12000rpm，4℃，收集上清液，并用考马斯亮蓝法(Bradford方法)检测蛋白浓度，调整蛋白浓度，加入5×loading buffer并在沸水浴中煮样5min，样品置于-20℃下保存备用。用anti-IRS1、anti-pIRS1、anti-GSK-3、anti-pGSK-3、anti-AKT和anti-pAKT抗体进行标记。利用Image J软件进行量化。

(5)组织学分析方法

采用HE染色法观察肝脏、胰腺和肾脏的形态学变化，将肝脏、胰腺和肾脏组织置于浓度为4％的多聚甲醛中固定过夜；常规石蜡包埋，5μm切片；切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。在二甲苯I、二甲苯II中各浸泡5min至透明，脱水条件为：无水乙醇I，无水乙醇II，95％酒精，80％酒精，75％酒精，各5min。苏木素复染2min后流水冲洗返蓝，自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。置伊红液2min，自来水冲洗。脱水条件为：75％酒精、80％酒精、95％酒精、无水乙醇I、无水乙醇II各5min。二甲苯I、二甲苯II中各浸泡5min至透明，晾干3min。封片方法：滴加中性树脂封片于组织片上，然后取干净的盖玻片，仔细加在封固剂上，慢慢压平，使盖片位置适中。显微镜下观察、拍照并长期保存(如图5和图7)。

本发明也尝试将文献已经报导的双歧杆菌的常规药物或食品制备方法和药物或食品制剂方法应用于纳米硒长双歧杆菌，也都产生了较好地延缓糖尿病进程以及改善糖尿病生理指标和代谢状况、改善糖尿病胰岛素信号通路、改善糖尿病肝脏、胰腺和肾脏的病理变化、预防糖尿病肾脏并发症或肾功能损害、改善糖尿病血清肌酐和血尿素氮的效果；本发明还尝试像常规的糖尿病治疗或预防药物或食品一样，将纳米硒长双歧杆菌通过与常规糖尿病治疗或预防药物或食品和治疗方法联合应用，能够进一步提高糖尿病治疗或预防效果。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米硒长双歧杆菌的制备方法，其特征在于，

(1)将红色纳米硒元素溶解在TPY培养基中，得到含纳米硒的TPY培养基；

(2)将长双歧杆菌菌液接种到上述纳米硒的TPY培养基中，得到纳米硒-双歧杆菌的TPY培养基；

(3)将上述纳米硒-双歧杆菌的TPY培养基于培养箱中过夜培养，得到纳米硒长双歧杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种纳米硒长双歧杆菌的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述含纳米硒的TPY培养基中纳米硒的浓度为1～10g/mL；步骤(2)中长双歧杆菌菌液与TPY培养基的质量比为1:20～30；步骤(3)中培养的条件为：37℃恒温培养，直至OD600值不低于0.2。

3.根据权利要求1所述的方法制备的纳米硒长双歧杆菌，其特征在于，纳米硒富集在长双歧杆菌上，所述的纳米硒的尺寸为40～44nm。

4.根据权利要求3所述的一种纳米硒长双歧杆菌在制备延缓糖尿病进程药物或食品中的应用。

5.根据权利要求3所述的一种纳米硒长双歧杆菌在制备改善糖尿病生理指标和代谢状况的药物或食品中的应用，所述的糖尿病生理指标和代谢状况为禁食血糖、体重、血清胰岛素水平、葡萄糖耐量测试、食物摄入量、摄水量和尿量中的一种或多种。

6.根据权利要求3所述的一种纳米硒长双歧杆菌在制备改善糖尿病胰岛素信号通路的药物或食品中的应用。

7.根据权利要求3所述的一种纳米硒长双歧杆菌在制备改善糖尿病肝脏、胰腺和肾脏的病理变化的药品或食品中的应用。

8.根据权利要求3所述的一种纳米硒长双歧杆菌在制备改善糖尿病血清肌酐和血尿素氮水平的药物或食品中的应用。

9.根据权利要求3所述的一种纳米硒长双歧杆菌在制备预防糖尿病肾脏并发症或肾功能损害的药物或食品中的应用。

10.根据权利要求3所述的一种纳米硒长双歧杆菌在制备与常规糖尿病治疗或预防药物或食品联合运用的延缓糖尿病进程药物或食品中的应用。