CN109575130A

CN109575130A - 一种检测hpv18 e7蛋白的单克隆抗体及其制备和应用

Info

Publication number: CN109575130A
Application number: CN201811465944.0A
Authority: CN
Inventors: 常小迦; 施丽君; 郑雅婷; 时成龙
Original assignee: Etoki Bio Pharmaceutical (suzhou) Co Ltd
Current assignee: Etoki Bio Pharmaceutical (suzhou) Co Ltd
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-12-03
Also published as: CN109575130B

Abstract

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种检测HPV18 E7蛋白的单克隆抗体及其制备和应用。本发明最终得到特异性高、亲和力强、能够稳定表达且重复性良好的单克隆抗体，能特异性的识别HPV18 E7蛋白，具有用于制备防治***、***癌、***部癌、***癌、***癌及口咽部癌等癌症的药物的潜力。

Description

一种检测HPV18 E7蛋白的单克隆抗体及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及到一种检测HPV18 E7蛋白的单克隆抗体及其制备和应用。

背景技术

HPV是一种小DNA病毒，具有很强的嗜鳞状上皮的特性，主要侵犯鳞状上皮的基底层细胞和位于宫颈转化区的化生细胞。目前已知的HPV有一百多个型别，根据致癌性，分为高危型HPV和低危型HPV两类。高危HPV感染(如16和18型)导致大多数宫颈、***、***部、***、***及口咽部癌和癌前病变；而非致癌性、低危型的HPV感染(如6和11型)会导致生殖器疣和复发性呼吸道***瘤样增生。

***是目前病因唯一明确的肿瘤，它是人***瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)持续感染的结果。癌症发生过程中HPV DNA整合入人体细胞基因组内，转化型细胞内开始持续表达HPV E6和E7蛋白。HPV E6蛋白通过E6-AP(E6 associated protein)的介导，结合并降解抑癌蛋白p53；HPV E7蛋白与抑癌蛋白pRb结合，使pRb释放核转录因子E2F，致使细胞过度增殖，细胞周期调控失控，导致细胞的永生化并促进***的发生。

高危HPV E7蛋白作为癌蛋白在***(前)病变发生中的作用已经明确，然而由于HPV E7癌蛋白较低的免疫原性阻断了其在***检测中的作用。关于HPV E7蛋白溶液结构的研究表明E7蛋白高度保守的N端是非结构化的，这可能是其免疫原性低的一个原因。并且高危HPV E7蛋白在细胞内的定位会随着细胞融合的不同状态而改变，即HPV E7蛋白在细胞内的分布处于一种动态，且HPV E7蛋白可处于胞质和胞核中。因此，特异性识别高危HPV E7蛋白的单克隆抗体较难获得。本发明通过采用纯化的GST-HPV18 E7重组蛋白免疫小鼠，同时通过ELISA检测、免疫组化等实验，最终得到一种特异性高、亲和力强、能够稳定表达且重复性良好的单克隆抗体，该抗体能够特异性地检测宫颈上皮癌(前)变细胞中位于细胞核内的HPV18 E7蛋白。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种能特异性识别HPV18 E7蛋白的单克隆抗体，而与其他蛋白无交叉反应，显著提高了HPV18 E7蛋白检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映细胞核内HPV18 E7蛋白的表达水平，可应用于制备防治***、***癌、***部癌、***癌、***癌及口咽部癌等癌症的药物的潜力。

本发明的第一方面，提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO：1-3所示的HCDR；所述单克隆抗体的轻链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO：4-6所示的LCDR；

进一步的，所述单克隆抗体为人源、鼠源、兔源或嵌合抗体；

进一步的，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

更进一步的，所述单克隆抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述单克隆抗体为特异性抗HPV18的抗体；更优选地，所述单克隆抗体为特异性抗HPV18 E7蛋白的抗体，且该蛋白定位在细胞核中。

本发明第二方面，提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白包含本发明第一方面中任一所述的单克隆抗体，以及任选的协助表达和/或纯化的标签序列；

进一步的，所述的标签序列包括6x His标签；

更进一步的，所述重组蛋白为特异性抗HPV的重组蛋白；优选地，所述重组蛋白为特异性抗HPV18的重组蛋白；更优选地，所述重组蛋白为特异性抗HPV18 E7蛋白的重组蛋白，且该HPV18 E7蛋白定位在细胞核中。

本发明第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子能够编码本发明第一方面任一所述的单克隆抗体的重链和/或轻链的可变区或本发明第二方面所述的重组蛋白；

进一步的，编码所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列的核酸分子具有SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列；和/或编码所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列的核酸分子具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

本发明第四方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明中第三方面任一所述的核酸分子；

进一步的，所述载体选自原核或真核表达载体；

更进一步的，所述载体优选选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

本发明第五方面，提供了一种蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽是由本发明第四方面所述的载体通过表达***进行表达得到；

进一步的，所述表达***为细菌、酵母菌、丝状真菌、真核哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或无细胞表达***。

本发明第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞能够表达上述的单克隆抗体、重组蛋白、载体或蛋白质或多肽。

本发明第七方面，提供了一种偶联物，所述偶联物含有本发明第一方面任一所述的单克隆抗体，以及其他生物活性物质；

进一步的，所述的单克隆抗体直接或通过连接片段与其他生物活性物质偶联；

进一步的，所述偶联部分包含：可检测标记物、药物、毒素、细胞分子、放射性核素或酶；

更进一步的，所述偶联部分包含：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明第八方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有上述的单克隆抗体、重组蛋白、核酸分子、载体、蛋白质或多肽、宿主细胞或偶联物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其他生物活性物质；

进一步的，所述的药物组合物为注射剂型；

进一步的，所述药物组合物在制备预防或者***的药物中的用途；

更进一步的，所述肿瘤为***、***癌、***部癌、***癌、***癌或口咽部癌。

本发明第九方面，提供了一种根据本发明第一方面任一所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的重组蛋白、本发明第五方面所述的蛋白质或多肽或本发明第七方面所述的偶联物在制备预防或者***的药物中的用途；

进一步的，所述肿瘤为***、***癌、***部癌、***癌、***癌或口咽部癌。

本发明第十方面，提供了一种检测装置，所述检测装置优选选自药剂、试剂、检测板或试剂盒，所述药剂、试剂、检测板或试剂盒包含本发明第一方面任一所述的单克隆抗体、本发明第四方面所述的重组蛋白、本发明第五方面所述的蛋白质或多肽或本发明第七方面所述的偶联物；

进一步的，所述药剂在制备预防或者治疗表达HPV18 E7蛋白的肿瘤的药物中的用途；具体地，所述肿瘤为***、***癌、***部癌、***癌、***癌或口咽部癌；更具体地，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒；

进一步的，所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中的HPV18 E7蛋白；和/或检测肿瘤细胞中内源性的HPV18 E7蛋白；和/或检测表达HPV18 E7蛋白的肿瘤细胞；和/或鉴别HPV的类型；

进一步的，所述检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述测试条含有本发明第一方面任一所述的单克隆抗体或本发明第七方面所述的偶联物；具体地，所述测试条还包括抗原点区；更具体地，所述测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接而成；

进一步的，所述试剂盒包含第一容器，所述第一容器中含有本发明第一方面任一所述的单克隆抗体；和/或第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第一方面任一所述的单克隆抗体的二抗；和/或第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；或本发明所述的检测板；

进一步地，所述第一容器中的抗体带有可检测标记；

进一步地，所述第二容器中的抗体带有可检测标记。

本发明第十一方面，提供了一种检测样品中HPV E7蛋白的方法，所述方法包括：

(1)将样品与本发明第一方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPV E7蛋白；优选地，采用ELISA法进行检测；

进一步的，所述HPV E7蛋白包含HPV18 E7蛋白；

进一步的，在(1)中，将样品与两种针对HPV E7蛋白的抗体接触，并且在(2)中通过ELISA法进行检测，所述两种针对HPV E7蛋白的抗体中的至少一种为本发明第一方面任一所述的抗体；

进一步的，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物；其中，所述第一抗体是本发明第一方面任一所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述第一抗体的结合表位不同；

进一步的，在(1)中，将样品与本发明第一方面所述的抗体接触后，在反应体系中再加入抗所述第一抗体的第三抗体，并且在(2)中检测“抗原-第一抗体-第三抗体”复合物的形成；

进一步的，所述第一抗体、第二抗体或所述第三抗体上带有可检测标记；

进一步的，所述可检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物酶标记、放射性核素标记、荧光素标记；

进一步的，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、脱落细胞样品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种特异性高、亲和力强、能够稳定表达、重复性良好的单克隆抗体，能特异性的识别HPV E7蛋白尤其是HPV18 E7蛋白，具有用于制备防治***、***癌、***部癌、***癌、***癌及口咽部癌等癌症的药物的潜力。

附图说明

图1是实施例1中8株抗HPV18 E7蛋白单克隆抗体纯化后SDS-PAGE的检测结果。

图2为实施例1中8株抗HPV18 E7蛋白单克隆抗体ELISA检测效价结果。

图3为实施例2中8株抗HPV18 E7蛋白单克隆抗体对***组织切片进行免疫组织化学染色检测的结果。

图4为实施例4中单克隆抗体AT-18-34对14种HPV亚型的E7蛋白进行ELISA检测的结果。

图5为实施例5中40例不同的宫颈组织芯片上各位点的分布情况。

图6为实施例5中单克隆抗体AT-18-34对宫颈组织芯片进行免疫染色结果。

图7为实施例5中单克隆抗体AT-18-34对宫颈病变组织进行免疫组化染色的结果。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本领域的技术人员可以明白，根据本申请公开的内容结合本领域技术常识，本申请公开的核苷酸序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法合成，例如通过化学合成的方法得到本申请公开的序列。而且，本领域技术人员可以将本申请获得的新的核苷酸序列构建到任何合适的载体、宿主细胞中。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。

本发明提供了一种抗HPV E7蛋白尤其是抗HPV18 E7蛋白的单克隆抗体，及其制备方法和应用。该单克隆抗体不仅能够结合重组HPV18 E7蛋白，且能够用于***固定，石蜡包埋的临床组织样本切片的检测，且定位于细胞核中。本发明提供了检测和/或检测固定HPV18 E7蛋白的方法，以及包含上述单克隆抗体的试剂盒以及检测板。

本发明提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体的重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：1-3所示的HCDR；该单克隆抗体的轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：4-6所示的LCDR。

进一步的，本发明提供了一种特异性结合HPV18 E7蛋白的单克隆抗体AT-18-034，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区由上述氨基酸序列组成。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：采用纯化的GST-HPV18 E7重组蛋白(GST-HPV18 E7重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，并使用His-HPV18 E7重组蛋白(His-HPV18 E7重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示)作为筛选抗原，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，最终筛选获得9株单克隆株。这些单克隆抗体进一步通过ELISA法检测、免疫组化试验，最终获得一株能够特异性识别细胞核内HPV18 E7蛋白的单克隆抗体AT-18-034，该抗体亚型为Ig2a，Kappa。

本发明还提供一种单克隆抗体AT-18-034在制备用于检测HPV18 E7蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或者试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体AT-18-034，可检测组织细胞中HPV18 E7蛋白的表达情况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于检测肿瘤的试剂盒中的应用，其中所述肿瘤具体是指与HPV E7蛋白表达密切相关的肿瘤，包括但不限于***、***癌、***部癌、***癌、***癌及口咽部癌和癌前病变等相关肿瘤。

与现有技术相比，本发明提供了一种单克隆抗体AT-18-034的制备方法及序列，本发明还提供了该单克隆抗体在制备用于检测HPV E7蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体AT-18-034的免疫组化试剂盒，以及这些单克隆抗体在制备用于检测肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与细胞核内的HPV18 E7蛋白结合，而与细胞内其他蛋白无交叉，显著提高了HPV18 E7蛋白检测的特异性，可应用于宫颈、***、***部、***、***及口咽部癌和癌前病变等相关肿瘤组织细胞中HPV18 E7蛋白的表达水平的检测。

本发明提供了一种用于检测HPV18 E7蛋白的单克隆抗体及其用途，含有该单克隆抗体的诊断工具中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：抗HPV18 E7蛋白单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

取六只4-6周雌性BALB/C小鼠，免疫原为GST-HPV18 E7蛋白，以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方式免疫，免疫剂量为50μg/只。免疫三次后取尾血采用His-HPV18E7重组蛋白(5μg/ml)作为检测抗原包被ELISA法梯度稀释测定血清效价，根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

(2)细胞融合与培养

按常规方法收集免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合比率脾细胞：SP2/0＝5:1，融合细胞分装于96孔培养板，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中选择性培养。融合后用HAT培养基全换液3次；待杂交瘤细胞长满一个显微镜视野时，进行ELISA检测。

(3)单克隆抗体的筛选和培养

检测时，采用His-HPV18 E7包被的酶标板进行间接ELISA检测。ELISA筛选结果以OD值大于1的为阳性孔，并进行复检。经过两次连续检测为阳性后，将该阳性孔细胞进行扩增，及时冻存和有限稀释法进行亚克隆。取一块96孔细胞培养板，每孔中加入150μl HAT培养液；对需亚克隆的阳性孔轻轻吹打悬浮，吸取100μl细胞悬液加到96孔细胞板中，从第一孔开始倍比稀释。细胞计数选取孔中约有100个细胞的孔并加入到含有6ml HAT培养液的加样槽中，按100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加前三列；再补加HAT培养基3ml，100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加中三列；再补加HAT培养基5ml，100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加后六列。计算每块板的阳性率达到100％时，可以得到稳定细胞株。阳性细胞株采用His-HPV18 E7蛋白进行复筛，共获得8株结合免疫原蛋白的稳定单克隆抗体株AT-18-04，AT-18-05，AT-18-25，AT-18-26，AT-18-27，AT-18-28，AT-18-29，AT-18-34。转移到细胞培养板中，扩大培养并冻存。

(4)单克隆抗体的腹水制备

大量培养杂交瘤细胞，8-10周龄的BALB/C雌性小鼠预先用液体石蜡致敏，然后腹腔注射单克隆细胞悬液，细胞用量为1x10⁶/只，一周后观察，待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水。腹水液经去除纤维蛋白处理后，以Protein A/G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，用磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用紫外分光光度计OD260，280测定抗体蛋白浓度，SDS-PAGE检测纯度，间接ELISA检测抗体效价。抗体分装、冻存在-20℃。其中SDS-PAGE检测结果见图1，结果显示，8株单克隆抗体经亲和层析能够得到简单有效的纯化。ELISA检测结果见图2，从图2中可以看出以His-HPV18 E7重组蛋白为抗原时，AT-18-04效价最高，AT-18-25效价最低；其中AT-18-04在浓度为62.5ng/ml时即达到峰值，其余抗体除AT-18-25外均在250ng/ml时，达到检测峰值。

实施例2：特异性抗细胞核内HPV18 E7蛋白单克隆抗体的筛选

分别以单抗AT-18-04，AT-18-05，AT-18-25，AT-18-26，AT-18-27，AT-18-28，AT-18-29，AT-18-34对***组织进行免疫组织化学染色。方法如下：将病理石蜡切片先浸泡在二甲苯中两次，每次15分钟；然后依次浸泡在100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇中，各5分钟，最后去离子水洗两次；将组织切片放入煮沸的0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)中，高温高压5分钟；室温冷却30min，TBST洗三次，每次5min；为了使内源过氧化物酶失活加入3％H₂O₂室温处理10min；TBST洗涤3次，每次5min；加入含10％小牛血清的TBST室温封闭20min；弃去封闭液，分别加入上述8株抗体，浓度为20ug/ml，室温孵育1h；经充分洗涤后滴加Anti-Mouse/Rabbit IgG-HRP(Dako K5007)，室温孵育30min；经充分洗涤后DAB(Dako)显色2-5min(显微镜下观察)，流水冲洗5min；苏木素复染1min，自来水冲洗干净并返蓝；分步脱水，依次75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇各浸泡5min；最后二甲苯浸泡两次，每次5min；再中性树胶封片；最后显微镜观察拍照。

采用这8株单克隆抗体对***切片进行免疫组化染色结果如图3所示：在同一例***组织上，这8株抗体的性能表现差异较大，其中有3株单克隆抗体未能使***组织染色，分别为AT-18-25，AT-18-27和AT-18-29；1株单抗AT-18-26虽然能使切片染色，但染色部位为非病变组织；3株单克隆抗体使宫颈组织细胞质染色，且染色由强到弱分别为AT-18-28>AT-18-05>AT-18-04；仅一株AT-18-34表现为细胞核染色。即AT-18-25，AT-18-27，AT-18-29和AT-18-26虽然在ELISA检测中能与重组His-HPV18 E7蛋白结合，但是不能与组织细胞内部的HPV18 E7蛋白结合；AT-18-28，AT-18-05和AT-18-04这三株单抗能够同时与重组His-HPV18 E7和细胞质中的HPV18 E7蛋白结合；仅AT-18-34这一株单抗同时与重组His-HPV18 E7和细胞中的HPV18 E7蛋白结合，且染色定位于细胞核中。实验结果说明单克隆抗体AT-18-34能特异性的识别细胞核中的HPV18 E7蛋白。

实施例3：单克隆抗体AT-18-34基因克隆及测序

参照Invitrogen“TRIZOL Reagent”操作手册提取生产单克隆抗体AT-18-34的杂交瘤细胞的总RNA。参照Fermantas“RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit”说明书进行反转录，并设计合成5’和3’端引物，用所得到的cDNA为模板扩增单克隆抗体基因，反应条件：94℃，1min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min(30个cycle)；72℃，5min。回收PCR产物条带后连接至pMD-19T载体上，并转化TOP10感受态细胞，涂布到带有IPTG，X-gal的LB平板进行蓝白斑筛选培养(37℃，过夜)。挑取白色单菌落接种到2ml LB培养基(Amp+)，37℃培养过夜后抽提菌液DNA送去测序，测序结果如下：单克隆抗体AT-18-34重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO：9所示，其编码的单克隆抗体AT-18-34重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示；单克隆抗体AT-18-34轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO：10所示，其编码的单克隆抗体AT-18-34轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。进一步分析得到单克隆抗体AT-18-34重链可变区的HCDR区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示；单克隆抗体AT-18-34轻链可变区的LCDR区氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示。

实施例4：ELISA法检测单克隆抗体AT-18-34识别亚型HPV的特异性

抗原分别选用高危His-HPV16 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示)，His-HPV18 E7重组蛋白,His-HPV31 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示)，His-HPV33 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示)，His-HPV35 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示)，His-HPV39 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示)，His-HPV45 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示)，His-HPV52 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示)，His-HPV56 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示)，His-HPV58 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示)，His-HPV59 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示)，His-HPV68重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示)，以及低危His-HPV6 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示)，His-HPV11 E7重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示)，1μg/ml包板，4℃过夜；PBST洗涤拍干后；加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h；PBST洗涤拍干后；加入1μg/ml AT-18-34单克隆抗体，37℃反应1h；PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗(Sigma A2554)(1：10000)37℃反应1h；PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H₂SO4终止；OD450nm处读数。结果见图4，其中除HPV6和HPV11为低危亚型外，其余12种均为高危亚型。AT-18-34单克隆抗体仅与高危His-HPV18 E7重组蛋白结合，与His-HPV39 E7重组蛋白有轻微结合，而与其他亚型的HPV E7蛋白无结合。实验结果表明单克隆抗体AT-18-34能与HPV18 E7蛋白特异性结合而与其他蛋白无交叉反应。

进一步将实施例1，(4)小节中纯化的单克隆抗体AT-18-34采用PBS 1:10 000稀释，按照Sigma公司的亚型鉴定试剂盒说明书操作，实验结果表明：AT-18-34单克隆抗体为IgG2a，kappa。

实施例5：单克隆抗体AT-18-34在宫颈组织中进行免疫组化的应用

(1)在宫颈芯片组织中进行免疫组化的应用

宫颈组织芯片拥有40例不同的***组织，芯片上各点的分布如图5所示，各点的具体信息见表1。将芯片按照实施例2中相同的步骤进行免疫组化检测，一抗采用单克隆抗体AT-18-34，浓度为20μg/ml。该组织芯片共有43个样本，其中A6和A7，A8和B1，以及E8和F1为同一病例组织的不同部位，因此共有40例不同的病例样本。结果如图6所示，在检测样本中，在C6，C7，C8和D1这四个点上未有棕色染色，其余芯片上均有棕色核染色。即仅20，21，22，23这四个样本中未检测到阳性，其余均为阳性。实验结果表明，单克隆抗体AT-18-34在宫颈芯片组织中的阳性检出率在90％(36/40)。

表1宫颈组织芯片信息

位点

组织信息

位点

组织信息

位点

组织信息

位点

组织信息

位点

组织信息

位点

组织信息

A1

宫颈鳞癌

B1

***

C1

***

D1

***

E1

***

F1

腺癌

A2

宫颈鳞癌

B2

***

C2

***

D2

***

E2

***

F2

***

A3

***

B3

***

C3

***

D3

***

E3

宫颈鳞癌

F3

***

A4

宫颈鳞癌

B4

***

C4

宫颈鳞癌

D4

宫颈鳞癌

E4

***

A5

***

B5

***

C5

***

D5

宫颈鳞癌

E5

宫颈鳞癌

A6

***

B6

***

C6

***

D6

宫颈鳞癌

E6

宫颈鳞癌

A7

***

B7

***

C7

***

D7

宫颈鳞癌

E7

***

A8

***

B8

***

C8

***

D8

腺癌

E8

***

(2)在宫颈病变组织中进行免疫组化的应用

进一步探索单克隆抗体AT-18-34在宫颈病变组织中的应用。宫颈上皮内瘤变(CIN)是子***的癌前病变，包括子宫颈低度(CIN 1级)、中度(CIN 2级)、高度不典型增生及原位癌(CIN 3级)。选取***症组织石蜡切片(阴性对照)和宫颈病变组织(阳性对照)，采用单克隆抗体AT-18-34进行免疫组化染色检测，具体操作参照实施例2。结果如图7所示：图7A为***症样本，在样本上未检测到棕色核染色；图7B为CIN1-2级样本的染色结果，在基地层开始出现异型细胞，采用单克隆抗体AT-18-34进行检测时，从基底层开始出现棕色核染色，棕色核染色部位占整个上皮层的1/3左右；图7C为CIN2-3级样本的染色结果，随着病变细胞的增多，棕色核染细胞增多至1/2左右；图7D为CIN3级样本的染色结果，棕色核染细胞覆盖了2/3以上的上皮层；图7E为发生浸润的***样本在此作为阳性对照，能够看到浸润部分均呈棕色核染色。因此，随着宫颈病变程度加重，HPV E7蛋白表达增加，单克隆抗体AT-18-34在各个级别组中的染色增多，且染色定位于细胞核中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 艾托金生物医药（苏州）有限公司

<120> 一种检测HPV18 E7蛋白的单克隆抗体及其制备和应用

<130> 20181119

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Ile Gly Ser Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Ala Arg Gly Ala Ile Pro Asp Leu

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn Trp

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Gly Ala Ser

1

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Ala Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Tyr Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 100

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ala

85 90 95

Ile Pro Asp Leu

100

<210> 8

<211> 99

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Pro Met Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn

20 25 30

Trp Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Gly Asn

85 90 95

Ile Tyr Gly

<210> 9

<211> 300

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

cagtcgttgg aggagtccgg gggtcgcctg gtaacgcctg gaggatccct gacactcacc 60

tgcacagtct ctggaatcga cctcagtagg tatgcaatga gctgggtccg ccaggctcca 120

gggaaggggc tggaatggat cggaatcatt ggtagtagtg gtagcacata ctacgcgagc 180

tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatgacc 240

agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaggggctat tcctgacttg 300

<210> 10

<211> 297

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

cctatgctga cccagactgc atcgtccgtg tctgcggctg tgggaggcac agtcaccatc 60

agttgccagt ccagtcagag tgtttatgat aacaactggt taggctggtt tcagcagaaa 120

ccagggcagc gtcccaagcg cctgatctat ggtgcatcca atctggcatc tggggtccca 180

tcgcggttca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgacctggag 240

tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggcggttata gtggtaatat ttatggt 297

<210> 11

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 11

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

210 215 220

Gly Ser His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu

225 230 235 240

Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu

245 250 255

Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln

260 265 270

His Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys

275 280 285

Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser

290 295 300

Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser

305 310 315 320

Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln

325 330

<210> 12

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 12

His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro

1 5 10 15

Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp

20 25 30

Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu

35 40 45

Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys

50 55 60

Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp

65 70 75 80

Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val

85 90 95

Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His

100 105 110

His His His His His

115

<210> 13

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 13

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

<210> 14

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 14

Met Arg Gly Glu Thr Pro Thr Leu Gln Asp Tyr Val Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Ala Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Pro Asp Ser Ser

20 25 30

Asp Glu Glu Asp Val Ile Asp Ser Pro Ala Gly Gln Ala Lys Pro Asp

35 40 45

Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Cys Glu Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr Gln Val Asp Ile Arg Ile Leu Gln

65 70 75 80

Glu Leu Leu Met Gly Ser Phe Gly Ile Val Cys Pro Asn Cys Ser Thr

85 90 95

Arg Leu

<210> 15

<211> 97

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 15

Met Arg Gly His Lys Pro Thr Leu Lys Glu Tyr Val Leu Asp Leu Tyr

1 5 10 15

Pro Glu Pro Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser

20 25 30

Asp Glu Asp Glu Gly Leu Asp Arg Pro Asp Gly Gln Ala Gln Pro Ala

35 40 45

Thr Ala Asp Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys His Thr Cys Asn Thr Thr

50 55 60

Val Arg Leu Cys Val Asn Ser Thr Ala Ser Asp Leu Arg Thr Ile Gln

65 70 75 80

Gln Leu Leu Met Gly Thr Val Asn Ile Val Cys Pro Thr Cys Ala Gln

85 90 95

Leu

<210> 16

<211> 99

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 16

Met His Gly Glu Ile Thr Thr Leu Gln Asp Tyr Val Leu Asp Leu Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ala Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Cys Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Glu Asp Thr Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Lys Pro

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Ser Cys Cys Lys Cys Glu Ala

50 55 60

Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Ile Asp Ile Arg Lys Leu

65 70 75 80

Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Phe Gly Ile Val Cys Pro Gly Cys Ser

85 90 95

Gln Arg Ala

<210> 17

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 17

Met Arg Gly Pro Lys Pro Thr Leu Gln Glu Ile Val Leu Asp Leu Cys

1 5 10 15

Pro Tyr Asn Glu Ile Gln Pro Val Asp Leu Val Cys His Glu Gln Leu

20 25 30

Gly Glu Ser Glu Asp Glu Ile Asp Glu Pro Asp His Ala Val Asn His

35 40 45

Gln His Gln Leu Leu Ala Arg Arg Asp Glu Pro Gln Arg His Thr Ile

50 55 60

Gln Cys Ser Cys Cys Lys Cys Asn Asn Thr Leu Gln Leu Val Val Glu

65 70 75 80

Ala Ser Arg Asp Thr Leu Arg Gln Leu Gln Gln Leu Phe Met Asp Ser

85 90 95

Leu Gly Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Thr Ala Asn Gln

100 105

<210> 18

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 18

Met His Gly Pro Arg Ala Thr Leu Gln Glu Ile Val Leu His Leu Glu

1 5 10 15

Pro Gln Asn Glu Leu Asp Pro Val Asp Leu Leu Cys Tyr Glu Gln Leu

20 25 30

Ser Glu Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ala Asp Gly Val Ser His Ala

35 40 45

Gln Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Lys Ile Leu Cys

50 55 60

Val Cys Cys Lys Cys Asp Gly Arg Ile Asp Leu Thr Val Glu Ser Ser

65 70 75 80

Ala Asp Asp Leu Arg Thr Leu Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser

85 90 95

Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Thr Asn Gln

100 105

<210> 19

<211> 99

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 19

Met Arg Gly Asp Lys Ala Thr Ile Lys Asp Tyr Ile Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Gly Asp Ser Ser

20 25 30

Asp Glu Glu Asp Thr Asp Gly Val Asp Arg Pro Asp Gly Gln Ala Glu

35 40 45

Gln Ala Thr Ser Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Tyr Cys His Ser Cys Asp

50 55 60

Ser Thr Leu Arg Leu Cys Ile His Ser Thr Ala Thr Asp Leu Arg Thr

65 70 75 80

Leu Gln Gln Met Leu Leu Gly Thr Leu Gln Val Val Cys Pro Gly Cys

85 90 95

Ala Arg Leu

<210> 20

<211> 105

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 20

Met His Gly Lys Val Pro Thr Leu Gln Asp Val Val Leu Glu Leu Thr

1 5 10 15

Pro Gln Thr Glu Ile Asp Leu Gln Cys Asn Glu Gln Leu Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Val Asp His Leu Gln Glu Arg Pro Gln

35 40 45

Gln Ala Arg Gln Ala Lys Gln His Thr Cys Tyr Leu Ile His Val Pro

50 55 60

Cys Cys Glu Cys Lys Phe Val Val Gln Leu Asp Ile Gln Ser Thr Lys

65 70 75 80

Glu Asp Leu Arg Val Val Gln Gln Leu Leu Met Gly Ala Leu Thr Val

85 90 95

Thr Cys Pro Leu Cys Ala Ser Ser Asn

100 105

<210> 21

<211> 88

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 21

Tyr Ile Leu Asp Leu His Pro Glu Pro Thr Asp Leu Phe Cys Tyr Glu

1 5 10 15

Gln Leu Cys Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu Ile Gly Leu Asp Gly Pro

20 25 30

Asp Gly Gln Ala Gln Pro Ala Thr Ala Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Cys

35 40 45

Cys Tyr Thr Cys Gly Thr Thr Val Arg Leu Cys Ile Asn Ser Thr Thr

50 55 60

Thr Asp Val Arg Thr Leu Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Cys Thr Ile

65 70 75 80

Val Cys Pro Ser Cys Ala Gln Gln

85

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 22

Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Cys Asp Ile Val Leu Asp Leu Glu

1 5 10 15

Pro Gln Asn Tyr Glu Glu Val Asp Leu Val Cys Tyr Glu Gln Leu Pro

20 25 30

Asp Ser Asp Ser Glu Asn Glu Lys Asp Glu Pro Asp Gly Val Asn His

35 40 45

Pro Leu Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Asn Ile Val

50 55 60

Cys Val Cys Cys Lys Cys Asn Asn Gln Leu Gln Leu Val Val Glu Thr

65 70 75 80

Ser Gln Asp Gly Leu Arg Ala Leu Gln Gln Leu Phe Met Asp Thr Leu

85 90 95

Ser Phe Val Cys Pro Leu Cys Ala Ala Asn Gln

100 105

<210> 23

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 23

Met His Gly Pro Lys Pro Thr Val Gln Glu Ile Val Leu Glu Leu Cys

1 5 10 15

Pro Cys Asn Glu Ile Glu Pro Val Asp Leu Val Cys His Glu Gln Leu

20 25 30

Gly Asp Ser Asp Asp Glu Ile Asp Glu Pro Asp His Ala Val Asn His

35 40 45

His Gln His Gln Leu Leu Ala Arg Arg Asp Glu Gln Gln Arg His Thr

50 55 60

Ile Gln Cys Thr Cys Cys Lys Cys Asn Asn Leu Leu Gln Leu Val Val

65 70 75 80

Glu Ala Ser Arg Glu Asn Leu Arg Lys Leu Gln Leu Leu Phe Met Asp

85 90 95

Ser Leu Asn Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Thr Glu Thr Gln

100 105 110

<210> 24

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 24

Met His Gly Arg His Val Thr Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Pro Asp Pro Val Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Val Asp Ser

20 25 30

Ser Glu Asp Glu Val Asp Glu Val Asp Gly Gln Asp Ser Gln Pro Leu

35 40 45

Lys Gln His Phe Gln Ile Val Thr Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn

50 55 60

Val Arg Leu Val Val Gln Cys Thr Glu Thr Asp Ile Arg Glu Val Gln

65 70 75 80

Gln Leu Leu Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro

85 90 95

Lys Thr

<210> 25

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 25

Met His Gly Arg Leu Val Thr Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Pro Asp Pro Val Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Glu Asp Ser

20 25 30

Ser Glu Asp Glu Val Asp Lys Val Asp Lys Gln Asp Ser Gln Pro Leu

35 40 45

Thr Gln His Tyr Gln Ile Leu Thr Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn

50 55 60

Val Arg Leu Val Val Glu Cys Thr Asp Gly Asp Ile Arg Gln Leu Gln

65 70 75 80

Asp Leu Leu Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro

85 90 95

Lys Pro

Claims

1.一种检测HPV18 E7蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区包含：氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-3所示的HCDR1-HCDR3；所述单克隆抗体的轻链可变区包含：氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4-6所示的LCDR1-LCDR3。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。

3.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包含权利要求1或2所述的单克隆抗体，以及任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

4.一种核酸分子，其特征在于，能够编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的重链和/或轻链的可变区或权利要求3所述的重组蛋白。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，编码所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列的核酸分子具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；和/或编码所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列的核酸分子具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

6.一种载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求4或5所述的核酸分子。

7.一种蛋白质或多肽，其特征在于，所述的蛋白质或多肽是由权利要求6所述的载体通过表达***进行表达得到；所述表达***为细菌、噬菌体、酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或无细胞表达***。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞能够表达权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3所述的重组蛋白、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的蛋白质或多肽。

9.一种偶联物，其特征在于，所述的偶联物含有权利要求1或2所述的单克隆抗体，以及其他生物活性物质；所述的单克隆抗体直接或通过连接片段与其他生物活性物质偶联。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3所述的重组蛋白、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的蛋白质或多肽、权利要求8所述的宿主细胞或权利要求9所述的偶联物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其他生物活性物质。

11.权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3所述的重组蛋白、权利要求7所述的蛋白质或多肽或权利要求9所述的偶联物在制备预防或者***的药物中的用途；其中，所述肿瘤为***、***癌、***部癌、***癌、***癌或口咽部癌。

12.一种检测装置，所述检测装置含有权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3所述的重组蛋白、权利要求7所述的蛋白质或多肽或权利要求9所述的偶联物。

13.一种检测样品中HPV18 E7蛋白的方法，所述方法包括：

(1)将样品与权利要求1或2所述的单克隆抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPV18 E7蛋白。