CN109563130A - 用于治疗神经退行性疾病的tdp-43线粒体定位抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了治疗受试对象的神经退行性疾病的方法，该方法包括向受试对象给予治疗有效量的TDP‑43线粒体定位抑制剂。

Description

用于治疗神经退行性疾病的TDP-43线粒体定位抑制剂

相关申请

本申请要求2016年4月27日提交的美国临时申请No.62/328,484和2016年4月7日提交的美国临时申请No.62/319,580的优先权，这些申请的主题以引用方式全文并入本文。

政府资助

本发明是在由美国国立卫生研究院(the national institutes of health)授予的Grant No.1R01NS089604下在政府支持下完成的。美国政府在本发明中具有某些权利。

背景技术

侧索硬化(ALS)是最普通的运动疾病，其表征为脑干和脊髓的进行性运动神经元变性，而额颞痴呆(FTD)是额叶皮层和颞叶皮层中由神经元损失导致的早发性失智症的第二普通形式。大量的ALS或FTD病例(称为散发性ALS或FTD)不是遗传传递的，并且它们原因仍未知。目前，对ALS和FTD没有有效的治疗。

TDP-43为小的广泛表达的RNA/DNA结合蛋白质，其包含两个串联RNA识别基序RRM1和RRM23。之前的研究表明TDP-43主要结合Mrna,并且调节转录后RNA加工，包括RNA剪接、转运和翻译。TDP-43中常染色体显性突变与散发性和家族性ALS有关，并且TDP-43由细胞核重新分布在细胞质中已经被认为是大部分形式的ALS和FTD常见亚型的病例标志。事实上，TDP-43在细胞质中的错误定位还表明其他主要的神经退行性疾病的重要的病理学特征，包括Alzheimer病,Parkinson病和Huntington病。

发明概述

本发明所述的实施方案通常涉及在神经细胞中抑制TAR DNA结合蛋白质43(TDP-43)线粒体定位的组合物和方法，特别涉及用于治疗有需要的受试对象的神经退行性疾病或紊乱的组合物和方法。所述的方法可以包括向有需要的神经细胞或受试对象给予治疗有效量的抑制TDP-43线粒体定位的试剂。

在一些实施方案中，神经退行性疾病或紊乱可以包括表征为和/或与异常TDP-43线粒体定位、TDP-43神经元毒性和/或TDP-43突变有关的神经退行性疾病或紊乱。神经退行性疾病可以包括例如侧索硬化(ALS),额颞痴呆(FTD),Alzheimer病,与Alzheimer病有关的痴呆,Parkinson病,老年性痴呆,Huntington病,Gilles de Ia Tourette综合征,多发性硬化或遗传性运动与感觉神经病。

其他实施方案涉及治疗与突变体TDP-43表达有关的运动协调和认知障碍的方法。该刚发可以包括向有需要的神经细胞或受试对象给予治疗有效量的抑制TDP-43线粒体定位的试剂。

在一些实施方案中，所述的试剂或TDP-43线粒体定位抑制剂包括大约5至大约10个氨基酸的治疗肽，其具有与TDP-43的线粒体内部靶向信号的大约5至大约8个连续氨基酸至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约95％的一致性。例如治疗肽可以包含氨基酸序列，其与M1(SEQ ID NO:1),M3(SEQ ID NO:3),M5(SEQ ID NO:5)或TDP-43的大约5至大约7个连续氨基酸至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约95％的一致性。在一些实施方案中，治疗肽可以包含、基本上由或者由具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的肽组成。

在其他的实施方案中，所述的试剂包含与治疗肽连接的转运部分，并且租金治疗肽被细胞吸收。例如转运部分可以为HIV Tat转运部分。

在其他的实施方案中，所述的细胞在待治疗的受试对象中，并且治疗试剂以口服或***方式给予待治疗的受试对象。

在其他的实施方案中，治疗肽在神经细胞中表达。

附图简述

图1(A-I)示出在ALS和FTD患者中，TDP-43与线粒体共同定位并且在线粒体中累积。(A,B)在年老匹配的正常个体(n＝5)和散发性ALS病例(n＝6)的腰脊髓中，Tom20和TDP-43在人类运动神经元中的代表性共聚焦图像和线性扫描分析(A)，或者在年龄匹配的个体(n＝3)和散发性FTD病例(n＝4)的皮质中人类皮质神经元(B)。使用分别针对Tom20和TDP-43的特异性抗体将神经元共同染色。在右侧面板中，显示Tom20和TDP-43(在a,b中宽度为“2”的白色实线)共同定位的代表性线性扫描分析。通过在方法部分中详细描述的Image JRGB Profile Plot plugin实施线性扫描分析。(c,d)通过Image J RGB 3D Viewerplugin，使用系列系列薄层共聚焦图像(大约30个连续图像，并且具有200nm光学厚度)，分别在a和b中，神经元的代表性再次构建的三维(3D)图像。在由年龄匹配的对照(n＝6)和散发性ALS(n＝8)脊髓中(E)，或者在年龄匹配的对照(n＝6)和散发性FTD(n＝7)皮质中(F)，分离的纯化的线粒体(“线粒体”)中，TDP-43水平的代表性免疫印迹和定量。与对照相比，在总的组织裂解物(“总裂解物”)中的TDP-43(即，“总TDP-43”)在ALS或FTD组织中保持未改变。用于细胞溶质(GAPDH),线粒体(COXIV和Tom20)和ER(Calnexin)的区室特异性标志物被包含在内。线粒体和总TDP-43的水平均分别受COXIV和GAPDH调节。(G,H)在由年龄匹配的对照和ALS脊髓(G)、以及年龄匹配的对照和FTD皮质(H)的线粒体制备的不同亚线粒体级份中，TDP-43的代表性免疫印迹。亚线粒体区室标志物包括用于OMM的Tom20，用于IMS的细胞色素c(Cyto c)，用于IMM的Tim23和用于基质的Hsp60。(I)在由年龄匹配的对照和散发性ALS脊髓、或者年龄匹配的对照和散发性FTD皮质分离的纯化的线粒体中，代表性免疫电子显微图像(免疫-EM)。右侧面板中的定量显示在薄层EM切片(50nm厚)中，每平方μm线粒体的平均数量的TDP-43金颗粒。箭头指向免疫金标记的TDP-43。等量的10μg蛋白质加载至所有的免疫印迹中。数据为三个重复的独立试验的平均值±s.e.m。统计学：单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验。*P<0.05,**P<0.01和***P<0.01。

图2(A-H)显示TDP-43中ALS相关的遗传突变增加了其向线粒体的输送。(A-C)由2个原代人类成纤维细胞系(由携带TDP-43G298S或A382T(G298S或A382T成纤维细胞))和4个年龄匹配的原代正常人类成纤维细胞(NHF1-4)分离的纯化的线粒体(“线粒体”级份)中(A)，表达Flag标记的人类WT和突变体TDP-43G298S,A315T或A382T(使用pan TDP-43抗体)的HEK293细胞中(B)，或者表达人类WT(n＝6)或突变体TDP-43 A315T(n＝6)的1-2个月龄的转基因雄性小鼠的脊髓和脑中(使用对人类TDP-43(hTDP-43)具有特异性抗体)(C)，TDP-43的代表性免疫印迹和定量。使用表达所示的Flag标记的TDP-43的构建体瞬时转染HEK293细胞。转染后两天，收集细胞用于线粒体分离并进一步的生物化学分析。星号表示内源TDP-43，而箭头表示外源Flag标记的TDP-43。还示出在总的细胞裂解物(“总裂解物”)中，TDP43和区室特异性标志物的免疫印迹。对于定量而言，通过总TDP-43(即，TDP-43在总的细胞裂解物中的表达)和COXIV(COXIV在线粒体级份中的表达)调节线粒体TDP-43。(D,E)在由人类成纤维细胞(D)，或者表达WT或突变体人类TDP-43的转基因小鼠的脊髓/脑组织(E)的纯化线粒体制备的亚线粒体级份中，TDP-43的代表性免疫印迹。(F)在线粒体输送测试后，在由小鼠的脑(使用/未使用0.25％胰蛋白酶或1148 0.25％胰蛋白酶/毛地黄皂苷(5mg/10mg线粒体)处理)得到的新分离的线粒体中，Flag标记的人类rTDP-43(左侧面板)或生物素化的F1β(右侧面板)的代表性免疫印迹。(G)在与rTDP-43温育所示的时间后，在通过0.25％胰蛋白酶/毛地黄皂苷(5mg/10mg线粒体)进行输送后处理后，在由小鼠脑得到的新分离的线粒体中，Flag标记的WT和突变体人类rTDP-43的代表性免疫印迹和定量。注意：在WT/突变体TDP-43的N-或C-末端的Flag标记对其输送不具有显著的影响(数据未示出)。(H)在线粒体输送测试后(未进行输送后处理)，在纯化的小鼠脑的线粒体中，Flag标记的人类rTDP-43WT或A315T的代表性免疫EM分析。定量显示在薄层EM切片中(50nm厚)，每平方μm线粒体的平均数量的TDP-43金颗粒。箭头指向免疫金标记的TDP-43。等量的蛋白质(10μg)加载至所有的免疫印迹分析中。数据为三个重复试验的平均值±s.e.m。统计学：单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验。*P<0.05,***P<0.001和****P<0.0001。在面板g中，与WT TDP-43相比，*P<0.05,*P<0.05。

图3(A-G)示出TDP-43线粒体输送/定位取决于TOM/TIM23复合物和内部M1/3/5基序。(A)人类TDP-43的结构(上方面板)和氨基酸序列(下方面板)(SEQ ID NO:10)。RRM1/2为RNA识别基序。NLS：细胞核定位序列；NES：细胞核输送序列。(B)在与所示的重组Flag标记的人类野生型(WT)TDP-43或人工TDP-43突变体(删除推定的内部靶向信号(ΔM1-6))温育后，在通过0.25％胰蛋白酶/毛地黄皂苷(5mg/10mg线粒体)处理(体外线粒体输入测试)，在由小鼠脑得到的新分离的线粒体中(通过“脑线粒体”示出)rTDP-43的代表性免疫印迹和定量。(C)在由HEK293得到的分离的纯的线粒体中，TDP-43的代表性免疫印迹和定量，其中所述的HEK293使用针对Flag的特异性抗体，过表达Flag标记的TDP-43(ΔM1-6)。还示出TDP-43在胞质蛋白级份(“胞质溶胶”)、细胞核级份(“细胞核”)和总的裂解物(“总体”)中的表达。还使用所示的构建体瞬时转染HEK293细胞，并且在转染后两天，进行线粒体分离。(D)Flag标记的rTDP-43和pF1β在线粒体中的代表性免疫印迹和定量，其中所述的线粒体使用5μM对照肽(cPM),PM1或PM3进行前/共处理，然后使用rTDP-43和pF1β温育进行体外线粒体输入测试。(E,F)TDP-43在分离的纯的线粒体中的代表性免疫印迹和定量，其中所述的线粒体得自使用1μM cPM,PM1或PM3处理24小时的HEK293细胞(E)或大鼠原代皮层神经元(体外12天：DIV 12,f)得到。还示出TDP43和区室特异性标志物在总的细胞裂解物(“总体”)中的免疫印迹。(G)GFP在分离的纯的线粒体中的代表性免疫印迹和定量，其中所述的线粒体得自表达GFP或M1/3/5-GFP(N-末端标记)的HEK293细胞。在使用所示的构建体瞬时转染后两天，收集HEK293细胞。定量基于使用胰蛋白酶/毛地黄皂苷共处理的样品。还示出GFP和M1/3/5标记的GFP在总的细胞裂解物(“总的裂解物”)中的免疫印迹。等量的10μg蛋白质加载至所有的免疫印迹中。数据为三个重复试验的平均值±s.e.m。统计学：单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验。*P<0.05。

图4(A-H)示出TDP-43优选地结合线粒体转录的mRNA(其编码复合物I的亚基ND3/6)并且抑制它们的翻译。(A)人类线粒体基因组的图谱。通过箭头示出轻链(OL)/重链(OH)复制起点、轻链和重链启动子(LSP和HSP)、以及DNA复制/转录方向。线粒体基因组编码位于编码基因之间的2rRNA和22tRNA，以及4个氧化磷酸化(OXPHOS)复合物(即，复合物I,III,IV和V)所必需的13个亚基。这13个线粒体编码的蛋白质包含复合物I的7个亚基(ND1,2,3,4,4L,5和6)，复合物V的2个亚基(A6和A8)。(B-D)在由3个月龄的小鼠的新鲜收集的小鼠脑分离得到的纯化线粒体(B)中，在培养的原代人类成纤维细胞(C)中，或者在过表达Flag标记的WT或突变体人类TDP-43的HEK293细胞(D)中，通过TDP-43或Flag特异性抗体沉淀的线粒体编码的mRNA的代表性逆转录酶耦合定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析。在使用所示的构建体瞬时转染后两天，分离由HEK293细胞得到的线粒体。使用与磁珠共价偶联的抗体实施所有的免疫沉淀(IP)，然后进行RNA提取和纯化。(E)在HEK293细胞中，线粒体编码的蛋白质翻译的代表性免疫印迹和定量。使用编码TDP-43 WT或ΔM1的构建体转染HEK293细胞。转染后两天，在依米丁(0.1mg/ml)存在下，使用AHA(50μM)代谢标记细胞。在线粒体纯化后，使用生物素-炔标记AHA标记的蛋白质，最后使用链霉亲和素缀合物通过免疫印迹进行分析。通过特异性抗体证实免疫印迹中ND3和ND6条带(未示出)。(F-H)在表达Flag标记的WT或突变体人类TDP-43的HEK293细胞(F)中，在使用1μM cPM(加扰M1)或PM1处理48小时的原代人类患者成纤维细胞(G)中，以及由ALS(n＝8)和年龄匹配的正常个体(n＝6)病例中得到的脊髓的人类组织样品(h)中，线粒体编码蛋白质的表达的代表性免疫印迹和定量。还瞬时转染HEK293细胞，两天后收集样品。加载等量的10μg蛋白质。数据为三个重复试验的平均值±s.e.m。统计学：单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验。*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001。在面板f中，*P<0.05。在面板a和b中，*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001。

图5(A-F)示出TDP-43特异性地减少复合物I组件并损害线粒体功能和形态学。(A,C)在过表达Flag标记的WT/突变体TDP-43(M1结构域被删除/未删除)的HEK293细胞(A)中，以及在1μM cPM(加扰M1)或PM1处理后48小时的培养的原代人类成纤维细胞(C)中，OXPHOS复合物I或I-V组件的代表性图像和定量。在瞬时转染后48小时，收集HEK293细胞，由细胞分离线粒体，裂解，并使用针对各种OXPHOS复合物亚基的特异性抗体通过BN-PAGE/免疫印迹进行分析。箭头指向复合物I。(B,D,E)在由过表达Flag标记的WT/突变体TDP-43(M1结构域被删除/未删除)的HEK293细胞分离的线粒体(B)中，在1μM cPM(加扰M1)或PM1处理后48小时的原代人类成纤维细胞(D)中，或者在共同过表达Flag标记的WT TDP-43,ND3和/或ND6的HEK293细胞(E)中，OXPHOS复合物I或II-V的活性的测量。使用所示的构建体瞬时转染HEK293，并分离线粒体在转染后48小时，用于酶活性。(F)在1μM cPM(加扰M1)或PM1处理后48小时，在原代人类成纤维细胞中，分批测量线粒体的功能，包括mΔψ,ATP生产和耗氧速率(OCR)。对于mΔψ，在24孔板中培养的成纤维细胞加载20nM TMRM达30min，并通过荧光微板读取器进行分析。通过ATP比色/荧光测试试剂盒和吸光率微板读取器测定成纤维细胞的ATP水平。使用the Seahorse XF24 Analyzer直接测量最佳接种密度(100,000个细胞/孔)的活培养成纤维细胞的OCR。将各样品中的所有测量对总蛋白质归一化。(G)线粒体长度在原代人类成纤维细胞中的代表性共聚焦图像和定量。在使用1μM cPM或PM1处理48小时前的一天，使用编码mitoDsRed2(线粒体特异性定位的红色荧光蛋白质)的构建体转染成纤维细胞，从而标记线粒体。通过DAPI将细胞核染成蓝色。各组中，n＝50个细胞。(F)原代人类成纤维细胞对氧化应激的敏感性的测量。将所示的原代人类成纤维细胞在24孔板中培养，并使用1μM cPM(加扰M1)或PM1预处理或未进行预处理。在预处理后48小时，使用50μM H2O2将成纤维细胞处理1小时，并在3个小时的回收后(在替换不具有H₂O₂的新培养基后)，通过乳酸脱氢酶(LDH)测试检验。在1％Triton X-100存在下，LDH释放作为100％细胞死亡(“100”)。在所有条件下，在NHF或患者成纤维细胞中，未观察到明显的细胞剥落，并且将各样品中的LDH释放对总的蛋白质归一化。数据为三个重复试验的平均值±s.e.m。统计学：单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验。*P<0.05。在面板A和B中，与对照细胞相比，*P<0.05；与表达WT TDP-43的细胞相比，#p<0.05。

图6(A-J)示出通过体内抑制TDP-43线粒体定位，保护线粒体和运动神经元免于TDP-43的毒性。(A)示意性及代表性大视野图像显示通过mitoDsRed2的体内双顺子慢病毒转导和线粒体标记。将编码EDP-43和mitoDsRed2的2μl 1×10⁹TU/ml双顺反子慢病毒注射至3个月龄的小鼠的运动皮质中，并在7天后处死。箭头指向注射位点。AP/前-后轴：1mm；ML/内侧-外侧：1mm；以及DV/腹-背：0.7mm。(B)在编码mitoDsRed2的双顺反子慢病毒感染的神经元中线粒体的长度以及在神经元特异性小鼠synapsin 1基因启动子之下所示的TDP-43WT和A315T的代表性2D/3D(放大)共聚焦图像和定量。上方面板为大视野图像，下方面板为神经突中线粒体的放大。由6只3个月龄小鼠/组得到，对于载体,WT,WT/ΔM1,A315T和表达神经元的A315T/ΔM1而言，n分别＝45,50,40,33和35。(C)在运动皮质中，切割的胱天蛋白酶3阳性神经元的代表性免疫染色和定量。通过DAPI染色核，并通过mitoDsRed2鉴定阳性感染的神经元。由6只3个月龄小鼠/组得到，对于载体,WT,WT/ΔM1,A315T和表达神经元的A315T/ΔM1而言，n分别＝35,37,33,33和32。(D)在由70天大的非转基因(NTG)和转基因小鼠的脊髓分离得到的线粒体中，线粒体编码蛋白质的表达的代表性免疫印迹和定量，其中所述的转基因小鼠表达TDP-43A315T(Tg)，其是使用所示的肽处理的(n＝6只小鼠/组，所有均为雄性，cPM：加扰M1)。(E,F)在由70天大的非转基因(NTG)和转基因小鼠的脊髓分离得到的突触线粒体中，OCR/mΔψ(E)和OXPHOS复合组件(F)的测量，其中所述的转基因小鼠表达TDP-43 A315T，其是使用所示的肽处理的(n＝4只小鼠/组，所有均为雄性)。由小鼠的脑分离突触体(由脊髓组织得到的突触体不足以用于进一步的线粒体纯化和OXPHOS复合组件的测量)并附着在海马XF24微板或24孔细胞培养板上。突触体中突触线粒体的OCR直接通过海马测定，而mΔψ在20nM TMRM加载30分钟后，通过荧光微板读取器测量。使用由突触体分离的线粒体，通过BN-PAGE/免疫印迹，使用针对各种OXPHOS复合物的亚基的、所示的特异性抗体，测定OXPHOS复合物组件。(G)在使用所示的肽处理的70天大的小鼠的腰部脊髓中的运动神经元计数(n＝6只小鼠/组，所有均为雄性)。(H)在腓肠肌(在腿肚子中最大的肌肉)中，肌肉神经接点(NMJ)的代表性共聚焦图像和定量。SV2(突触小泡蛋白2,突触前标志物)和(2H3,针对神经细丝的特异性抗体)；α-银环蛇神经毒素染色突触后标志物—烟碱乙酰胆碱受体(AChR)。n＝6只小鼠/组，所有均为雄性。(I)在由70天大的小鼠的步行足迹图案的代表性图像和定量，其中所述的小鼠使用所示的肽处理(n＝6只小鼠/组，雄性)。箭头指向步行方向。(J)使用所示的肽处理的70天大的小鼠在加速旋转(5分钟内，4-40rpm)中的运动协调性和平衡性(n＝6只小鼠/组，所有均为雄性)。对于D-J，所有的处理均由60天大的小鼠开始。数据为三个重复试验的平均值±s.e.m。统计学：单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验。*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001。

图7(A-E)示出成年半合子TDP-43M337V小鼠的感觉运动操作。(A)NTG和半合子TDP-43M337V小鼠在旋转时的运动协调性和平衡性，其是通过小鼠可以保持在加速旋转杆上的最大时间证明的。(B)通过横跨每个平衡木的潜伏期来评估在NTG和半合子43M337V小鼠中小鼠的运动协调性和平衡性。(C)NTG和半合子TDP-43M337V小鼠的前肢和下肢力量。(D)在旷场测试中，连续10分钟记录非转基因年龄匹配的同窝对照(NTG)和转基因(TG)半合子TDP-43M337V小鼠行进的距离(m)和速度(m/秒)。(E)通过小鼠用其后肢除去一块胶带的潜伏期来测量NTG和半合子TDP-43M337V小鼠的感觉运动反应。所有的小鼠均8-9个月龄。对于NTG，n＝11(8只雄鼠/3只雌鼠)，对于TG，n＝18(10值雄鼠/8只雌鼠)。使用双因素ANOVA分析、然后使用Bonferroni多重比较，分析平衡木行走测试的数据，同时使用student-t检验分析其他测试中的数据。所有的数据均用圆点以及平均值±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01；ns：无意义。

图8(A-D)示出成年半合子TDP-43M337V小鼠的认知性能。(A,B)在Y迷宫中NTG和半合子TDP-43M337V小鼠的自发***替(A)，以及在T迷宫测试中的新奇性偏爱(B)。(C)在目标辨别测试中在3个不同的时期，NTG和半合子TDP-43M337V小鼠对不熟悉的目标的偏爱比例。T1：第一个5分钟的跟踪时期；T2：1.5小时延迟的5分钟不同刺激时期；T3：24小时延迟的5分钟第三时期。(D)在跟踪时期，NTG和半合子TDP-43M337V小鼠的发愣行为(在未刺激时是***均值±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；ns：无意义。

图9(A-E)示出在半合子TDP-43^M337V小鼠的脑中，通过PM1对TDP-43线粒体定位、线粒体功能异常和神经元损失的抑制。通过皮下注射1.5mg/kg/天cPM(PM1的对照肽)或PM1，连续6周对11个月龄的NTG和半合子TDP-43M337V小鼠进行处理。NTG+cPM：使用cPM处理的NTG小鼠；NTG+PM1：使用PM1处理的NTG小鼠；TG+cPM：使用cPM处理的半合子TDP-43M337V小鼠；TG+PM1：使用PM1处理的半合子TDP-43M337V小鼠。(A)在使用cPM或PM1肽处理的NTG和TG小鼠脑的总裂解物和纯化线粒体级份中，外源人类TDP-43或总TDP-43的代表性免疫印迹和定量。加载10μg等量的蛋白质。数据为三个重复试验的平均值±SEM。(B)在皮质神经元中Tom20和TDP-43的代表性共聚焦图像，其中所述的皮质神经元是使用分别针对Tom20和TDP-43的特异性抗体共同染色的。通过Image J RGB Profile Plot plugin，对白实线中Tom20和TDP-43之间的共同定位进行线扫描分析。(C)在使用所示的肽处理的NTG和TG小鼠(n＝4只小鼠/组)中，突触线粒体中OCR/mΔψ的测量。由小鼠脑分离突触体，其附着在seahorseXF24微板或24孔细胞培养板上。通过seahorse直接测定突触体中突触线粒体的OCR，同时在20nM TMRM加载30分钟后通过荧光微板读取器测量mΔψ。(D,E)代表性苏木精伊红(H&E)染色的切片和定量显示在使用cPM的TG小鼠的小鼠皮质20层2&3中神经元密度降低(未进行cPM处理的Tg小鼠显示相似的图案，未示出)。相反，使用PM1处理的TG小鼠显示与NTG小鼠或通过cPM1或PM1处理的NTG小鼠相似的、相当的神经元密度和形态学。所有的小鼠均为12-13个月龄。对于NTG，n＝5，对于TG+cPM，n＝4，对于TG+PM1，n＝3。使用双因素ANOVA、然后通过Bonferroni多重比较，分析数据。*p<0.05；ns：无意义。

图10(A-E)示出通过PM1得到的成年半合子TDP-43M337V小鼠的改善的运动协调性操作。通过皮下注射1.5mg/kg/天cPM(PM1的对照肽)或PM1，连续6周对11个月龄的NTG和半合子TDP-43M337V小鼠进行处理。NTG+cPM：使用cPM处理的NTG小鼠；TG+cPM：使用cPM处理的半合子TDP-43M337V小鼠；TG+PM1：使用PM1处理的半合子TDP-43M337V小鼠。(A-E)在旋转(A)、平衡木行走(B)、前/后肢强度(C)、旷场(D)和粘纸测试(E)中，NTG+cPM,TG+cPM和TG+PM1小鼠的感觉运动操作。所有的小鼠均为12-13个月龄。对于NTG+cPM(4只雄鼠/3只雌鼠)，n＝7，对于TG+cPM(4只雄鼠/4只雌鼠)，n＝8，对于TG+PM1(5只雄鼠/4只雌鼠)，n＝9。使用ANOVA、然后通过Bonferroni多重比较，分析数据。所有数据均以圆点和平均值±SEM表示；*p<0.05；ns：无意义。

图11(A-D)示出通过PM1得到的成年半合子TDP-43^M337V小鼠的改善的运动认知性能。通过皮下注射1.5mg/kg/天cPM(PM1的对照肽)或PM1，连续6周对11个月龄的NTG和半合子TDP-43^M337V小鼠进行处理。NTG+cPM：使用cPM处理的NTG小鼠；TG+cPM：使用cPM处理的半合子TDP-43M337V小鼠；TG+PM1：使用PM1处理的半合子TDP-43M337V小鼠。(A-D)在Y迷宫(A)、T迷宫(B)、目标辨别(C)和恐惧条件测试(D)中，NTG+cPM,TG+cPM和TG+PM1小鼠的认知性能。所有的小鼠均为12-13个月龄。对于NTG+cPM(4只雄鼠/3只雌鼠)，n＝7，对于TG+cPM(4只雄鼠/4只雌鼠)，n＝8，对于TG+PM1(5只雄鼠/4只雌鼠)，n＝9。使用ANOVA、然后通过Bonferroni多重比较，分析数据。所有数据均以圆点和平均值±SEM表示；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；ns：无意义。

图12(A-D)示出5xFAD转基因小鼠的TDP-43线粒体定位改善的运动协调性和认知性能的抑制。通过皮下注射0.5mg/kg/天cPM(PM1的对照肽)或PM1，连续4周对10个月龄的NTg和Tg雌性小鼠进行处理。NTg+cPM，使用cPM处理的NTg小鼠；Tg+cPM，使用cPM处理的5xFAD小鼠；Tg+PM1，使用PM1处理的5xFAD。(A,B)在使用cPM或PM1肽处理的Tg小鼠的脑的纯化线粒体级份中，内源TDP-43的代表性免疫印迹(A)和定量(B)。加载10μg等量的蛋白质(B)。(C)在旋转中NTg+cPM,Tg+cPM和Tg+PM1小鼠的操作。(D)在Barnes迷宫任务中，NTg+cPM,Tg+cPM和Tg+PM1小鼠的操作。所有雌鼠均为10个月龄。对于NTg+cPM，n＝11，对于Tg+cPM，n＝9，对于Tg+PM1，n＝9。数据以平均值±SEM示出。*p<0.05。

发明详述

本发明所述的实施方案不限于特定的方法学、方案和试剂等，并且它们本身是可以改变的。本发明使用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且无意于限定本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书定义。除了操作实例以外，或者其中以其他方式表明，本发明使用的表示组分或反应条件的定量的所有数量在所有情况下都应该理解为通过术语“大约”来修饰。

所确认的所有专利和其他出版物均明确地引用方式并入本文，其目的在于描述和公开例如在所述的这些出版物中描述的方法学，其中所述的这些出版物可以与本发明关联使用。提供这些出版物仅用于在本申请提交之前的它们的公开。就此而言，不应该解释为承认：由于现有发明或任何其他的原因，本发明人无权提前披露所述的公开。关于日期的所有陈述或者关于这些文件的内容的呈现都是基于本申请可以利用的信息，并且对这些文件的日期或内容的正确性并非构成任何承认。

除非另外定义，否则本文使用的科学和技术术语均具有本领域那些普通技术人员通常理解的含义。此外，除非内容另外需要，否则单数术语包含复数，并且复数术语包含单数。通常，与本发明所述的细胞和组织培养物、分子生物学、蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交关联使用的***命名法和技术是本领域公知的，并且在本领域中常用。

冠词“a”和“an”在本文中用于指一个或超过一个(即，至少一个)的冠词的语法对象。例如“an element”是指一种元素或超过一种元素。

如本文所用，“a，b和c的一个或多个”是指a,b,c,ab,ac,bc或abc。在本文中使用“或”可以为包含性的或专用的。

术语动词性“包含”、分词性“包含”、动词性“包括”、分词性“包括”、动词性“具有”和分词性“具有”以包含性的开放性含义使用，是指其他的元素可以包含在内。如本文所用，术语“例如”、“比如”是非限定性的，并且仅是为了示意性说明的目的。“包括”和“包括但不限于”可交换使用。

如本文所用，术语“或”应该理解为是指“和/或”，除非内容中另外明确地说明。

术语“大约”或“大致”是指与参照定量、水平、值、数量、频率、百分率、维度、尺寸、量、重量或长度相比，变化为15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％或1％的定量、水平、值、数量、频率、百分率、维度、尺寸、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“大约”或“大致”是指相对于参照定量、水平、值、数量、频率、百分率、维度、尺寸、量、重量或长度而言，定量、水平、值、数量、频率、百分率、维度、尺寸、量、重量或长度±15％,±10％,±9％,±8％,±7％,±6％,±5％,±4％,±3％,±2％或±1％的范围。

术语“给予”患者包括通过将活性试剂传递给受试对象中所需位置(例如从而接触所需的细胞，例如所需的神经元)的任何合适的途径，向受试对象分配、传递或施加药物配制物中的活性试剂，包括通过肠胃外或口服途径、肌肉内注射、皮下或皮内注射、静脉内注射、口腔给予、经皮传递以及通过直肠、结肠、***内、鼻内或呼吸道途径给予的传递，给予脑脊液中或穿过血脑屏障。试剂可以通过静脉内注射例如给予昏迷的、麻醉的或瘫痪的受试对象，或者可以以静脉内的方式给予怀孕受试对象，从而抑制胎儿的神经元功能障碍。具体的给予途径可以包括局部应用，例如将放置在眼睑下的眼药水、膏或蚀解式配制物，眼内注射至水性或玻璃状液，注射至眼睛的外层(例如通过结膜下注射或筋膜下注射)，肠胃外给予或通过口服途径。

术语“接触神经元”或“处理神经元”是指试剂传递或“给予”至细胞或整个有机体的任何方式，其中所述的试剂在神经元中能够展现其药物作用。“接触神经元”包括将本发明的试剂携带至神经元的附近的体内和体外方法。合适的给予方式可以由本领域那些技术人员确定，并且这种给予方式可以在试剂之间改变。

术语试剂或治疗肽的“有效量”是指足以取得所需的治疗或药物作用的量，例如能够增强神经元活力和/或抑制神经元死亡的量。本文所定义的试剂的有效量可以根据多种因素改变，例如疾病状态、年龄、受试对象的体重以及试剂在受试对象中激发所需的应答的能力。可以调整剂量方案，从而提供最佳的治疗应答。有效量还是其中治疗有利作用超过活性试剂的任何毒性或有害作用的量。

术语“治疗有效量”是指在取得所需的治疗结果所必需的剂量和一段时间下，有效的量。治疗结果可以为例如症状减轻、延长生存、改善的活动性等。治疗结果不需要是“治愈”的。

术语“表达”是指一种过程，通过该过程，核酸被翻译成肽或者被转录成RNA，其例如可以被翻译成肽、多肽或蛋白质。如果核酸由基因组DNA衍生得到，如果选择合适的真核宿主细胞或有机体，则表达可以包括mRNA的剪接。对于有待在宿主细胞中表达的异源核酸而言，最初必须被传递至细胞中，然后一旦处于细胞中，便最终停留在核内。

术语“基因治疗”涉及将异源DNA转移至患有紊乱或状况(对于这些紊乱或状况正在寻求治疗或诊断)的哺乳动物的细胞中，特别是人类。将DNA以一定方式引入所选的靶细胞中，所述的方式使得异源DNA表达，并且产生由此编码的治疗产物。备选地，异源DNA可以以某些方式介导编码治疗产物的DNA的表达，其可以编码产物，例如肽或RNA，这些产物以某些方式直接或间接介导治疗产物的表达。基因治疗还可以用于传递编码基因产物的核酸，从而替代缺陷的基因或者补充其中引入该基因的哺乳动物或细胞产生的基因产物。被引入的核酸可以编码治疗化合物，例如它们的生长因子抑制剂或者肿瘤坏死因子或其抑制剂，例如受体，这些化合物在哺乳动物宿主中不能正常产生，或者不能以治疗有效量或者在治疗有用的时间产生。编码治疗产物的异源DNA可以被修饰，然后被引入备受折磨的宿主的细胞中，从而增强或者以其他方式改变它们的产物或表达。

术语“基因”或“重组基因”是指包含开放阅读框的核酸，其中所述的开放阅读框编码多肽，包括外显子和(可任选的)内含子序列。

术语“异源核酸序列”通常为编码RNA和蛋白质的DNA，这些RNA和蛋白质通常不能由表达该DNA的细胞在体内产生，或者这些DNA介导或编码媒介物，该媒介物通过影响转录、翻译或其他可调节的生物化学过程而改变内源DNA的表达。异源核酸序列还可以被称为外来DNA。本领域任一技术人员识别或认为对于表达DNA的细胞而言是异源的或外来的任何DNA在本发明中都被涵盖在异源DNA的范围内。异源DNA的实例包括但不限于编码痕量标志物蛋白质的DNA(例如赋予药品抗性的蛋白质)，编码治疗有效物质的DNA(例如抗癌试剂、酶和激素)，以及编码其他类型的蛋白质的DNA(例如抗体)。由异源DNA编码的抗体可以在其中已经引入异源DNA的细胞的表面上分泌或表达。

术语“同源性”和“一致性”在整个说明书中同义使用个，并且是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较各序列中的位置来确定同源性，其中将所述的序列比对以便进行比较。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据，则这些分子在该位置处是同源的或一致的。序列之间的同源性或一致性的程度为由这些序列共有的、匹配的或同源的位置的数量的函数。

术语“突变体”是指有机体遗传材料的改变，特别是野生型多核苷酸序列的改变(即，删除、取代、加入或改变)或者野生型蛋白质的改变。术语“变体”可以与“突变体”交换使用。尽管通常假设遗传材料的改变导致蛋白质功能的改变，但是术语“突变体”和“变体”是指野生型蛋白质序列的改变，而不管这种改变是否改变蛋白质的功能(例如增加、降低、赋予新的功能)或者这种改变是否对蛋白质的功能不具有影响(例如突变或变化是沉默的)。

如本文所用，术语“肠胃外给予”和“以肠胃外的方式给予”是指除了肠和局部给予以外的给予方式，通常通过注射给予，并且包括但不限于静脉内,肌肉内,动脉内,鞘内,心室内,囊内,眶内,心脏内,皮内,腹膜内,经气管,皮下,表皮下,关节内,囊下,蛛网膜下,脊柱内以及胸骨内注射和灌输。

如本文所用，术语“***给予”、“以***方式给予”、“外周给予”和“以外周方式给予”是指除了直接给予靶组织(例如中枢神经***)以外，化合物、药品或其他材料的给予，使得其进入动物***，并由此尽管新陈代谢和其他类似的过程，例如皮下给予。

术语“患者”、“受试对象”、“动物”或“宿主”是指任何哺乳动物。受试对象可以为人类，但是还可以为需要兽医治疗的哺乳动物，例如家养的动物(例如狗、猫等),农场动物(例如牛、绵羊、家禽、马等)和试验室动物(例如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。

术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本发明中还可以交换使用。

术语“肽”或“多肽”在本发明中可以交换使用，是指由大约2至大约90个氨基酸残基(包含端值)组成的化合物，其中一个氨基酸的氨基基团与另一个氨基酸的羧基基团通过肽键连接。肽可以例如由天然蛋白质通过酶或化学切割衍生或除去，或者可以使用常规的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(参见Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:LAB.MANUAL(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,1989))制备。“肽”可以包含任何合适的L-和/或D-氨基酸，例如常见的a-氨基酸(例如丙氨酸,甘氨酸,缬氨酸),非-a-氨基酸(例如P-丙氨酸,4-氨基丁酸,氨基己酸,肌氨酸,抑胃酶氨酸),和非天然氨基酸(例如瓜氨酸,高瓜氨酸,高丝氨酸,正亮氨酸,正缬氨酸,鸟氨酸)。肽上的氨基、羧基和/或其他官能团可以是游离的(例如未修饰的)，或者被合适的保护基团保护。用于氨基和羧基基团的合适的保护基团、以及用于加入或除去保护基团的手段是本领域已知的。例如参见Green&amp；Wuts,PROTECTING GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(John Wiley&amp；Sons,1991)。肽的官能团还可以使用本领域已知的方法衍生(例如烷基化)。

肽可以合成并组装成文库，其包含少至多的分泌分子物质。此类文库可以使用公知的组合化学方法制备，并且可以如本发明所述或者使用其他合适的方法筛选，从而测定所述的文库是否包含可以对抗CSPG-PTPσ相互作用的肽。然后可以通过合适的手段分离此类肽拮抗剂。

术语“拟肽”是指被设计用于模拟肽的类蛋白质分子。拟肽通常由现有肽的修饰形成，或者通过设计模拟肽(例如类肽和β-肽)的相似的***形成。无论方法如何，将改变的化学结构设计成有利地调节分子性质，例如稳定性或生物活性。这些修饰设计改变不能天然形成的肽(例如改变的主链，以及引入非天然氨基酸)。

当表达控制序列控制并调节所述的多核苷酸序列的转录和翻译时，多核苷酸序列(DNA，RNA)与表达控制序列“可操作地连接”。术语“可操作地连接”包括在待表达的多核苷酸序列之前具有合适的起始信号(例如ATG)，并且保持正确的阅读框，从而允许所述的多核苷酸序列在表达控制序列的控制之下表达，以及产生由所述的多核苷酸序列编码的所需的多肽。

如本文所用，术语“重组的”是指蛋白质由原核或真核表达***衍生得到。

术语“组织特异性启动子”是指用作启动子的核酸序列，即，调节所分离的核酸序列的表达，其中所述的核酸序列与所述的启动子可操作地连接，并且所述的核酸序列在组织的特定细胞中，例如上皮细胞的细胞中，影响所分离的核酸序列的表达。该术语还涵盖所谓的“渗漏”启动子，其调节所分泌的核酸主要在一种组织中表达，而且还导致在其他组织中表达。术语“转染”用于指外来DNA被细胞摄入。当外源DNA被引入细胞膜的内部时，该细胞为“转染的”。多种转染技术是本领域公知的。例如参见Graham等人,Virology 52:456(1973)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology(1986)；Chu等人,Gene 13:197(1981)。此类技术可以用于将一个或多个外源DNA部分(例如核苷酸整合载体和其他核酸分子)引入合适的宿主细胞中。所述的术语获取化学、电学和病毒介导的转染过程。

术语“转录调节序列”为在整篇说明书中使用的遗传术语，其是指诸如起始信号、增强子和启动子之类的核酸序列，其诱导或控制它们可操作地连接的蛋白质编码序列的转录。在一些实例中，重组基因的转录处于启动子序列的控制之下(或其他转录调节序列)，其控制重组基因在细胞类型(cell-type)中的表达，其中在所述的细胞类型中预计所述的表达。还可以理解为重组基因可以处于转录调节序列的控制之下，其中所述的转录调节序列与控制天然形式的蛋白质转录的那些序列相同或不同。

术语“载体”是指能够转运另一种核酸的核酸分子，其中所述的另一种核酸已经连接所述的核酸分子。优选的载体为能够使它们所连接的核酸自发复制和表达的一种或多种的那些。能够指导基因(载体与其可操作地连接)表达的载体在本发明中称为“表达载体”。

术语“野生型”分别是指编码蛋白质的多核苷酸序列或其部分、或者蛋白质序列或其部分，如同其在体内天然存在的那样。如本文所用，术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，在合适的情况下，为核糖核酸(RNA)。所述的术语还应该理解为包含由核苷酸类似物制备的RNA或DNA的类似物作为等价物，并且在用于所描述的实施方案时，包括单链(正义或反义)和双链多核苷酸。

用于本发明所述的方法的试剂、化合物、组合物、抗体等被认为是纯化的和/或分离的，然后用于它们的用途。纯化的材料通常是“基本纯的”，是指核酸、多肽或它们的片段、或者其他分子与天然伴随它们的成分分离。通常，当多肽为至少60重量％,70重量％,80重量％,90重量％,95重量％或者甚至99重量％，不含与该多肽天然结合的蛋白质和其他有机分子时，所述的多肽是基本纯的。例如基本纯的多肽可以通过由天然来源提取，通过重组核酸在通常不表达蛋白质IDE细胞中表达，或者通过化学合成而蝴蝶。“分离的材料”已经由其天然位置和环境中除去。在分离的或纯化的结构域或蛋白质片段的情况下，结构域或片段基本上不含在天然形成的序列中位于蛋白质侧翼的氨基酸序列。术语“分离的DNA”是指DNA基本上不含在天然形成的基因组中位于给定DNA侧翼的基因。因此，术语“分离的DNA”涵盖例如cDNA、克隆的基因组DNA和合成DNA。

当术语“部分”、“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”用于指本发明的多肽时，其包括保留本发明所述的至少一些生物学活性(例如相互作用的抑制，例如结合)的任何多肽。本发明所述的多肽可以包括但不限于部分、片段、变体或衍生分子，只要所述的多肽仍保持其功能即可。本发明的多肽或其部分可以包括蛋白水解片段、删除片段，特别是当被传递至动物中时更容易到达作用位点的片段。

术语“治疗”是本领域公认的，并且包括抑制受试对象的疾病、紊乱或状况，例如阻止其进展；以及减轻疾病、紊乱或状况，流入使得疾病、紊乱和/或状况退化。治疗疾病或状况包括减轻特定疾病或状况的至少一种症状，即使潜在的病理生理学不受影响。

在整个说明书中，在组合物被描述成具有、包括或包含特定成分的情况下，考虑的是组合物还将基本上由或者由所述的成分组成。类似地，在方法或工艺被描述为具有、包括或包含特定的工艺步骤的情况下，工艺还将基本上由或者由所述的处理步骤组成。此外，应该理解的是步骤的顺序或者用于实施某些作用的顺序是不重要的，只要本发明所述的组合物和方法保持可操作即可。此外，两个或多个步骤或作用可以同时实施。

除非另作说明，否则本发明使用的所有百分率和比例均以重量计。

本发明所述的实施方案通常涉及抑制TAR DNA结合蛋白质43(TDP-43)在神经细胞中的线粒体定位的组合物和方法，并且特别涉及用于治疗有需要的受试对象的神经退行性疾病或紊乱的组合物和方法。已经发现，TDP-43在患有神经退行性疾病(例如侧索硬化(ALS),额颞痴呆(FTD)和Alzheimer病)的患者的神经元的线粒体中累积。进一步发现，TDP-43的神经退行性疾病相关突变进一步增加TDP-43在神经元中的线粒体定位。在线粒体中，野生型和突变体TDP-43与编码OXPHOS呼吸复合物1亚基ND3和ND6的、线粒体转录的信使RNA(mRNA)结合，并损害它们的表达，导致复合物I分解和神经元细胞死亡。已经发现，抑制TDP-43在神经元中的线粒体定位可以消除野生型和突变体TDP-43诱导的线粒体功能障碍和神经元损失。

因此，本发明所述的一些实施方案涉及抑制、降低、减少或限制野生型和/或突变体TDP-43在细胞中的线粒体定位，例如神经元、神经细胞、神经元祖细胞、神经元干细胞，特别是患有或处于神经退行性疾病或紊乱的风险之下的受试对象的神经细胞，从而治疗神经退行性疾病或紊乱。所述的方法可以包括向受试对象的神经细胞给予治疗有效量的抑制TDP-43线粒体定位的试剂。

在一些实施方案中，神经退行性疾病或紊乱可以包括表征为或者与异常的TDP-43线粒体定位、TDP-43神经元毒性和/或TDP-43的疾病相关突变有关的神经退行性疾病或紊乱。神经退行性疾病可以包括例如侧索硬化(ALS),额颞痴呆(FTD),Alzheimer病,与Alzheimer病有关的痴呆,Parkinson病,老年性痴呆,Huntington病,Gilles de IaTourette综合征,多发性硬化或遗传性运动与感觉神经病。

其他实施方案涉及治疗与突变体TDP-43表达有关的运动协调性和认知障碍的方法。该方法可以包括向有需要的神经细胞或受试对象给予治疗有效量的抑制TDP-43线粒体定位的试剂。

在一些实施方案中，给予细胞或受试对象的试剂或治疗试剂可以为降低、抑制、减少和/或限制TDP-43在受试对象的神经元中的线粒体定位的任何试剂。TDP-43线粒体定位的降低、抑制、减少和/或限制可以包括任何可测量的、可重复和/或大幅的减少：TDP-43线粒体定位；TDP-43由细胞核向细胞质的再分布；TDP-43与编码线粒体呼吸复合物1亚基ND3和ND6结合；TDP-43介导的线粒体呼吸复合物1的组装；TDP-43诱导的线粒体功能障碍和神经元损失；和/或由突变体和/或野生型TDP-43线粒体定位介导的疾病的症状。大幅减少是“可重复的”，即，一致的观察到的减少。

TDP-43在神经元的线粒体定位可以通过多种方式降低、抑制、减少和/或限制，包括但不限于：TDP-43的线粒体定位的直接抑制(例如通过使用感染或抑制肽、显性负向多肽、中和抗体、小分子或拟肽)，促进TDP-43的定位、活性、信号传递和/或功能的一种或多种的基因和/或蛋白质的抑制(例如通过降低基因和/或蛋白质的表达或活性，例如Tim22或TOM/Tim22复合物)；抑制TDP-43的定位、活性、信号传递和/或功能的一种或多种的基因和/或蛋白质的激活(例如通过增加基因和/或蛋白质的表达或活性)；TDP-43下游的基因和/或蛋白质的抑制(例如通过阻断媒介物基因和/或蛋白质的表达和/或活性)；负调节TDP-43的活性、信号传递和/或功能的一种或多种的基因和/或蛋白质的引入(例如通过使用重组基因表达载体、重组病毒载体或重组多肽)；或者使用例如TDP-43的次形态突变体的基因替代(例如通过同源重组，使用重组基因表达或病毒载体的过表达或基因诱变)。

降低、抑制、减少或限制TDP-43在受试对象的神经元中线粒体定位的治疗试剂可以在细胞内传递，并且一旦在细胞内传递，便抑制TDP-43诱导的神经元毒性、与TDP-43突变有关的疾病和/或异常的TDP-43线粒体定位。

在一些实施方案中，降低、抑制、减少或限制TDP-43在受试对象的神经元中线粒体定位的治疗试剂包括大约5至大约10个氨基酸的治疗肽，其具有与TDP-43的线粒体内部靶向信号的大约5至大约8个连续的氨基酸至少大约70％,至少大约75％,至少大约80％,至少大约85％,至少大约90％,或至少大约95％一致的氨基酸序列。线粒体蛋白质通过可切割的前体序列或不可切割的内部信号被导向线粒体中。已经发现，TDP-43在输入后保持未切割的，并且在TDP-43中未鉴定出可切割的前体序列，表明TDP-43使用内部信号。线粒体内部信号通常由一连串疏水性氨基酸组成，并且六个这种疏水性氨基酸串存在于TDP-43(图3A,M1-6(SEQ ID NO:1-6))中。M1/3/5(ΔM1/3/5)(SEQ ID NO:1,3和5)的删除在体外显著地抑制rTDP-43的输入，并减少外源表达的TDP-43的线粒体定位(图3B,C)。包含M1(SEQ ID NO:1)和M3(SEQ ID NO:3)的治疗肽显著地抑制rTDP-43的输入，并降低HEK293细胞和原代神经元中的线粒体TDP-43(图3D-F)。有利的是，治疗肽(基于TDP-43线粒体定位所必需的所鉴定的基序)可以特异性地抑制WT或突变体TDP-43线粒体的输入，而对细胞核、胞质蛋白和总TDP-43的表达不具有影响。

在一些实施方案中，治疗肽可以包含与TDP-43的M1(SEQ ID NO:1),M3(SEQ IDNO:3),或M5(SEQ ID NO:5)的大约5至大约7个连续氨基酸至少大约70％,至少大约75％,至少大约80％,至少大约85％,至少大约90％,或至少大约95％一致性的氨基酸序列。

在其他的实施方案中，治疗肽可以对TDP-43的M1内部基序的一部分产生应答。对TDP-43的M1内部基序的一部分产生应答的治疗肽可以包含、基本上由或者由具有氨基酸序列FPGACGL(SEQ ID NO:1)或AQFPGACGL(SEQ ID NO:7)的肽组成。

在其他的实施方案中，治疗肽可以对TDP-43的M3内部基序的一部分产生应答。对TDP-43的M1内部基序的一部分产生应答的治疗肽可以包含、基本上由或者由具有氨基酸序列GFGFV(SEQ ID NO:3)或SKGFGFVRF(SEQ ID NO:8)的肽组成。

在其他的实施方案中，治疗肽可以对TDP-43的M5内部基序的一部分产生应答。对TDP-43的M1内部基序的一部分产生应答的治疗肽可以包含、基本上由或者由具有氨基酸序列GGGAGLG(SEQ ID NO:5)或SRGGGAGLG(SEQ ID NO:9)的肽组成。

本发明所述的治疗肽可以经历其他多种变化、取代、***和删除，其中此类变化在其应用中提供某些益处。就此而言，对TDP-43的线粒体内部靶向信号产生应答的治疗肽可以对所述多肽的序列产生应答，或者基本上同源而非一致，其中在所述的多肽中形成一个或多个改变，并且其保留了抑制或减少TDP-43线粒体定位的能力。

治疗肽可以为多种形式的多肽衍生物的任意一种，其包括酰胺、与蛋白质的缀合物、环化多肽、聚合的多肽、类似物、片段、化学修饰的多肽以及类似的衍生物。

治疗肽还可以通过天然工艺修饰，例如转录后加工和/或化学修饰技术，这些是本领域已知的。修饰可以在肽的任何位置进行，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应该理解的是在给定的肽中，在多个位置处，相同类型的修饰可以以相同的或不同的程度存在。修饰例如包括但不限于乙酰化,酰化,加入乙酰氨基甲基(Acm)基团,ADP-核糖基化,酰胺化,与黄素共价连接,与血红素部分共价连接,与核苷酸或核苷酸衍生物共价连接,与脂质或脂质衍生物共价连接,与磷脂酰肌醇共价连接,交联,环化,二硫键形成,去甲基化,共价交联形成,胱氨酸形成,焦谷氨酸形成,甲酰化,γ-羧化,糖基化,羟基化,碘化,甲基化,豆蔻酰化,氧化,蛋白水解加工,磷酸化,异戊烯化,外消旋作用,selenoylation,硫酸盐化,转运-RNA介导的氨基酸加入蛋白质中，例如精氨酰化和泛素化(参见Protein-structure and molecular properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman andCompany,New-York,1993)。

其他类型的肽修饰可以包括例如多肽序列中保守性或非保守性的氨基酸***(即，加入)、删除和取代(即，替代)，其中这种变化基本上不会改变肽的总体抑制剂能力，并且甚至可以在其用途中提供某些益处。就此而言，作为TDP-43定位抑制剂的肽对所述的肽产生应答，而非一致，其中在所述的多肽中形成一个或多个改变，并且其保留其发挥TDP-43定位的抑制剂的能力。

本发明所述的治疗肽还可以包括例如生物活性突变体、变体、片段、嵌合体和类似物；片段涵盖具有一个或多个氨基酸的截头的氨基酸序列，其中所述的截头可以来源于氨基末端(N-末端)、羧基末端(C-末端)，或者来源于蛋白质的内部。类似物涉及一个或多个氨基酸的***或取代。

本发明所述的治疗肽可以通过本领域那些技术人员已知的方法制备。所述的肽和/或蛋白质可以使用重组DNA制备。例如一种制备可以包括在一定条件下培养宿主细胞(原核或真核)，其提供肽和/或蛋白质在细胞内的表达。

多肽的纯化可以通过亲和方法、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水性或者通常用于蛋白质纯化的其他纯化技术来进行。纯化步骤可以在非变性条件下实施。一方面，如果需要变性步骤，可以使用本领域已知的技术使蛋白质复性。

在一些实施方案中，本发明所述的治疗肽可以包括其他残基，可以将这些残基加入在多肽的末端，从而提供“连接体”，通过该连接体，多肽可以与其他多肽、蛋白质、可检测部分、标记、固体基质或载体方便地连接和/或固定于其上。

氨基酸残基连接体通常为至少一个残基，并且可以为40或更多的残基，更通常的为1至10个残基。用于连接的典型的氨基酸残基为甘氨酸,酪氨酸,半胱氨酸,赖氨酸,谷氨酸,天冬氨酸等。此外，题述的多肽可以通过序列末端-NH2酰化(例如乙酰化)改性，或者通过末端-羧基酰胺化(例如使用氨、甲胺)的巯基乙酸酰胺化，以及类似的末端修饰而不同。如公知的那样，末端修饰用于降低由于蛋白酶消化而引起的敏感性，因此起到延长溶液中多肽半衰期的作用，特别是其中可以存在蛋白酶的生物流体。就此而言，因为环化形成的稳定的结构，并且鉴于对于本发明所述的这种环状肽所观察到的生物学活性，多肽环化也可以用于末端修饰，并且是特别优选的。

在一些实施方案中，连接体可以为连接治疗肽与其他多肽、蛋白质和/或分子(例如可检测的部分、标记、固体基质或载体)的挠性肽连接体。挠性肽连接体的长度可以为大约20或更少的氨基酸。例如肽连接体可以包含大约12或更少的氨基酸残基，例如3,4,5,6,7,8,9,10,11和12。在一些情况下，肽连接体包含以下氨基酸的两种或多种：甘氨酸,丝氨酸,丙氨酸和苏氨酸。

在一些实施方案中，包含本发明所述的治疗肽的治疗试剂可以以缀合蛋白质的形式提供，或者药品传递构建体至少包含转运亚结构域(多个)或部分(多个)(即，转运部分)，其与治疗肽连接。转运部分可以促进治疗肽摄入至哺乳动物(即，人类或动物)组织或细胞(例如神经细胞)中。转运部分可以与治疗多肽共价连接。共价连接可以包括肽键或不稳定键(例如容易断裂或者在靶细胞内部环境中发生化学改变的键)。此外，转运部分可以与治疗多肽交联(例如化学交联、UV交联)。转运部分还可以与具有本发明所述的连接多肽的治疗多肽连接。

转运部分在治疗试剂中可以重复超过一次。转运部分的重复可以影响(例如增加)肽和/或蛋白质被所需的细胞的摄入。转运部分还可以定位于治疗肽的氨基末端区域和/或羧基末端区域。

在一个实施方案中，转运部门可以包含至少一个转运肽序列，其可以使治疗肽一旦连接转运部分，便通过受体依赖的机制渗透至细胞中。在一个实例中，转运肽为包含Tat介导的蛋白质传递序列(例如YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:11))的合成肽。转运肽可以与所述的至少一个治疗肽融合，所述的治疗肽具有SEQ ID NO:1,3,5,7,8或9中的至少一种。这些肽可以分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:12-17。

已知的转运部分、亚结构域等的其他实例在例如加拿大专利文件No.2,301,157(包含触角足同源结构域的缀合物)以及在美国专利No.5,652,122,5,670,617,5,674,980,5,747,641和5,804,604中所述，所有这些文件的全部内容均以引用方式并入本文(包含TatHIV蛋白质的氨基酸的缀合物；单纯疱疹病毒-1DNA结合蛋白质VP22；长度范围为4至30个组氨酸重复序列的组氨酸标记；或者能够促进活性货物部分通过受体依赖的过程被摄入的变体衍生物或其同源物)。

触角足同源结构域的第三α-螺旋的16个氨基酸区域还显示能够使蛋白质(以融合蛋白质形式制备)穿越细胞膜(PCT国际公开号WO 99/11809和加拿大申请No.2,301,157)。类似地，HIV Tat蛋白质也显示能够穿越细胞膜。

此外，转运部分(多个)可以包含具有碱性氨基酸富集区域的多肽，其中所述的碱性氨基酸富集区域与活性试剂部分(例如包含细胞内结构域的片段抑制剂肽)共价连接。如本文所用，术语“碱性氨基酸富集区域”是指具有高含量的碱性氨基酸的蛋白质区域，例如精氨酸,组氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,赖氨酸。“碱性氨基酸富集区域”可以具有例如15％或更高的碱性氨基酸。在一些情况下，“碱性氨基酸富集区域”可以具有低于15％的碱性氨基酸，并且仍发挥转运试剂区域的作用。在其他情况下，碱性氨基酸区域具有30％或更高的碱性氨基酸。

转运部分(多个)可以进一步包含脯氨酸富集区域。如本文所用，术语脯氨酸富集区域是指在其序列中具有5％或更高(至多100％)脯氨酸的多肽。在一些情况下，脯氨酸富集区域可以具有5％至15％脯氨酸。此外，脯氨酸富集区域是指多肽的区域，其包含比通常在天然形成的蛋白质(例如由人类基因组编码的蛋白质)中所观察到的更多的脯氨酸。本申请的脯氨酸富集区域可以发挥转运试剂区域的作用。

在一个实施方案中，本发明所述的治疗肽可以与转导试剂非共价连接。非共价连接的多肽转导试剂的实例为Chariot蛋白质传递***(例如参见美国专利No.6,841,535；JBiol Chem 274(35):24941-24946；和Nature Biotec.19:1173-1176，所有这些文献的全部内容均以引用方式并入本文)。

在其他的实施方案中，治疗肽可以使用基因治疗在待处理的细胞中表达，从而抑制TDP-43的线粒体定位。基因治疗可以使用载体，其包含编码治疗肽的核苷酸。“载体”(通常称为基因传递或基因转移“介质”)是指分子的大分子或复合物，其中所述的分子包含待传递至细胞中的多核苷酸。待传递的多核苷酸可以包含基因治疗中所关注的编码序列。载体包括例如病毒载体(例如腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒)，脂质体，其他包含脂质的复合物，以及能够介导多核苷酸传递至靶细胞中的其他大分子复合物。

载体还可以其他成分或功能性，其进一步调控基因传递和/或基因表达，或者其以其他方式向靶细胞提供有利的性质。所述的其他成分包括例如影响与细胞结合或靶向细胞的成分(包括介导细胞型或组织特异性结合的成分)；影响载体核酸被细胞摄取的成分；影响多核苷酸在摄取后定位在细胞中的成分(例如介导细胞核定位的试剂)；以及影响多核苷酸表达的成分。这种成分还可以包括标志物，例如可检测的和/或可选择的标志物，其可以用于检测或选择已经被摄取并且表达由载体传递的核酸的细胞。这种成分可以作为载体的天然特征形式提供(例如使用某些病毒载体，其具有介导结合和摄取的成分或功能性)，或者载体可以仅修饰而提供这种功能性。

可选择的标志物可以是阳性的、阴性的或双功能的。阳性可选择标志物可以选择携带标志物的细胞，而阴性可选择标志物可以将携带所选择的标志物的细胞消除。已经描述多种此类的标志物基因，包括双功能(即，阳性/阴性)标志物(例如参见Lupton,S在1992年5月29日公开的WO 92/08796；和Lupton,S在1994年12月8日公开的WO 94/28143)。这种标志物基因可以提供增加的控制措施，其在基因治疗内容中是有利的。多种此类的载体是本领域已知的，并且通常是可利用的。

本发明使用的载体包括病毒载体、脂质基载体和其他非病毒载体，它们能够将编码本发明所述的治疗肽的核苷酸传递至靶细胞中。所述的载体可以为靶向载体，特别是优选地与神经元结合的靶向载体。用于本申请的病毒载体可以包括展示对靶细胞低毒性的并且以细胞特异性的方式诱导产生治疗有用量的治疗肽的那些

病毒载体的实例为衍生自腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)的那些。可以使用人类和非人类病毒载体，并且重组病毒载体在人类中可以是复制缺陷型的。在载体为腺病毒的情况下，所述的载体可以包含多核苷酸，其具有与编码治疗肽的基因可操作地连接的启动子，并且所述的载体在人类中是复制缺陷型的。

可以用于本发明的其他病毒载体包括单纯疱疹病毒(HSV)基病毒。被删除一个或多个立即早期基因(IE)的HSV载体是有利的，这是因为它们通常是非细胞毒性的，在靶细胞中持续类似于潜伏的状态，并且提供高效的靶细胞转导。重组HSV载体可以引入大约30kb的异源核酸。

逆转录病毒(例如C型逆转录病毒和慢病毒)也可以用于本申请中。例如逆转录病毒载体可以基于鼠科白血病病毒(MLV)。例如参见Hu and Pathak,Pharmacol.Rev.52:493-511,2000and Fong et al.,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17:1-60,2000。MLV基载体可以包含多达8kb异源(治疗)DNA替代病毒基因。异源DNA可以包含组织特异性启动子和编码治疗肽的核酸。在传递至神经细胞的方法中，还可以编码组织特异性受体的配体。

可以使用的其他逆转录病毒载体为复制缺陷型慢病毒基载体，包括人类免疫缺陷(HIV)基载体。例如参见Vigna and Naldini,J.Gene Med.5:308-316,2000and Miyoshi etal.,J.Virol.72:8150-8157,1998。慢病毒载体是有利的，这是因为它们能够影响主动***和非***细胞。

用于本申请的慢病毒载体可以由人类和非人类(包括SIV)慢病毒衍生。慢病毒载体的实例包括载体传播所需的核酸序列以及与编码治疗肽的核酸可操作地连接的组织特异性启动子。这些构成者可以包括病毒LTR、引物结合位点、多嘌呤管道、att位点和包封位点。

在一些方面中，可以使用慢病毒载体。已经证明慢病毒能够转导不同类型的CNS神经元(Azzouz et al.,(2002)J Neurosci.22:10302-12)，并且可以用于一些实施方案中，这是因为它们大的克隆能力。

慢病毒载体可以被包装至任何慢病毒衣壳中。一个颗粒蛋白质被得自不同病毒的另一个颗粒蛋白质取代，被称为“假型化”。载体衣壳可以包含得自其他病毒的病毒包膜蛋白质，包括鼠科白血病病毒(MLV)或水疱性口炎病毒(VSV)。使用VSV G-蛋白质会产生高的载体效价，并且得到更高稳定性的载体病毒颗粒。

α病毒基(例如由西门利克森林病毒(SFV)和辛德比斯病毒(SIN))也可以用于本申请中。在Lundstrom,K.,Intervirology 43:247-257,2000和Perri et al.,Journal ofVirology 74:9802-9807,2000中描述了α病毒的用途。

由于重组复制缺陷型α病毒载体能够进行高水平的异源(治疗)基因表达，并且可以影响多种靶细胞，所以所述的病毒载体是有利的。α病毒复制子可以通过在它们的病毒粒子表面上展示功能异源配基或结合结构域(其允许选择性地结合表达关联性结合配偶体(cognate binding partner)的靶细胞)而靶向特定的细胞类型。α病毒复制子可以在靶细胞中建立潜在的、并由此为长期的异源核酸表达。复制子在靶细胞中还可以展示瞬时异源核酸表达。

在与本申请的方法相容的许多病毒载体中，在所述的载体中可以包含超过一种的启动子，从而允许超过一种的载体表达的异源基因。此外，所述的载体可以包含序列，该序列编码信号肽或其他部分，其会促进治疗肽由靶细胞的表达。

为了将两个病毒载体***的有利性质结合，可以使用杂交病毒载体将编码治疗肽的核酸传递至靶神经元、细胞或组织中。用于构建杂交载体的标准技术是本领域那些技术人员公知的。这种技术可以在例如Sambrook等人的In Molecular Cloning:A laboratorymanual.Cold Spring Harbor,N.Y.中，或者在任意数量的试验室手册(其讨论重组DNA技术)中找到。在包含AAV和腺病毒ITR的组合的腺病毒衣壳中，双链AAV基因组可以用于转导细胞。在另一种变体中，可以将AAV载体放置于“无病毒的”、“辅助病毒依赖性”或“高能力”腺病毒载体。腺病毒/AAV杂交载体在Lieber et al.,J.Virol.73:9314-9324,1999中讨论。逆转录病毒/腺病毒杂交载体在Zheng et al.,Nature Biotechnol.18:176-186,2000中讨论。在腺病毒中包含的逆转录病毒基因组可以整合至靶细胞基因组中，并产生稳定的基因表达。

还进一步考虑了促进治疗肽表达和载体克隆的其他核苷酸序列元件。例如启动子上游的增强子的存在或者编码区下游终止子的存在可以促进表达。

根据另一个实施方案，组织特异性启动子可以与编码本发明所述的治疗肽的核苷酸融合。通过将这种组织特异性启动子融合至腺病毒构建体中，将转基因的表达局限于特定的组织中。可以使用本申请的重组腺病毒***，测定基因表达的效率以及由组织特异性启动子提供的特异性的程度。诸如血小板衍生的生长因子β-链(PDGF-β)启动子和载体之类的神经元特异性启动子是本领域公知的。

除了病毒载体基方法以外，非病毒方法也可以用于将编码治疗肽的核酸引入靶细胞中。基因传递的非病毒方法的综述在Nishikawa and Huang,Human Gene Ther.12:861-870,2001中提供。根据本申请的非病毒基因传递方法的实例使用质粒DNA，从而将编码治疗肽的核酸引入细胞中。质粒基基因传递方法是本领域公知的。

可以设计合成基因转移分子，从而形成具有质粒DNA的多分子聚集体。这些聚集体可以被设计成与靶细胞结合。阳离子两性分子(包括脂多胺和阳离子脂质)可以用于进入靶细胞的受体依赖性核酸转移。

此外，所实施的阳离子脂质体或阳离子脂质可以与质粒DNA混合，从而生成细胞转染复合物。与阳离子脂质配制物有关的方法在Felgner et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.772:126-139,1995and Lasic and Templeton,Adv.Drug Delivery Rev.20:221-266,1996中综述。对于基因传递而言，DNA还可以与两性阳离子肽偶联(Fominaya et al.,J.Gene Med.2:455-464,2000)。

可以根据本申请，使用与病毒和非病毒基成分有关的方法。例如用于治疗基因传递的EB病毒(EBV)基质粒在Cui et al.,Gene Therapy 8:1508-1513,2001中描述。此外，与腺病毒偶联的DNA/配基/聚阳离子助剂有关的方法在Curiel,D.T.,Nat.Immun.13:141-164,1994中描述。

此外，通过使用电穿孔技术转染靶细胞，可以将编码治疗肽的核酸引入靶细胞中。电穿孔技术是公知的，并且可以用于促进使用质粒DNA转染细胞。

编码治疗肽表达的载体可以在体内以可注射制备物的形式传递至靶细胞，其中所述的制备物根据需要，包含药物可接受的载体，例如生理盐水。根据本申请，还可以使用其他的药物载体、配制物和剂量。

在靶细胞包含待处理的神经元的情况下，可以在足以使治疗肽表达至一定程度的量通过直接注射传递载体，其中所述的量允许高效的治疗。通过将载体直接注射至或者处于神经元的周围，可以相当高效地靶向载体转染，并使重组载体的损失最低。这种类型的注射能够局部转染所需数量的细胞，特别是在CNS损伤位点处，由此使基因转移的治疗效力最大，并使对病毒蛋白质产生炎性应答的可能性最低。可以使用将载体给予靶细胞的其他方法，并且取决于所使用的具体载体。

治疗肽可以在靶细胞内表达任何合适长度的时间，包括瞬时表达以及稳定的长期表达。在本申请的一个方面中，编码治疗肽的核酸以治疗量表达有效诱导转染细胞活性和生长的定义长度的时间。在本申请的另一个方面中，编码治疗肽的核酸以治疗量表达有效治疗神经退行性疾病或紊乱的定义长度的时间。

治疗量为能够在处理的动物或人类中产生医学期望结果的量。如医学领域公知的那样，用于任意一种动物或人类的剂量取决于许多因素，包括受试对象的尺寸、体表面积、年龄、待给予的特定的组合物、性别、时间、给予途径、一般健康情况和同时给予的其他药品。本领域的任一技术人员使用下文所述的试验方法，可以容易地测定蛋白质和核酸的具体剂量。

本发明所述的治疗试剂可以进一步被修饰(例如化学修饰)。这种修饰可以被设计成促进分子的操作或纯化，从而增加分子的溶解性、促进给予、靶向所需的位置、增加或降低半衰期。多种此类修饰方法是本领域已知的，并且可以由技术从业者实施。

在另一个方面中，治疗试剂可以以药物组合物的形式提供。药物组合物通常包含溶解或分散液药物可接受的载体或水性介质中的有效量的试剂。还考虑了结合治疗方法，相同类型的潜在的药物组合物可以用于单一和结合药剂中。

在一些实施方案中，治疗试剂可以配制用于肠胃外给予，例如配制用于通过皮下、静脉内、肌肉内、经皮、玻璃体内或其他此类的途径注射，包括蠕动给予和直接灌输至靶位点处。根据本发明公开，包含此类治疗试剂作为活性组分的水性组合物的制备是本领域那些技术人员已知的。通常，此类组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬液；还可以制备适用于制备在注射之前加入液体的溶液或悬液的固体形式；并且制备物还可以乳化。

可以用于注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散液；包含麻油、花生油或水性丙二醇的配制物；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有的情况下，所述的形式应该是无菌的，并且流动达到存在注射性的程度。其在制造和储存条件下应该是稳定的，并且应该被保存抵抗微生物有机体的污染作用，例如细菌和真菌。

治疗试剂的组合物可以配制成中性或盐形式的无菌水性组合物。可以在适当混合表面活性剂(例如羟丙基纤维素)的水中制备游离碱或药物可接受的盐形式的溶液。药物可接受的盐包括酸加成盐(使用蛋白质的游离氨基基团形成)以及使用无机酸(例如盐酸或磷酸)或此类有机酸(例如乙酸、三氟乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的那些。使用游离羧基基团形成的盐还可以由无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和此类有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)衍生得到。

载体的实例包括包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、它们合适的混合物和植物油的溶剂和分散介质。在许多情况下，优选的是包含等渗试剂，例如糖或氯化钠。例如通过使用涂料(例如卵磷脂)通过在分散的情况下保持所需的颗粒尺寸和/或通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动性。

在储存和使用的通常条件下，所有此类制备物都应该包含防腐剂以防止微生物有机体生长。微生物有机体的作用的预防可以通过多种抗细菌试剂和抗真菌试剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等)实现。可注射组合物的延长的吸收可以通过使用延长吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和凝胶)的组合物来实现。

在配制之前或配制时，可以将治疗试剂大量透析，从而除去不理想的小分子量分子，和/或在合适的情况下冻干，从而更容易地配制成所需的媒介物。通过将所需量的活性试剂引入具有上文列举的多种其他组分的合适的溶剂中，然后根据需要，过滤除菌，从而制备无菌的可注射的溶液。通常，通过将多种无菌的活性组分引入无菌媒介物中，制备分散液，其中所述的媒介物包含基本的分散介质以及由上文列举的那些得到的所需的其他组分。

在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性组分的粉末，加上由之前无菌过滤的溶液得到的其他所需的组分。

根据预定的用途，药物组合物的实例通常可以包含与可接受的药物稀释剂或赋形剂(例如无菌水性溶液)预混的一定量的TDP-43线粒体定位抑制剂肽，从而得到最终的浓度范围。

用于上文注释的给予方式(以及其他方式)的药物化合物的配制物是本领域已知的，并且在例如Remington's Pharmaceutical Sciences(18th edition),ed.A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(also see,e.g.,M.J.Rathbone,ed.,OralMucosal Drug Delivery,Drugs and the Pharmaceutical Sciences Series,MarcelDekker,Inc.,N.Y.,U.S.A.,1996；M.J.Rathbone et al.,eds.,Modified-Release DrugDelivery Technology,Drugs and the Pharmaceutical Sciences Series,MarcelDekker,Inc.,N.Y.,U.S.A.,2003；Ghosh et al.,eds.,Drug Delivery to the OralCavity,Drugs and the Pharmaceutical Sciences Series,Marcel Dekker,Inc.,N.Y.,U.S.A.,2005；以及Mathiowitz et al.,eds.,Bioadhesive Drug Delivery Systems,Drugs and the P harmaceutical Sciences Series,Marcel Dekker,Inc.,N.Y.,U.S.A.,1999中描述。本发明的化合物可以配制成包含药物可接受的非毒性赋形剂和载体的药物组合物。赋形剂为除了活性组分或多种组分以外的所有存在于药物配制物中的成分。用于本发明的合适的赋形剂和载体由以下材料组成，该材料被认为是安全且有效的，并且可以给予个体，而不会产生不理想的生物学副作用或与其他药剂产生不需要的相互作用。合适的赋形剂和载体为由以下材料组成的那些，所述的材料不会影响试剂的生物利用性和性能。如本文通常使用的那样，“赋形剂”包括但不限于表明活性剂、乳化剂、乳液稳定剂、润肤剂、缓冲剂、溶剂、染料、风味剂、粘结剂、填料、润滑剂和防腐剂。合适的赋形剂包括本领域公认的那些，例如“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,4th Ed.,PharmaceuticalPress,2003。

治疗试剂的配制物在多种剂型中容易地给予，例如上文所述的可注射的溶液，而且还考虑了其他药物可接受的形式，例如片剂、药丸、胶囊或者用于口服给予的其他固体、栓剂、子宫托、鼻用溶液或喷雾、气溶胶、吸入剂、局部配制物、脂质体形式等。给予形式的类型与待治疗的疾病或紊乱匹配。

可以使用药物“缓释”胶囊或“持释”组合物或制备物，并且通常是适用的。缓释配制物通常被设计成在延长的时期内给予恒定的药品水平，并且根据本发明，可以用于传递TDP-43线粒体定位抑制剂肽。缓释配制物通常被植入疾病位点的附近。

持释制备物的实例包括包含多肽或免疫缀合物的固态疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型制品形式，例如膜或微囊。持释基质的实例包括聚酯；水凝胶，例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)；聚乳酸，例如美国专利No.3,773,919；L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物；不可降解的乙烯-醋酸乙烯；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如Lupron Depot(可注射的微球，其由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成)；以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

尽管诸如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物能够在100天内释放分子，但是某些水凝胶在更短的时间内释放蛋白质。当囊封的多肽长时间保持在肌体中时，在37℃下暴露于水份的结果是它们可以变性或聚集，因此降低生物学活性和/或改变免疫原性。根据所涉及的机制，将合理的方案用于稳定性。例如如果聚集机制涉及通过硫代-二硫化物的互换而形成分子内S-S键，则可以通过修饰硫氢基、由酸性溶液冻干、控制水份含量、使用合适的添加剂、形成特定的聚合物基质组合物等，达到稳定性。

在一些实施方案中，治疗试剂和包含本发明所述的治疗试剂的药物组合物可以被传递至CNS和/或PNS的神经元。这种神经元可以是损伤的或生病的。这种神经元可以交替有健康的未损伤的神经元。这种神经元可以位于损伤位点或者伴随损伤的位点。用于本发明所述的试剂和组合物的治疗给予、传递/接触所靶向的神经元为以下神经元：认为抑制这种神经元发生神经元变性或死亡已经证明对于受试对象是有利的。这种测定在本领域技术人员的能力范围内(仅通过常规的试验)。

本发明所述的治疗试剂和治疗药物组合物还可以被传递至CNS和/或PNS的非神经元细胞，例如对神经细胞提供支持的非神经元细胞。这种细胞包括但不限于神经胶质细胞(例如星形胶质细胞,少突细胞,室管膜细胞,CNS中的放射状胶质细胞和Schwann细胞,卫星细胞,PNS中的肠道glail细胞)。

在一些实施方案中，可以提供包含一种或多种治疗试剂的药物组合物，并给以受试对象用于体内抑制TDP-43线粒体定位。可以将药物组合物给予可以经历治疗试剂的有利效果的任何受试对象。人类是这些动物中最重要的，但是本发明无意于如此限定，本发明可以用于治疗患有神经退行性疾病的动物和患者。

用于本发明所述的方法中的药物组合物可以具有治疗有效量的试剂，其剂量范围为受试对象的0.01至1,000mg/kg体重，更优选的是剂量范围为患者的大约1至100mg/kg体重。在某些实施方案中，用于本发明的方法的药物组合物具有治疗有效量的试剂，其剂量范围为受试对象的1至10mg/kg体重。

总体剂量为治疗有效量，其取决于多种因素，包括所使用的具体的试剂、受试对象的总体健康情况、受试对象的疾病状态、状况的严重性、改善情况的观察、以及所选试剂(多种)的配制和给予途径。治疗有效量的测定在本领域那些技术人员的能力范围内。个体医生根据受试对象的状况，选择确切的配方、给予途径和剂量。

在一些实施方案中，治疗试剂可以用于治疗与神经***的元素有关的疾病、紊乱或状况，包括神经***的中枢、躯体、自主、交感和副交感成分，眼睛、耳朵、鼻、口或其他器官中的感觉神经组织，以及与神经元细胞和结构有关的神经胶质组织。神经退行性疾病或紊乱可以表征为和/或与异常的TDP-43线粒体定位、TDP-43神经元毒性和/或TDP-43突变有关。神经退行性疾病可以包括例如侧索硬化(ALS),额颞痴呆(FTD),Alzheimer病,与Alzheimer病有关的痴呆,Parkinson病,老年性痴呆,Huntington病,Gilles de IaTourette综合征,多发性硬化或遗传性运动与感觉神经病。

一个具体的方面考虑了受试对象的ALS的治疗。所述的方法包括向受试对象给予治疗有效量的所述的一种或多种治疗试剂。ALS在表型上表征为渐进性虚弱，在神经病理学上表征为运动神经元损失。考虑的是，本发明的方面可以消除野生型和突变体TDP-43诱导的线粒体功能障碍和神经元损失，由此改善ALS受试对象的疾病表现型。

用于治疗患有神经退行性疾病或紊乱的受试对象的另一种方案是给予治疗有效量的本发明所述的TDP-43线粒体定位抑制剂，以及治疗有效量的其他抗神经退行性疾病的试剂。抗神经退行性疾病的试剂的实例包括L-多巴,胆碱酯酶抑制剂,抗胆碱能药物,多巴胺激动剂,甾类化合物；以及免疫调控剂，包括干扰素,单克隆抗体和醋酸格拉替雷。

因此，在本发明的另一个方面中，本发明所述的治疗试剂作为与辅助治疗的结合治疗的一部分给予，用于治疗神经退行性和髓磷脂相关的紊乱。

短语“结合治疗”涵盖给予本发明所述的治疗试剂(例如TDP-43线粒体定位抑制剂)和其他的治疗试剂作为具体治疗方案的一部分，意图由这些治疗试剂的共同作用提供有利的效果。当TDP-43线粒体定位抑制剂和治疗试剂作为结合治疗给予时，它们可以配制成分开的组合物。在结合治疗中给予这些治疗试剂通常在定义的时期内进行(根据所选的结合治疗，通常为分钟、小时、天或周)。

“结合治疗”意图涵盖以顺序的方式给予这些治疗试剂，换言之，其中在不同时间给予各种治疗试剂，以及在基本同时的方式给予这些治疗试剂或者至少两种治疗试剂。例如可以通过向受试对象给予具有固定比例的各种治疗试剂的单个胶囊，或者多次给予单个的胶囊(每个胶囊用于各种治疗试剂)完成基本同时的给予。依次的或基本同时的给予各种治疗试剂可以通过任何合适的途径实施，包括但不限于皮下途径、口服途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织直接吸收。治疗试剂可以通过相同的途径或不同的途径给予。例如所述的结合治疗的第一治疗试剂可以通过静脉内注射给予，而结合治疗的其他治疗试剂可以口服给予。备选地，例如所有的治疗试剂可以口服给予，或者所有的治疗试剂可以通过静脉内注射给予。其中治疗试剂给予的顺序不是狭隘地重要的。“结合治疗”还可以涵盖给予上文所述的治疗试剂，并另外结合其他的生物学活性组分(例如但不限于第二和不同的治疗试剂)和非药品治疗(例如手术)。

包含以下实施例意图证明本发明的优选的实施方案。本领域那些技术人员应该理解的是，在下文的实施例中公开的技术呈现出本发明人在良好地运用本发明的实践中发现的技术，并由此可以认为构成了其实践的优选的方式。然而，本领域那些技术人员根据本发明公开，理解的是在所公开的具体的实施方案中可以进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍获得相似的或类似的结果。

实施例

实施例1

抑制TDP-43线粒体定位可阻断其神经元毒性

尚待确定的是通过核耗尽使TDP-43功能损失或者通过不利地影响细胞质TDP-43而获得功能是否导致ALS和FTD中的神经元损失。本实施例显示TDP-43细胞质TPD-43足以导致神经元毒性和神经退行性病变，并且抑制TDP-43线粒体定位可以阻断其神经元毒性。

材料和方法

将死后得自University Hospitals of Cleveland的小鼠和人类脊髓组织的免疫细胞化学和免疫荧光固定，并如之前所述，制备6μm厚的连续的切片(表1)。通过过氧化物酶抗过氧化物酶方案实施免疫细胞化学。就免疫荧光染色而言，使用蒸馏的H₂O简单地将脱脂并再水合的组织切片洗涤三次，然后放置于1X抗原decloaker(Biocare,Concord,CA)中。然后在加压下，使用Biocare’s Decloaking Chamber，通过在10秒内加热至125℃并在30秒内冷却至90℃、然后在128℃下加热至22psi并在94℃下冷却至0psi，使切片经过抗原修复。在温度降低至30℃之后，使用蒸馏的H2O逐渐将切片漂洗五次。接着，在RT下，使用10％正常山羊血清(NGS)将切片封闭30min，并在4℃下在包含1％NGS的PBS中与一级抗体温育过夜。在使用PBS洗涤3次后，将切片在10％NGS中温育10min，然后在RT下在黑暗中与Alexa Fluor缀合的二级抗体(Life Technologies,Grand Island,NY)(1:300)温育2h。最后，使用PBS将切片洗涤三次，使用DAPI染色，再使用PBS洗涤三次，并使用Fluoromount-G封片剂封片(Southern Biotech,Birmingham,AL)。

表达载体、重组蛋白质、肽、抗体和化学药品

获得MitoDsRed2(Clontech,Mountain View,CA)和慢病毒包装质粒(PCMV-dR8.2和PCMV-VSVG，得自Addgene,Cambridge,MA)。通过将TDP-43克隆至PCMV-3Tag-1a(Agilent,Santa Clara,CA)或pCMVTnT(Promega,Madison,WI)中，形成Flag标记的TDP-43构建体。基于PCMV-3Tag-9a(Agilent,Santa Clara,CA)，形成与M1/3/5构建体融合的GFP。全部使用QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent,Santa Clara,CA)形成TDP-3突变。通过将TDP-43和mitoDsRed2克隆至pLVX-Puro(Clontech)中，并使用小鼠突触蛋白1启动子替代PCMV启动子，形成MitoDsRed2/TDP-43双顺反子慢病毒构建体。直接合成核形式的ND3或ND6基因，其中在5′-末端加入得自人类细胞色素c氧化酶亚基VIII的线粒体靶向序列(并在3’-末端加入myc标记)，并将其亚克隆至pcDNA3.1(+)(GenScript)中。获得用于RT-PCR/实时-PCR(Life Technologies,Grand Island,NY)和RNAi寡核苷酸(SigmaSt.Louis,MO；Tim22esiRNAi:EHU160361-20UG和Tim23esiRNAi:EHU106141-519 20UG)的引物。His标记的重组人类TDP-43得自ATGEN(Gyeonggi-do,South Korea)，并使用pCMVTnT构建体(Promega,Madison,WI)，通过与生物素-赖氨酰-tRNA偶联的转录/翻译，在兔网状细胞***中合成Flag标记的重组人类TDP-43。cPM,PM1和PM3肽523(具有/不具有FITC标记)得自NeoBiolab(Woburn,MA)或Biomatik(Wilmington,DE)，其中如所述，M1或M3基序、或者加扰M1或M3基序与人类免疫缺陷病毒TAT蛋白质的蛋白质转导结构域(YGRKKRRQRRR(SEQ IDNO:11))的524C-末端融合，从而增强肽的传递/渗透性。获得所有的化学药物(SigmaSt.Louis,MO)。

胚胎原代皮质神经元、HEK293细胞、原代人类成纤维细胞培养物530及转染

如之前所述，原代皮质神经元由E18Sprague Dawley大鼠(Harlan,Indianapolis,IN)分离，并具有修饰。简言之，在HBSS(Life Technologies,Grand Island,NY)中解剖大鼠的脑，并储存在补充2％B27(Life Technologies,Grand Island,NY)的Hibernate E(BrainBits,Springfield,IL)中。在解剖显微镜下，使用精细的镊子，将脑膜完整地取出，并解剖皮质。然后在室温(RT)下，将皮质在0.25％胰蛋白酶中消化15min，然后在补充10％FBS和50units/ml DNAse I(Worthington-biochem,Lakewood Township,NJ)的Opti-MEM(Life Technologies,Grand Island,NY)中短暂地温育。使用移液管通过温和的粉碎，将消化的皮质进一步分解，直至细胞悬液均匀并且没有大块组织保持可见。最后收集皮质神经元，并接种在聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白涂敷的盖玻片/腔室载玻片(BD,Franklin Lakes,NJ)、35mm的盘或者24孔板上，并如我们之前所述进行培养。使得自American Type CultureCollection(ATCC,Manassas,VA)的HEK-293T细胞在DMEM培养基(Life Technologies,Grand Island,NY)中在37℃下在湿式培养箱中在5％CO₂下生长，其中所述的培养基补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。由4名年龄匹配的正常受试对象和2名ALS患者(携带TDP-43突变)的原代人类成纤维细胞(仅2代可用)得自Coriell Institute for MedicalResearch (NINDS collection)。如上文所述，使原代成纤维细胞在包含非必需氨基酸和2mM谷氨酰胺的最低基础培养基(Life Technologies)中在37℃下在湿式培养箱中在5％CO₂下生长，其中所述的培养基补充有10％或15％(v/v)胎牛血清。对不含支原体污染的HEK293细胞和原代人类成纤维细胞进行测试。神经元均通过NeuroMag(OZ Biosciences,San Diego,CA)转染，而HEK293T细胞和原代成纤维细胞使用lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)根据制造商提供的说明书转染。就共转染而言，采用3:1(mitoDsRed2/TDP-43:GFP)的比例。

使用人类成纤维细胞生成iPSC并使iPSC分化成人类神经元

对于重编程和分化而言，将两代NHF和TDP-43G298S或A382T人类成纤维细胞在补充10％FBS(Life Technologies)和GlutaMAX(Life Technologies)的DMEM中培养。使用CytoTune-iPS 2.0Sendai Reprogramming Kit(Life Technologies)，根据制造商提供的说明性，使用经辐射的MEF(iMEF)作为供料细胞，将成纤维细胞重编程。将iPSC在hESC培养基(DMEM/F12)上的iMEF上常规培养，其中所述的培养基具有GlutaMAX(LifeTechnologies),10％KnockOut血清替代物(LifeTechnologies),0.1mM 2-巯基乙醇(LifeTechnologies),1×非必需氨基酸(Life Technologies),和10ng/ml bFGF(Sigma)。就分化而言，使iPSC适应于TeSR1E8培养基(Stem Cell Technologies)中的基底胶上的无供料条件并培养，再使用StemDiff Neural Induction Medium and AggreWell 800(both fromStem Cell Technologies)根据说明书使iPSC分化成诱导的神经元祖代细胞(iNPC)。使用神经丛簇选择培养基(Neural Rosette Selection Medium)选择iNPC，并使用神经祖代培养基(均得自Stem Cell Technologies)进一步扩增。就iPSC和iNPC的表征而言，如之前所述，使用针对TRA-1-81,Nanog,SSEA3和SSEA4的抗体，进行免疫荧光染色。就碱性磷酸酶(AP)染色而言，使用碱性磷酸酶染色试剂盒II(Stemgent)。使用Axol iNPCs分化和成熟试剂盒(Axol,Cambridgeshire,United Kingdom)，根据制造商提供的方案，使iNPC分化成人类神经元。简言之，将iNPC细胞首先接种于24或48孔平板、或者24孔海马平板(涂敷有处于Axol Plating-XF培养基中的AxolSureBondXF)上。在铺板后24小时，将细胞转移至神经元分化培养基(Axol Neuronal Differentiation-XF培养基)中。在72小时后，使用神经元成熟培养基(Axol Neuronal Maintenance-XF培养基)替换一半的神经元分化培养基，然后每四天更换一半的神经元成熟培养基。对研究中使用iPSC和iNPC进行测试，其中不含支原体污染。iPSC衍生的神经元也通过NeuroMag(OZ Biosciences,San Diego,CA)转染。

细胞和线粒体级份

如上文所述分离线粒体。简言之，将细胞在IB-1溶液(IB-1:225mM甘露醇,75mM蔗糖,0.1mM EGTA,20mM HEPES；pH＝7.4)中均化，而将组织在具有0.5％BSA的IB-1中均化。将总的均化产物(H)在4下在600g下两次17离心5min。随后，收集上清液(S1)，并在4下在7,000g下离心10min，从而得到富含线粒体IDE级份，并收集上清液(S2)。对于细胞线粒体，在IB-2溶液(225mM甘露醇,75mM蔗糖,20mM HEPES；pH＝7.4)中洗涤富含线粒体的级份，对于组织线粒体，在包含0.5％BSA的IB-2中洗涤，然后在9,000g下离心10min。将团状物悬浮于MRB缓冲剂(250mM Mannitol,0.5mM EGTA,5mM HEPES；pH 7.4)中，从而获得粗品线粒体级份(cM)。将粗品线粒体级份进一步覆盖在8ml Percoll培养基(225mM甘露醇,25mM HEPES,1mM EGTA和30％Percoll(vol/vol)；pH＝7.4)上，并在4下在95,000g下在SW40Ti转子中离心30min。将团状物再次悬浮于MRB缓冲剂中，然后在4下在6,300g下离心10min，从而获得纯化的线粒体(pM)。通过细胞核提取试剂(Thermo scientific,Waltham,MA)分离/纯化细胞核级份。对于亚线粒体区室级份而言，将分离的纯的线粒体悬浮于分离培养基(225mM甘露醇,75mM蔗糖,0.1mM EGTA,20mM HEPES；pH＝7.4)中，其中所述的培养基具有毛地黄皂苷(0.12mg毛地黄皂苷/mg线粒体)，并且在冰上温和地搅拌15min。然后使用3个体积的分离培养基稀释毛地黄皂苷处理的样品，并在9,000g下离心10min，从而得到上清液。然后，将团状物再次悬浮于分离缓冲剂中，并在冰上超声波处理30秒。然后对溶液进行超声波处理，并在6,500g下离心10min，随后在144,000g下离心60min，使内膜囊泡沉淀，并收集上清液作为基质级份。将上清液A在144,000g下离心60min，使外膜囊泡作为团状物沉淀，并收集上清液作为内膜空间级份。

突触体分离S

如所述，由小鼠皮质或脊髓分离突触体。简言之，将新鲜的皮质组织在冰冷的‘蔗糖培养基’(320mM蔗糖,1mM EDTA,0.25mM二硫苏糖醇,pH 7.4)中均化，然后在4下在1,000g下离心10min。收集上清液，并在15mL离心管中的不连续Percoll梯度(3mL层，在蔗糖培养基中3,10和23％Percoll)的顶部小心地形成上清液层，然后在4下在32,500g在SW-40Ti转子中离心10min。收集10％和23％Percoll之间的带，并稀释成离子培养基(20mM HEPES,10mMD-葡萄糖,1.2mM Na₂HPO₄,1mM MgCl₂,5mM NaHCO₃,5mM KCl,140mM NaCl,pH.7.4)，然后在4下在15,000g下离心15min，从而除去Percoll。收集团状物，即，突触体级份，并再次悬浮于离子培养基中，而且通过在4下在3,000g下离心30min接种于涂敷聚乙烯亚胺的平板上。通过突触标志物或EM的免疫印迹，证明突触体的纯度(数据未示出)。

线粒体功能和细胞活力测量

如我们上文所述，通过四甲基若丹明(TMRM)和/或若丹明123(rhod123)测定HEK293细胞、人类成纤维细胞、原代神经元或突触线粒体中的mΔψ。简言之，将在35mm 630盘或24孔平板中培养的HEK293细胞、人类成纤维细胞、原代神经元，或者附着在24孔平板(如之前所述预涂敷聚乙烯亚胺(50％溶液以1:15000稀释,Sigma))上的分离的突触体与PBS中的20nM TMRM或2μM rhod123(磷酸盐缓冲的生理盐水pH 7.4,Life Technologies,Grand Island,NY；用于HEK293细胞和人类成纤维细胞)、HEPES缓冲的Tyrode溶液(119mMNaCl,5mM KCl,6g/升D-葡萄糖,2mM CaCl2,2mM MgCl₂和25mM HEPES；pH 7.4；用于原代神经元)或离子培养基(用于突触线粒体)温育30min。除去包含TMRM/rhod123的溶液。在使用PBS、Tyrode或离子培养基洗涤三次后，将细胞/神经元/突触体在37℃下在PBS或Tyrode溶液中在室内空气下温育10min，可以替代TMRM/rhod123信号，然后通过荧光显微镜成像。如之前所述，使用细胞或神经元裂解物，通过ATP 18比色/荧光测试试剂盒(Biovision,Milpitas,CA)测量ATP水平。使用the Seahorse XF24 Analyzer(Seahorse Bioscience,North Billerica,MA)根据制造商提供的说明书，对活的培养的HEK293细胞、人类成纤维细胞和神经元(具有所示的最佳的接种密度)中的耗氧速率，或者突触体中突触线粒体的耗氧速率的实时测量。如果需要，依次注射ATP合成酶抑制剂寡霉素(1μM)，解偶联剂FCCP(4μM)，复合物I抑制剂抗霉素A(1μM)和鱼藤酮(1μM)。测量后，裂解细胞和突触体，并将OCR数据对总蛋白质归一化。通过细胞毒性检测试剂盒(LDH；Roche,Nutley,NJ)测量细胞死亡和活力，其中使用针对裂解的半胱天冬酶3染色或SYTOX绿色测试(Life Technologies,GrandIsland,NY)进行免疫荧光染色。对于SYTOX绿色死亡神经元染色而言，将神经元在室温下在包含30nM SYTOX绿色的PBS中温育20分钟，然后使用PBS洗涤三次。将SYTOX绿色阳性核和/或明显的碎片核/神经突的神经元计数为非活力的神经元，而不具有SYTOX绿色阳性核和清楚的核轮廓/神经突的神经元计数为活力的神经元。

线粒体输入测试

由小鼠的脑分离线粒体，同时通过将分离的线粒体与毛地黄皂苷(0.1mg/1mg线粒体蛋白质)在冰上温育15min、然后在11,000g下离心10min，制备丝状体。所用的输入缓冲剂由250mM蔗糖,10mM MOPS-KOH,pH7.2,80mM KCl,5mM MgCl₂,2mM ATP,2mM NADH,3％BSA组成。通过将线粒体或丝状体与所示的重组蛋白质在RT下温育45min进行输入测试。通过加入缬氨霉素(1μM)终止输入反应。根据需要，在RT下通过胰蛋白酶和/或毛地黄皂苷处理5min、然后在11,000g下离心10min，处理等体积的输入反应物。最后，将线粒体或丝状体团状物再次悬浮于补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Nutley,NJ)和苯甲基磺酰氟(PMSF,Sigma,St.Louis,MO)细胞裂解缓冲剂(Cell signaling,Danvers,MA)中。在输入过程中，线粒体蛋白质必需解折叠，表明网状细胞裂解物中伴侣的存在会在体外促进rTDP-43的输入。尽管rTDP-43输入可以通过脲变性增加(数据未示出)，但是网状细胞裂解物中产生的重组蛋白质也证明体外有效的输入。因此，在本研究中，我们使用未变性的重组蛋白质。

呼吸链复合物I至V的活性的测量

如所述，测量复合物I-IV的酶活性。简言之，在3轮冷冻和解冻之后，将分离的线粒体再次悬浮于总体积200μl的反应缓冲剂中。在加入鱼藤酮(2μg/ml)之前和之后5min，在340nm下在包含25mM磷酸钾,5mM MgCl₂,2.5mg/ml BSA,0.13mM NADH,2μg/ml抗霉素A,和65μM泛醌1的反应缓冲剂中测量复合物I(NADH:泛醌氧化还原酶)的活性。在600nm下在包含25mM磷酸钾,2.5mg/ml BSA,20mM琥珀酸钠,0.05mM DCPIP,2mM KCN,和65μM泛醌1的反应缓冲剂中，测量复合物II(琥珀酸盐:泛醌氧化还原酶)的活性。通过加入65μM泛醌1开始反应。在550nm下在包含25mM磷酸钾,2.5mg/ml BSA,2mM KCN,2μg/ml鱼藤酮,0.6mM n-十二烷基-b-D-麦芽糖苷,15μM细胞色素c和35μM泛醌2的反应缓冲剂中，测量复合物III(泛醌2:细胞色素c还原酶)。在550nm下在包含25mM磷酸钾,0.45mM n-十二烷基-b-D-麦芽糖苷和15μM细胞色素c.复合物IV活性的反应缓冲剂中，测量复合物IV(细胞色素c氧化酶)的活性。在包含40mM Tris-HCO3,10mM EGTA pH8.0,0.2mM NADH,2.5mM PEP,25μg/ml抗霉素A,0.5mg/mlLDH,0.5mg/ml PK和2.5mM ATP的测试缓冲剂中，测定复合物V(F1-ATP合成酶)的活性。在340nm下在吸光率改变后(由于NADH氧化)，测量复合物V的活性。

RNA免疫沉淀和RT-PCR/实时PCR

通过包含1X蛋白酶抑制剂混合物(Cell signaling,Danvers,MA)和100U/ml核糖核酸酶抑制剂(Life Technologies,Grand Island,NY)的免疫沉淀裂解缓冲剂(50mMTris,pH 7.4,250mM NaCl,5mM EDTA,50mM NaF,1mM Na3VO4,1％Nonidet P40(NP40)和0.02％NaN3)，首先裂解分离的线粒体。然后，将均化产物在4℃下在18,000g下离心30min。收集上清液，并在4℃下与TDP43抗体结合的磁珠过夜温育。然后使用裂解缓冲剂洗涤磁珠，并通过TRIzol试剂(Life Technologies,Grand Island,NY)提取RNA。通过TRIzol试剂(Life Technologies,Grand Island,NY)同样提取由HEK-293T细胞和人类脊髓组织得到的总的RNA。通过DNase I处理，除去mtDNA，并通过PCR证明。使用随机寡聚体引物，通过大容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies,Grand Island,NY)进行逆转录。使用SYBR绿色主混合物(Life Technologies,Grand Island,NY)，使用合适的引物对，在StepOnePlus***上进行所有线粒体转录物的qRT-PCR分析。对于所用的引物，参见表1(A8/ND4L没有特意测量和扩增，因为它们的序列较短)。

在HEK293细胞中线粒体新生蛋白质的合成

将表达Flag标记的TDP-43的HEK293细胞在不具有甲硫氨酸的DMEM培养基(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中培养1h，然后使用0.1mg/ml依米丁预处理10min，并与1mg/ml依米丁和L-叠氮高丙氨酸(AHA,Life Technologies,Grand Island,NY)共处理4h。在脉冲标记后，收获细胞，然后进行线粒体分级。使用处于50mM Tris-HCl,pH8.0中的1％SDS裂解分离的线粒体，然后在10,000g下离心10min。将上清液与亲和素-dynabead(LifeTechnologies,Grand Island,NY)在RT下温育30min。在除去磁珠后，对上清液进行Click-it测试(Life Technologies,Grand Island,NY)。简言之，使用PEG4-氨甲酰-6-叠氮己基-生物素在160μL体积的***中标记200μg线粒体蛋白质，并通过甲醇和氯仿沉淀和提取总的蛋白质。在18,000g下离心5min后，收集总的蛋白质团状物，并在50mM Tris-HCl中通过1％SDS溶解，用于蛋白质印迹。

线粒体核糖体的分级以及它们在RNA上的加载

将分离的吸纳立体在裂解缓冲剂(260mM蔗糖,100mM KCl,20mM MgCl₂,10mMTris-Cl pH 7.5,1％Triton X-100,5mMβ-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂)中在冰上裂解20min。将裂解物在4℃下在9,400g下离心30min。然后，将上清液加载至11ml 10％–30％连续的线性蔗糖梯度(50mM Tris-Cl,100mM KCl,10mM MgCl₂)中，并在Beckman SW41-Ti转子中在4℃在20,400rpm下离心15小时。离心后，由顶部收集13个级份，并用于进一步的免疫印迹和732qRT-PCR分析。

蓝色非变性PAGE和免疫印迹分析

使用非变性NativePAGE Bis-Tris凝胶***(Life Technologies,Grand Island,NY)进行蓝色非变性凝胶电泳。简言之，将包含10μg线粒体蛋白质的分离的线粒体再次悬浮于样品缓冲剂中，并使用2％毛地黄皂苷(Sigma)在冰上溶解30min。通过在18,000g下离心30min除去未溶解的团状物。收集上清液，并加入5％G-250样品添加剂。将样品加载至3–12％预制Bis-Tris梯度凝胶(Life Technologies,Grand Island,NY)中，然后使用浅蓝色运行缓冲剂在4℃下在40V电压下电泳。对于规则的免疫印迹分析而言，使用细胞裂解缓冲剂(Cell signaling,Danvers,MA)，加上1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Nutley,NJ)，裂解细胞或组织。等量的总的蛋白质提取物通过SDS-PAGE分离，并转移至Immobilon-P(Millipore,Billerica,MA)。在使用10％脱脂奶粉阻断后，如之前所述，施加一级和二级抗体，并使用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore,Billerica,MA)将印迹显色。由6名年龄匹配的正常人和8名sALS患者得到的冷冻的人类胸廓脊髓组织得自NICHD Brain and Tissue Bank(表1)。

RNA-蛋白质体外结合测试

ND3RNA和突变体ND3RNA探针购自GenScript(Piscataway,NJ)。在包含1μM RNA探针的20μL反应物中实施RNA-蛋白质的结合。结合条件为10mM Tris pH 7.5,10mM HEPES pH7.5,20mM KCl,2mM MgCl₂,1.5mM DTT,5％甘油。在RT下温育30min后，将样品在100V下在冰冷的水浴中在包含0.5×TBE的预先电泳的6％聚丙烯酰胺凝胶上运行。在RT下通过SYBR绿色溶液(Life Technologies,Grand Island,NY)将凝胶染色20min。然后使用水将染色的凝胶漂洗三次，并通过EpiChemi II Darkroom(UVP,Upland,CA)观察。

慢病毒的生产、立体定位注射和冷冻切片

使用PerFectin(Genlantis,San Diego,CA)，用双顺反子慢病毒构建体和两个辅助质粒、以及1.5μg DNA/10cm平板转染Lenti-X 293T细胞(Clontech,Mountain View,CA)，其中所述的两个辅助质粒为：6μg PCMV-dR8.2和4.5μg PCMV-VSVG。在转染后48h，将培养基在780g下离心30min，并在0.45μm孔径下过滤。将过滤的培养基进一步覆盖在20％蔗糖的顶部，然后在Beckman SW-28转子中在90,000g下离心2h。收集团状物，并再次悬浮于PBS或生理盐水中。就病毒注射而言，使用阿佛丁(250mg/kg)麻醉小鼠，并将其置于立体定位框中。形成小切口，从而暴露颅骨表面。在覆盖运动皮质区域(AP/前-后轴:1mm；ML/内侧-外侧:1mm)的颅骨中钻孔。将充满病毒的针下降0.7mm(DV/腹-背轴)，并在5min内注射2μl病毒(109病毒颗粒/ml)。将针原位放置5min，然后缓慢撤出。缝合皮肤，并使小鼠在温暖的垫上恢复。在注射后一周，使用阿佛丁深度麻醉小鼠，并经心灌注冷的PBS。在24h内，将脑固定在多聚甲醛(4％)中，然后在30％蔗糖中再次固定24h。在冻存后，切取20μm厚的脑的冠状部分，用于免疫染色。

体内给予TAT-肽

根据NIH指导原则实施小鼠手术/过程，并且在Case Western ReserveUniversity经过Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准。C57BL/6非转基因野生型小鼠(NTG小鼠),Prnp-TARDBP小鼠(TDP-43WT Tg小鼠)和Prnp-TARDBP*A315T小鼠(TDP-43 A315T Tg小鼠)购自the Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。使用微量渗透泵(Alzet Model 2004,Cupertino,CA；流速0.25μl/小时)皮下灌输小鼠。在移植前一天，使用包含cPM或PM1肽的200μl PBS(0.5mg/kg/天)充满微量渗透泵，然后根据制造商提供的说明书，在PBS中在37下过夜泵温育。就手术而言，使用阿佛丁麻醉雄性小鼠。在小鼠的背部形成小切口，并皮下植入微量渗透泵。在处理后，使用阿佛丁深度麻醉小鼠，并经心灌注冷的PBS，收集脊髓和脑组织，然后进行分级、蛋白质印迹或免疫染色。

运动行为评估

使用Panlab RotaRods(Harvard Apparatus,Holliston,MA)，旋转测试用于测试小鼠的运动协调性和平衡性。简言之，首先小鼠接受训练，每天3次试验，持续3天(4-12rpm，少于3分子，并且试验之间至少10分子间隔)。在本研究中使用的所有小鼠在训练后都达到稳定的旋转能力(数据未示出)。在训练后三天，以加速方式(4-40rpm，超过5分钟)，每周三次，测试小鼠。所有的旋转测试均是对不同的基因型、并在至少5分钟时间间隔下实施的，并且分开布置以避免休息。使用定制的跑道实施足迹分析，其中所述的跑道长50cm，宽5cm并且两侧形成边界。将小鼠的前肢和后肢首先浸渍在红色和蓝色的非毒性颜料中。随后，将小鼠放置在覆盖白纸的跑道上，并跑进封闭的黑盒子中。坐着的小鼠的足迹不包含在定量中。步长为每步之间向前移动的平均距离，而步宽长度为左右前肢或后肢之间的平均距离。

共聚焦显微镜、荧光显微镜和电子显微镜

在RT下使用Zeiss LSM 510倒置激光扫描共聚焦荧光显微镜(通过Zeiss LSM 510共聚焦软件控制,Zeiss)捕获所有的共聚焦图像，其中所述的荧光显微镜装配有C-Apochromat 40X/1.2W水浸物镜或αPlan-Fluar100x/1.45油浸物镜，如之前_ENREF_3771中所述。使用由HeNe激光器发出的633nm激发光和650nm长通滤波器收集远红外荧光的共聚焦图像；使用由氩激光器发出的543nm激发光和560nm长通滤波器收集红色荧光的图像；并且使用由氩激光器发出的488nm激发光和500–550nm带通屏障滤波器收集绿色荧光图像。

对于TMRM,Rhod123和SYTOX绿色的延时成像或瑰色荧光成像而言，将细胞或神经元接种于35mm盘或24孔平板上，并且使用mito-DsRed2或所示的质粒感染/转染。通过倒置Leica DMI6000荧光显微镜(Leica)(通过Leica LAS AF 3软件控制)将细胞或神经元成像，其中所述的荧光显微镜装配有20X/0.7NA Plan Apochromat干燥物镜，并且良好地装配有具有受控的CO2含量、湿度和温度(37℃)的环境室。使用最低的强度捕获图像，从而避免光漂白或信号过饱和。在延时成像过程中，在不具有光毒性或光漂白下，在至少1h内每10s捕获多个框。对于免疫-EM而言，将活组织检查的人类脑组织、细胞和分离的线粒体在RT下在0.1M HEPES缓冲剂(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)中包含0.1％w/v戊二醛的4％w/v甲醛固定45分钟，然后在乙醇中脱水并包埋在LR White树脂(Polysciences,Inc.,Warrington,PA)中。根据Fujioka等人所述的方法，实施免疫-金标记的过程。使用包含1％w/v牛血清白蛋白(BSA),1％v/v正常山羊血清和0.01％v/v Tween 20(PBGT)的PBS封闭薄的切片。然后，在4℃下将栅格与抗体(抗Flag或抗TDP-43)在1:10～1:30稀释下在PBGT中温育12h。阴性对照包含正常兔血清、正常小鼠血清和替换的PBT作为一级抗体。在洗涤后，将栅格在PBGT中的10nm金缀合的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(British BioCellInternational,Ted Pella,Inc.,Redding,CA)(以1:20稀释)中温育1.5h，使用PBS漂洗，并与戊二醛固定，从而稳定金颗粒。首先使用2％酸化的醋酸铀在38℃下将金标记的薄切片染色30min，然后使用Sato的三重铅染色(如Hanaichi等人所修改)，接着在FEI TecnaiSpirit(T12)中使用Gatan US4000 4kx4k CCD检测。对于规则EM而言，将样品新鲜切片，并如之前所述，处理用于透射电子显微镜：将小块的组织或分离的线粒体通过浸渍于三重醛-DMSO中进行固定。在蒸馏水中漂洗后，将它们后固定于亚铁氰化物-还原的四氧化锇中。再一次水漂洗后，在酸化的醋酸铀中过夜浸泡。在蒸馏水中再次漂洗后，将组织块在浓度升高的乙醇中脱水，通过环氧丙烷并包埋于Poly/Bed树脂中。将薄切片依次使用酸化的醋酸铀染色，然后进行Sato三重铅染色进行修饰，并在具有Gatan US4000 4kx4k CCD的FEITecnai Spirit(T12)中检测。

图像分析

还使用开源图像分析程序WCIF ImageJ(developed by W.Rasband)实施图像分析。使用“3D Viewer”插件再次构建3D图像。使用“RGB Profiler Plot”插件实施线扫描分析。简言之，将原始的共聚焦图像进行背景校正。使用“2”宽度的直线画下所关注的区域。然后，通过在“插件”菜单下，选择ImageJ plugin Graphics’s“RGB Profiler Plot”，直接分析所述的线。在“RGB Profiler”的输出中，将数据输入Microsoft Excel中。在x轴上绘制线的长度，同时在y轴上绘制强度。如所述，使用“MultipleKymograph”进行线粒体移动的波动曲线记录和定量(http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html)。对成纤维细胞和HEK293细胞中的线粒体的形态学进行定量。简言之，对原始图像的多焦面(z-stack)的单一平面或系列平均进行背景校正，线性对比优化，使用7×7‘top hat’滤波器，并经过3×3中值滤波器，然后阈值化，从而形成二值化图像。在二值化图像中良好地区分多数的线粒体，并且大簇的线粒体被自动排除。通过Image J进一步分析所有的二值化图像。通过ImageJ均直接分析神经元或EM显微照片中的线粒体形态学。

统计学分析

使用单因素方差分析(ANOVA)，然后通过Tukey’s 870多重比较测试或student-t检验，进行统计学分析。数据为平均值±s.e.m。n表示每个试验871个神经元、细胞或小鼠的数量。认为p<0.05具有统计学意义。ns，无意义。所有的统计学分析是以盲态方式进行的。

结果

在ALS和FTD中，TDP-43在线粒体中的累积

在由ALS病例和年龄匹配的正常个体得到的脊髓人类组织样品中，以及由FTD病例和年龄匹配的正常个体得到的额皮质中，我们首先研究TDP-43与多种细胞细胞器在神经元中的共同定位。在对照病例中，脊髓运动神经元和皮质神经元主要证明核TDP-43定位，然而，ALS运动神经元和FTD皮质神经元显示特征性4增高的细胞质TDP-43累积(图1A-D)。值得注意的是，在ALS患者的许多脊髓运动神经元中和/或FTD患者的皮质神经元中，细胞质TDP-43与线粒体标志物明显以相似的分布图案共同定位(图1A-D)，但是很少与高尔基体、内质网、溶酶体、自噬体、内涵体或过氧化物酶体的标志物重叠。尽管在对照人类运动神经元和皮质神经元中，细胞质TDP-43具有较低的丰度，但是细胞质TDP-43也明显地与线粒体共同定位(图1A-D)。

我们由人类脊髓和皮质组织进一步分离高度纯化的线粒体，以及保护膜，发现TDP-43存在于得自所有样品的线粒体中(图1E,F)。如所预计的那样，得自ALS或FTD的线粒体中，具有明显高于得自年龄匹配的对照的TDP-43的表达。这些纯化线粒体的随后亚线粒体级份分析表明，线粒体TDP-43专门存在于线粒体内膜(IMM)级份中，但是不存在于线粒体外膜(OMM)、膜间腔(IMS)或基质中(图1G,H)。与此一致的是，纯化线粒体以及活组织检查的人类皮质的进一步免疫电子显微镜(免疫-EM)分析证明，TDP-43主要定位于IMM嵴(图1I)中。由ALS脊髓或FTD皮质得到的分离的线粒体展现出比得自年龄匹配的对照更高的TDP-43标记，这是可预计的。不可避免的死后延迟影响了人类组织的整体性，使得难以对IMM中的TDP-43进行进一步的生物化学表征。如补充方法那样，我们由新鲜收集的小鼠脊髓和皮质组织样品得到线粒体，并使用胰蛋白酶和毛地黄皂苷处理它们，从而渗透OMM但是不渗透IMM。OMM-蛋白质Mfn2/Mff单独地由胰蛋白酶消化，朝向IMS的IMM蛋白质Tim23/OPA1在OMM渗透后被胰蛋白酶消化，而TDP-43或朝向基质的IMM蛋白质COXIV/F1β在所有这些情况下均保持未改变。如同COXIV/F1β，TDP-43在通过triton X-100完全膜渗透后，被胰蛋白酶消化。由于TDP-43同样专门保留在小鼠线粒体的IMM级份中，所以这些结果表明TDP-43定位于IMM朝向基质的小叶(leaflet)中。

ALS相关突变增加TDP-43线粒体定位

接着，我们测定TDP-43中疾病相关突变是否影响其线粒体定位。为了排除与过表达有关的潜在副作用并且还使我们的发现与患者直接相关，我们首先检测由原代人类成纤维细胞分离得到的线粒体中TDP-43的表达，其中所述的原代人类成纤维细胞衍生自携带TDP-43突变G293S或A382T(G298S或A382T成纤维细胞)的ALS患者以及年龄匹配的正常人类个体(正常人类成纤维细胞，NHF)。G298S和A382T成纤维细胞中TDP-43突变通过基因组DNA测序证明。在G298S和A382T成纤维细胞中未观察到TDP-43错误定位。尽管携带TDP-43突变的所有成纤维细胞均显示相当大量的表达总TDP-43，但是G298S和A382T成纤维细胞证明线粒体TDP-43水平明显高于NHF(图2A)，表明通过疾病相关的突变，增加的TDP-43线粒体定位。为了证实这些发现，我们比较在培养的HEK293细胞或小鼠脑和脊髓的组织样品中WT和突变体TDP-43线粒体定位，其中所述的脑和脊髓得自过表达WT或突变体人类TDP-43的半合子转基因小鼠。与此一致的是，尽管在总的裂解物中相似的表达水平，但是外源表达的人类TDP-43G298S,A315T或A382T显示与人类WT TDP-43相比，在线粒体中的表达一致的增加(图2B,C，线粒体TDP-43表达通过总TDP-43和线粒体标志物COXIV调节)。外源表达的或内源的人类WT和突变体TDP-43仍存在于IMM级份中(图2D,E)，并且在IMM渗透后可以被胰蛋白酶消化，但是在OMM渗透后不能消化(数据未示出)，表明疾病相关的突变对TDP-43的亚线粒体定位不具有影响。

为了排除核TDP-43的可能的干扰，我们进一步试图使用Flag标记的重组WT/突变体人类TDP-43蛋白质(rTDP-43)和由小鼠的脑分离的线粒体在不含细胞的线粒体输入测试中证明这些发现。所有人类rTDP-43都是可溶解的、未切割的并且是翻译后未修饰的(数据未示出)。广泛使用的生物素标记的重组F1β前体蛋白质(pF1β)作为阳性对照被包含在内，而重组GFP用作阴性对照(数据未示出)。pF1β包含可切割的信号序列，其在输入后被切割，从而生成较短的mF1β(图2F，右侧面板)，表明在分离的线粒体中的完整输入机器。与mF1β类似，WT rTDP-43在输入后存活于毛地黄皂苷/胰蛋白酶的共处理(图2F，左侧面板)，证明在体外成功地输入IMM的内部。如所预计的那样，与WT rTDP-43相比，携带G298S,A315T或A382T的rTDP-43证明输入效率增高(图2G)。被输入至内部的WT/突变体rTDP-43在tritonX-100渗透后被胰蛋白酶完整消化(数据未示出)。进一步的免疫-EM分析证明输入的WT/突变体rTDP-43的主要的IMM嵴定位，以及通过疾病相关突变的增加的rTDP-43输入(图2H)。总之，这些观察表明ALS突变增加TDP-43线粒体定位。

TDP-43线粒体定位取决于内部基序

线粒体蛋白质通过可切割的前导序列或不可切割的内部信号被导向线粒体。TDP-43在输入后保持未切割的，并且通过TargetPor Mitoprot未鉴定TDP-43中可切割的前导序列，表明TDP-43可以使用内部信号。线粒体内部信号通常由一连串连续的疏水性氨基酸组成，并且六个这种连串的序列存在于TDP-43中(图3A,M1-6)。M1/3/5(ΔM1/3/5)删除在体外显著抑制rTDP-43的输入，并且减少外源表达的TDP-43的线粒体定位(图3B,C)。由于M1和M3链段在跨越物种之间是保守的，所以随后我们合成两种肽PM1(YGRKKRRQRRRAQFPGACGL(SEQID NO:15))和PM3(YGRKKRRQRRRSKGFGFVRF(SEQ ID NO:16))，其中M1或M3基序与TAT肽(YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:11))融合，以增强渗透性。PM1和PM3大量抑制rTDP-43的输入，但是对照肽cPM(YGRKKRRQRRRAAQGFGCPL(SEQ ID NO:18)和YGRKKRRQRRRGRFFKSFG(SEQ IDNO:19)的混合物，分别与TAT融合的加扰M1和M3)不抑制，并减少HEK293细胞和原代神经元中的线粒体TDP-43(图3D-F)。M3和M5、特别是M1与不相关的胞质蛋白GFP(绿色荧光蛋白)融合足以促进其线粒体靶向(图3G)。基于其他的事实：M1、M3或M5删除对核、胞质蛋白和总TDP-43的表达不具有影响(图3C)，则M1、M3或M5删除不会导致TDP-43聚集/错误定位/切割(数据未示出)，并且PM1或PM3对pF1β输入不具有影响(图3D)，我们得出结论M1、M3和M5对于TDP-43线粒体定位而言是208重要的内部基序。、

线粒体中WT/突变体TDP-43优选地结合线粒体转录的ND3/6 mRNA并抑制它们的翻 译

TDP-43主要结合mRNA。TDP-43的IMM停留促进我们检测TDP-43是否结合线粒体转录的mRNA(图4A)。使用小鼠脑的线粒体的RNA免疫沉淀(IP)(使用或不使用现有技术的交联)发现，TDP-43显著下拉ND3,ND5,ND6,COXI,COXIII,Cyt b和A6 mRNA，但是缺乏RNA结合结构域的阴性对照COXIV不能(数据未示出)，而其他mRNA仅稍微富集，其水平相当于12s或16s rRNA(图4B)。为了研究ALS突变是否改变TDP-43与其靶物结合，我们由G298S/A382T成纤维细胞或表达人类TDP-43G298S,A315T或A382T的HEK293细胞分离线粒体。惊人的是，所有突变体TDP-43均以与WT TDP-43相当的丰度沉淀相似的mRNA(图4C,D)。

线粒体转录的mRNA水平不受TDP-43影响，表明在线粒体转录中不可能涉及TDP-43。由于TDP-43的高的转染效率以及适用于线粒体分离和下游生物化学分析的简单的培养方法，随后我们通过叠氮高丙氨酸(AHA)引入测试研究在依米丁(阻断胞质蛋白翻译)存在下，在HEK293细胞中TDP-43对线粒体翻译的影响。通过WT TDP-43过表达，最显著地减少ND3和ND6的合成(图4E)，这符合TDP-43最优选地结合它们的mRNA。ND3和ND6的稳定状态的水平实际上通过WT TDP-43减少(图4F)，但是氧化磷酸化(OXPHOS)复合物的大部分线粒体编码的亚基未减少，并且在ND3和ND6的合成或表达中，WT TDP-43诱导的减少可以通过M1耗尽来阻断。在试图研究线粒体TDP-43如何调节ND3和ND6的翻译中，我们研究线粒体的核糖体组装，以及通过线粒体的蔗糖梯度离心在ND3和ND6 mRNA上的加载，其中所述的线粒体是由表达TDP-43WT或ΔM1的HEK293细胞分离得到的。TDP-43对所有线粒体编码的蛋白质的翻译不具有整体性的影响(图4E,F)。不足为奇的是，在蔗糖梯度中MRPS18B和MRPL44(线粒体核糖体28S/39S亚基标志物)的沉降图案在所有样品中都是相似的，表明未改变的整体的线粒体核糖体组装。然而，进一步的RNA分布分析发现，与对照细胞中55S核糖体复合物的大部分沉降相反，ND3和ND6证明在TDP-43后WT 28S和55S复合物的另外的峰(ΔM1未过表达)，但是COXI mRNA不具有，表明核糖体错误加载在ND3和ND6 mRNA上。

为了研究突变体TDP-43对ND3和ND6表达的影响，我们检测表达TDP-43G298S,A315T或A382T的HEK293细胞和人类G298S或A382T成纤维细胞。与WT TDP-43相比，所有的突变体TDP-43导致ND3和ND6的进一步减少或减少表达(图4F,G)。值得注意的是，删除M1或使用PM1处理会将ND3和ND6增加至与对照细胞或NHF相似的表达水平。在本研究中，未测试PM3，这是因为M3定位于TDP-43RNA结合基序中(图3A)，并且PM3对细胞具有温和的毒性作用(数据未示出)。与此一致的是，由年龄匹配的正常个体得到的人类组织样品相比，由ALS病例得到的脊髓人类组织样品或由FTD病例得到的额皮质人类组织样品显示ND3和ND6表达减少(图4H)，因此进一步扩展我们对疾病的发现。

线粒体中WT/突变体TDP-43损害OXPHOS复合物I和线粒体生物能学

与TDP-43对复合物I亚基ND3和ND6表达的特异性抑制一致，过表达WT TDP-43的HEK293细胞显示OXPHOS复合物I最显著的损失和功能障碍，以及由构成复合物I的OXPHOS亚复合物的轻微分解，其作用被疾病相关的突变G298S,A315T或A382T显著加剧，但被M1耗尽显著抑制(图5A,B)。如所预计的那样，OXPHOS复合物1的分解和功能障碍在患者衍生的G298S或A382T成纤维细胞中得以缓解，并且PM1处理将OXPHOS复合物I组装和功能恢复至与NHF相当的水平(图5C,D)。有趣的是，TDP-43诱导的复合物1的分解和功能障碍还可以通过ND3和ND6的同时过表达而极大地减轻，但是单独的ND3或ND6不能(图5E)，进一步支持ND3和ND6在线粒体中作为TDP-43的特异性靶物。

复合物I对于OXPHOS27是重要的。如所预计的那样，在过表达WT或突变体TDP-43的HEK293细胞中以及患者G298S或A382T成纤维细胞中，均观察到明显的线粒体功能障碍，包括线粒体膜电势降(mΔψ)低、耗氧速率(OCR)和ATP水平，并伴有线粒体片段(图5F,G)。与WTTDP-43相比，突变体TDP-43在HEK293细胞中导致更严重的线粒体异常。不足为奇的是，在HEK293细胞和人类成纤维细胞中，WT和/或突变体TDP-43诱导的线粒体功能障碍和片段可以通过M1删除或PM1处理完全抑制。值得注意的是，尽管未观察到基底细胞死亡，但是患者衍生的G298S或A382成纤维细胞与NHF相比，显示明显升高的易受氧化应激的影响，其也可以通过PM1处理消除(图5H)。TDP-43线粒体定位的抑制会在体外和体内阻断WT/突变体TDP-43神经元毒性。最终，我们试图测定TDP-43线粒体定位是否有助于其对神经元的毒性。在体外培养的大鼠原代神经元中，WT TDP-43过表达在神经元死亡之前得到线粒体片段和功能障碍(降低的mΔψ/OCR/ATP)，所有这些都是通过G298S,A315T或A382T加剧，但是通过M1删除或PM处理而完全消除。为了证实这些发现，我们重新编程NHF和人类A382T成纤维细胞，形成诱导的多能干细胞(iPSC)，然后依次分化成减少的神经元祖细胞(iNPC)和人类神经元(分别为对照人类神经元和A382T人类神经元)对照人类神经元和A382T人类神经元在TDP-43核定位、神经元形态学和活力方面不同。然而，与对照人类神经元相比，A382T人类神经元显示显著的线粒体片段/功能障碍，以及增加的易受氧化应激的影响，其可以通过PM1处理减轻。如所预计的那样，与在大鼠原代神经元中观察的相似，TDP-43WT或A315T在iPSC衍生的对照人类神经元中过表达也导致线粒体异常和神经元死亡，并且删除M1足以消除TDP-43诱导的线粒体和神经元毒性。

为了在体内证明我们的发现，我们将编码TDP-43和mitoDsRed2的神经元特异性双顺反子慢病毒立体定位注射至小鼠皮质中(图6A)。与WTTDP-43相比，TDP-43 A315T过表达进一步导致线粒体的片段，以及数量增加的切割的半胱天冬酶-3阳性神经元(反应神经元死亡)，其可以通过M1删除而阻断(图6B,C)。尽管关于TDP-43 A315T转基因小鼠是否发展类ALS表现型存在争议，但是在TDP-43 A315T半合子转基因小鼠中已经一致地报告神经退行性和神经病理学，但是在TDP-43WT半合子转基因小鼠中未报告，即使它们展现相似的人类TDP-43表达(图2C)。我们通过连续的皮下灌输，使用PM1处理TDP-43 A315T小鼠，并证明PM1到达中枢神经细胞，并大幅减少线粒体中的突变体TDP-43。由于TAT能够使肽横跨线粒体双层膜，所有在所有的线粒体区室中都可以检测到PM1，这是可以预计的。TDP-43 A315T小鼠证明显著减少的ND3和ND6的表达，线粒体片段和功能障碍(降低的mΔψ/OCR和复合物I分解)，运动神经元损失和轴突退行性病变，神经病理学(内含物和星形胶质细胞激活)，损伤后神经肌肉接头(NMJ)，步态异常以及损伤的运动协调性/平衡性，所有这些都可以通过PM1减轻并且恢复至与非转基因(NTG)小鼠相当的水平(图6D-J)。删除M1对TDP-43半衰期、二聚化或其与非线粒体mRNA靶物的结合不具有影响。而且，M1并未定位于任何已知的功能结构域中(图3A)。此外，M1删除或PM1处理对胞质蛋白、核或总TDP-43不具有显著的影响(图3C-F)。总之，所有这些数据表明线粒体定位是WT和突变体TDP-43对神经元的毒性的重要决定因素。

实施例2

在本实施例中，我们对成年半合子TDP-43M337V Tg小鼠进行一系列的运动协调性和认知测试。基于实施例1，其鉴定线粒体为TDP-43诱导的神经毒性的直接媒介物，我们进一步测试突变体TDP-43线粒体定位的抑制在年龄匹配的半合子TDP-43M337V Tg小鼠中在疾病发作后是否逆转运动协调性和认知缺陷。

材料和方法

动物和处理

根据NIH指导原则实施小鼠手术/过程，并且在Case Western ReserveUniversity经过the Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准。C57BL/6非转基因野生型C57BL/6小鼠(NTG小鼠)和C57BL/6-Tg(Prnp-TARDBP*M337V)4Ptrc/J(hTDP-43M337V转基因小鼠,库存号No.#017604)购自the Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)，并保持在Case Western Reserve University。在出生后30天所有的小鼠断奶，并通过PCR分析由刺穿的耳朵提取的DNA进行基因分型。用于各试验的详细的小鼠年龄和性别信息呈现在具体的图例中。对于肽融合而言，使用包含SC或PM1肽(0.5mg/kg/天)的200μl PBS充满微量渗透泵(Alzet Model 2006,Cupertino,CA；流速为0.15μl/小时)，然后根据制造商提供的说明书，在PBS中在37℃下过夜泵温育。当使用阿佛丁完全麻醉小鼠时，在小鼠的背部皮下植入微量渗透泵。在处理后六周，使用冰冷的PBS经心灌注小鼠，并收集脑和脊髓组织。

行为测试

在使用/未使用肽灌注处理的小鼠中，实施用于研究感觉运动和认知能力的一系列行为测试。将由两个独立的但是年龄匹配的队列组得到的结果结合。成套测试由运动任务(旷场测试)、肌体协调任务(旋转和平衡木行走测试)、肌肉强度(握力强度测试)、触觉任务(粘纸测试)和记忆任务(用于行走记忆的Y-迷宫、用于短期空间记忆的T-迷宫、用于短期和长期非空间记忆的目标辨别以及用于情感记忆的恐惧条件)。按照以下顺序，在各种测试当天对这些行为任务测试个体小鼠：第1天，旋转和握力强度测试；第2天，旷场测试和平衡木行走测试；第3天，Y-迷宫；第4-5天，粘纸测试和目标辨别测试；第6天，T-迷宫；以及第7-8天，恐惧条件测试。所有测试都是在the Case Behavior core进行的，并且研究者对于小鼠基因型和处理组都是双盲的。

旋转测试

旋转棒(Panlab/Harvard Apparatus,Holliston,MA)用于测量运动协调性和平衡性。每只小鼠首先接受3个试验/天，持续3天。在训练期间，每只小鼠都被放置在旋转杆上，而每个试验，转筒速度由4rpm逐渐增加至12rpm。在测试当天，将旋转杆设定成加速模式(4-40rpm，经过5分钟)，并收集至跌落时的最大潜伏期用于统计学分析。

握力强度测试

通过GRIP STRENGTH TEST计量仪(Bioseb,Vitrolles,France)测量小鼠的肌肉强度。对于前肢测试而言，将小鼠的两只前爪放在杠(bar)上，并且将小鼠尾拉回。对于后肢而言，将两只前爪放在栅格上，该栅格由测试者的左右保持住，并且将小鼠的两只后爪放在与机器连接的杠上。将单次最佳纪录值用于统计学分析。

旷场测试

旷场由50cm长的正方形塑料装置构成，由50cm高的墙封闭，并使用ANY-迷宫视频跟踪软件(Stoelting Co.Wood Dale,IL)记录活性。使用ANY-迷宫软件，将旷场数字分割成内部区域(30cm x 30cm)和外周(10cm宽的走廊)。10分钟内连续收集数据，并全部记录经过的距离(m)、速度(m/秒)、固定不动时耗费的时间(超过2sec未移动)、以及在内部区域中花费的时间，并自动评分。

平衡木行走测试

通过测量小鼠穿过一系列分等级的狭窄的平衡木到达封闭的安全平台的能力，来评估小鼠的运动协调性和平衡性。平衡木由长木条(50cm)组成，并具有16mm圆直径，或者16或9mm正方形截面。在训练过程中，将小鼠放置在16mm圆形平衡木的开始出，并训练穿过平衡木到达封闭的盒。一旦小鼠经过训练(在<20sec内穿过16mm圆形平衡木)，在各种情况(由16mm圆形平衡木、16mm正方形平衡木至9mm正方形平衡木)下，在各平衡木上，它们接受两次连续的试验。小鼠可以至多60sec穿过各平衡木。各试验中记录穿过各平衡木的潜伏期和前足和后足滑落各平衡木的次数。

Y-迷宫测试

为了研究小鼠的短期特殊记忆，将小鼠放置于树脂玻璃T-迷宫(具有60cm的臂长)中，并使它们自由探索迷宫8min，同时封闭一个臂。封闭的臂在动物之间转换，以避免任何臂的偏爱(抵消的)。在8min探索后，小鼠返回至它们的饲养笼2h，然后将它们放回T-迷宫5min，此时，所有三个臂均开放。一旦小鼠被放入T-迷宫中，便使用ANY-迷宫跟踪***记录小鼠，并且计数在之前封闭的臂中的时间和频率、以及进入臂的总数量。

T-迷宫测试

为了研究小鼠的短期特殊记忆，将小鼠放置于树脂玻璃T-迷宫(具有60cm的臂长)中，并使它们自由探索迷宫10min，同时封闭一个臂。封闭的臂在动物之间转换，以避免任何臂的偏爱(抵消的)。在10min探索后，小鼠返回至它们的饲养笼2h，然后将它们放回T-迷宫，此时，所有三个臂均开放。一旦小鼠被放入T-迷宫中，便使用ANY-迷宫跟踪***(Stoelting,Wood Dale,IL)记录小鼠，并且使用视频评分软件计数在之前封闭的臂中的时间和频率、以及进入臂的总数量。

目标辨别测试

这种辨别记忆的任务使用以下事实：动物花费更多的时间探索新的目标(与它们熟悉的目标相比)。测试装置为具有垫底材料的规则的饲养笼。将各小鼠放置于规则的饲养笼中3min。然后，将两个相同的目标防止在饲养笼的角落(T1)。使小鼠研究这些目标5min。然后为1.5hr的延迟，在这段时间内，使动物返回至具有它们的同笼同伴的饲养笼中。在延迟后，对动物实施5分钟不同的刺激期间(T2,短期记忆)。在该期间，在T1呈现的目标和不熟悉的另一个目标被放置在测试笼中。然后，使小鼠返回至它们的饲养笼，24小时后，实施第三个期间(T3，长期以及)。在该5min期间内，在T1和T2呈现的目标和不熟悉的另一个目标被放置在测试笼中。所述的目标由硬质塑料制成和/或表观不同形状的金属制成。使用全自动化ANY-迷宫视频跟踪软件，记录并评分闻和接触各目标所花费的时间总量。还测量在5min过程中以及待在笼的远端的过程中(不动)所经过的总距离。

恐惧条件测试

所有的动物都被放置在条件盒(Med Associates,Burlington,VT)中，并训练熟悉声调(白噪声,80Db,30s,条件刺激(CS))以及电振动(0.5Ma,1s,非条件刺激(US))。该过程重复四次，累积120sec，并且刺激间间隔60sec。声调和振动同时结束。在试验结束时，取出动物并在24h后放回盒中，从而评价它们对伴有振动的环境所学到的厌恶(背景依赖的恐惧)。至此，所有动物都被放置于相同的盒中，其中它们被训练6min的时间，并且测量在缺乏声调或讨厌的刺激的情况下的僵直行为。然后，除去动物并更换背景，使得动物不再识别它们所训练的室。在对动物进行背景恐惧条件测试后两小时，将它们再次引入新的背景改变的盒(形状、光纤和气味(香草精))中，并在最初的2min内测量僵直行为，以证明动物未识别所述的背景。在2min后(无线索期)，传递声调(30sec,5kHz,80dB)10次，但未在60sec ISI内进行US暴露，测量僵直行为以测定线索依赖的恐惧条件。

线粒体的分离

将组织在IB-1溶液(225mM甘露醇,75mM蔗糖,0.1mM EGTA,20mM HEPES,pH 7.4)中均化。然后，将均化产物在600g下离心5min，从而除去核污染物和未破裂的细胞。将上清液在600g下再次离心5min，然后在7,000g下离心10min。收集上清液作为胞质蛋白级份。将团状物在IB-2溶液(225mM甘露醇,75mM蔗糖,20mM HEPES,pH 7.4)中洗涤，在7,000g下离心10min，再次悬浮于IB-2溶液中，在10,000g下离心10min，最后再次悬浮于MRB缓冲剂中(250mM甘露醇,5mM HEPES,0.5mM EGTA,pH 7.4)。将再次悬浮的级份覆盖在8ml Percoll培养基(225mM甘露醇,25mM HEPES pH 7.4,1mM EGTA和30％Percoll(v/v))上，然后在4℃下在SW40转子中在95,000g下离心30min。收集纯化的线粒体级份，并再次悬浮于10倍体积的MRB缓冲剂中，并在6,300g下离心10min，从而收集团状物作为线粒体级份。

突触体的分离和线粒体呼吸测试

如之前所报告，由小鼠皮质分离突触体。简言之，快速除去皮质组织，并在冰冷的‘蔗糖培养基’(320mM蔗糖,1mM EDTA,0.25mM二硫苏糖醇,pH 7.4)中均化。然后在4℃下将均化产物在1000g下离心10min。在处于离心管中的不连续的Percoll梯度(3mL层，在蔗糖培养基中3,10和23％Percoll)顶部小心地形成上清液层，并在4℃下在32,500g下离心10min。收集突触体作为10％和23％Percoll之间的带。将所收集的溶液稀释成“离子培养基”(20mMHEPES,10mM D-葡萄糖,1.2mM Na₂HPO₄,1mM MgCl₂,5mM NaHCO₃,5mM KCl,140mM NaCl,pH.7.4)。在4℃下在15,000g下离心15min以除去Percoll后，将团状物再次悬浮于离子培养基中。使用聚乙烯亚胺过夜涂敷细胞培养板(由50％溶液以1:15000稀释,Sigma–Aldrich)，并使用蒸馏水洗涤。通过在4℃下在3,000g下离心30min使突触体附着在平板上，并放置在冰上用于进一步的测量。线粒体呼吸测试方案由3分钟混合、2分钟等待和3分钟测量期的重复循环构成。通过Seahorse XF-24(Seahorse Bioscience,Billerica,USA)，3次测量基础耗氧率(OCR)。测量各孔的蛋白质浓度以证明突触体的类似的量。

免疫印迹、免疫细胞化学和免疫荧光分析

在具有1X蛋白酶抑制剂混合物(Cell signaling,Danvers,MA)的RIPA缓冲剂(Abcam,Cambridge,MA)中均化和裂解组织或细胞级份。通过10％SDS PAGE分离蛋白质并转移至PVDF膜上。在寒冷的房间内与一级抗体过夜温育并且在室温下与二级抗体温育1小时后，通过ECL(Millipore Immobilon)检测免疫反应性。兔TDP-43抗体(Proteintech,Rosemont,IL)、小鼠人类TDP-43抗体(Abnova,Walnut,CA)、COX VI(Abcam,Cambridge,MA)和GAPDH/钙连蛋白(Cell signaling,Danvers,MA)。通过过氧化物酶抗过氧化物酶方案实施免疫细胞化学。对于免疫荧光染色而言，使用蒸馏的H₂O简单地三次洗涤未经处理H₂O₂的去除石蜡并再水合的组织切片，并将其放置于1X抗原decloaker(Biocare,Concord,CA)中。然后使用Biocare’s Decloaking Chamber在加压下通过在10sec内加热至125℃，在30sec内冷却至90℃、然后在128℃下加热至22psi并在94℃下冷却至0psi，使切片经过抗原修复。在温度降低至30℃之后，使用蒸馏的H₂O将切片逐渐漂洗五次。然后使用10％正常山羊血清(NGS)在RT下将切片封闭30min，并在4℃下与包含1％NGS的PBS中与一级抗体过夜温育。使用PBS进行3次洗涤后，将切片在10％NGS中温育10min，然后在RT下在黑暗中与Alexa Fluor缀合的二级抗体(Life Technologies,Grand Island,NY)(1:300)温育2h。最后，使用PBS将切片漂洗三次，使用DAPI染色，使用PBS再次洗涤三次，并使用Fluoromount-G封片剂封片(Southern Biotech,Birmingham,AL)。

结果

在成年半合子TDP-43M337V小鼠中运动协调性(并非自发活动)、肌肉强度或感觉 运动功能的改变

我们首先监测半合子TDP-43M337V小鼠的体重，以及与运动和协调性功能有关的常用的行为测试：旋转和平衡木行走测试。半合子TDP-43M337V小鼠是有活力的，并且在出生时表现型正常，而且证明直到16个月龄(目前可利用的最大的小鼠，数据未示出)在喂养、体重、生存和后肢抓握方面与野生型(WT)同窝幼崽无差异。然而，在8个月龄时，它们在旋转和平衡木行走测试中表现出能力明显损害，这可以通过在旋转杆上停留能力的降低以及在平衡木上更长的穿过潜伏期表明(F1,27＝8.12,P<0.01，对于旋转而言；F1,27＝11.86,P<0.01，对于12mm正方形平衡木而言；F1,27＝1.21,对于12mm圆形平衡木而言无意义；F1,27＝5.48,P<0.05,对于9mm正方形平衡木而言；图7A,B)。在雄性小鼠和雌性小鼠之间未见旋转和平衡木行走测试中的差异。损害的旋转和平衡木行走能力不可能由肌无力导致，这是因为在握力强度测试中所有小鼠的前肢和后肢的性能都是相似的(F1,27＝0.69,对于前肢而言，0.38,对于后肢而言，无意义；图7C)。

为了进一步研究自发活动是否改变，我们评估转基因小鼠的旷场活动。与WT小鼠相比，8-9个月龄的半合子TDP-43M337V小鼠显示在旷场测试中对于更大的穿过距离和更快的移动速度没有明显的趋势(F1,27＝3.55,P<0.10,对于距离而言；F1,27＝3.50,P<0.10,对于速度而言；图7D)。记录在内部区域花费的时间无差异(F1,27＝0.05,无意义；数据未示出)，表明未改变的焦虑相关的行为。在半合子TDP-43M337V小鼠中，我们还通过粘纸测试，测量触觉感觉应答。TDP-43M337V的表达未明显地影响小鼠接触并移动粘纸的时间(F1,27＝0.02,无意义；图7E)，表明爪子的感觉运动功能未改变。

成年TDP-43M337V Tg小鼠中的认知缺陷

用于评价运动协调性的平衡木行走、特别是旋转测试对于脑功能障碍也是特别敏感的。因此，在半合子TDP-43M337V小鼠(不具有自发活动、肌肉强度或感觉运动功能缺陷)中发现损伤的旋转和平衡木行走能力可以反映根源于脑中的认知缺陷的行为改变。为了验证这种假说，我们在8-9个月龄的半合子TDP-43^M337V小鼠中，实施一系列的行为测试，以研究认知能力。成套测试由用于空间行走记忆的Y-迷宫测试、用于短期空间记忆的T-迷宫测试、用于短期和长期非空间记忆的目标辨别测试、以及用于情感记忆的空间条件测试组成。在Y迷宫测试(基于当探索新环境时小鼠改变臂的天然趋势)中，所有的小鼠均显示良好的自主活动，以及相似的探索率(数据未示出)。然而，转基因小鼠显示与WT小鼠相比，明显较低的自发改变的比例(F1,27＝8.92,p<0.01,图8A)，表明损害的空间行走记忆。为了进一步评估在半合子TDP-43^M337V小鼠中空间记忆缺陷，我们还基于小鼠对探索不熟悉的环境(与所参观的臂相关)的固有偏爱，实施T-迷宫测试。在适应期后，与Y-迷宫测试一致，与月龄匹配的WT小鼠相比，转基因小鼠明显表现的更差(F1,27＝4.47,p<0.05；图8B)。

在使用以下事实(与动物熟悉的目标相比，动物花费更多的时间探索新目标)的目标辨别测试中，对于各组小鼠而言，在首次探索试验(T1,50％机会水平)中，显而易见的是在闻和接触各目标所花费的时间的总量无明显的差异(F1,27＝0.97,无意义，图8C)。然而，在第二不同的刺激期(T2,短期记忆)和在T2后二十四小鼠的第三时期(T3,长期记忆)中，半合子TDP-43^M337V小鼠研究不熟悉的目标，明显低于WT小鼠(F1,27＝22.73,p<0.01，对于T2而言；F1,27＝10.98,p<0.01，对于T3而言；图8C)，表明损害的短期和长期非空间记忆。

在恐惧条件测试(基于小鼠学习将中性声调条件刺激(CS)与轻度足部无条件电刺激(US)结合，并显示僵直应答)中，我们在WT和转基因小鼠之间在适应以及在训练期内最初三次US暴露过程中僵直所花费的时间比例中，未检测到任何明显的差异(F1,27＝0.09,对于适应期而言；F1,27＝0.003，对于第一US而言；F1,27＝2.85，对于第二US而言；以及F1,27＝1.83，对于第三US而言；所有均无意义；图8D)。有趣的是，在第4次US暴露中，与WT小鼠相比，半合子TDP-43M337V小鼠显示明显较短的僵直时间(F1,27＝6.99,p<0.05)。在测试期24h后，降低的恐惧应答6事实上仍保持，从而评价它们所学到的对与振动有关的环境的厌恶(背景依赖的恐惧；F1,27＝4.94,p<0.05)。还将几组小鼠再次引入背景改变的盒(形状、光纤和气味(香草精))中，用于线索依赖的恐惧条件测试。WT和转基因小鼠在加入CS之前均为识别所述的背景(F1,27＝2.44,无意义)。如所预计的那样，在半合子TDP-43M337V小鼠中CS激发的僵直应答明显低于WT小鼠(F1,27＝7.59,p<0.05)。在消退训练并且10次CS暴露过程中，WT和转基因小鼠显示相似的弱消退(数据未示出)。在本研究中，记录在雄性小鼠和雌性小鼠之间，在认知能力中无显著的差异。总之，我们的结果显示除了损害的运动和协调性功能以外，成年半合子TDP-43M337V小鼠还发展成记忆缺陷。

通过PM1抑制TDP-43线粒体定位在TDP-43M337V Tg小鼠的脑中，减少细胞质TDP- 43累积、线粒体功能障碍和神经元损失

我们之前表征了赋予TDP43线粒体定位的特定氨基酸基序。通过删除TDP-43线粒体定位所需的基序M1(AQFPGACGL)(SEQ ID NO:4)或者使用基于M1基序的抑制肽PM1处理来抑制TDP-43线粒体定位，可以在体外和小鼠中阻断WT或突变体TDP-43诱导的线粒体功能障碍和神经元死亡。在此，使用PM1或对照肽(cPM)连续灌注11-12个月龄的WT和转基因小鼠，持续6周(1.5mg/kg/天；皮下植入的ALZET泵)。与我们之前的研究一致，鼠科TDP-43(mTDP-43,在WT小鼠中通过pan-TDP-43抗体识别)和人类突变体TDP-43(hTDP-43,在TDP-43M337V小鼠中通过人类TDP-43特异性抗体识别)存在于由小鼠脑组织得到的高度纯化的线粒体中(图9A)。我们证明PM1达到中枢神经***，并大幅降低WT小鼠脑中线粒体中内源mTDP-43的水平(数据未示出)。尽管在总裂解物中具有相似的水平，但是总TDP-43(mTDP-43加上hTDP-43)和hTDP-43显示，在PM1处理后在半合子TDP-43M337V小鼠的线粒体级份中明显减少的表达(图9A)。使用pan-TDP-43抗体的TDP-43免疫组织化学分析发现，在半合子TDP-43M337V小鼠中，TDP43在层2和3中选择性的皮质神经元细胞质中累积。使用线粒体蛋白质TOM20的特异性抗体进一步双标记，表明错误定位的TDP-43与线粒体高度地共同定位(图9B)。有趣的是，在PM1肽灌注后，TDP-43细胞质累积在TDP-43M337V小鼠中消失，表明PM1对TDP-43错误定位的抑制(图9B)。

线粒体中的TDP-43损害线粒体生物能，并且抑制TDP-43线粒体定位可以抑制其对线粒体功能的毒性。不足为奇的是，在由半合子TDP-43M337V小鼠的脑中分离得到的突触线粒体中记录的线粒体膜电势(mΔψ)或耗氧率(OCR)的显著减少，也通过PM1大幅减缓(图9C)。单独的PM1不能改变mΔψ或OCR的基础水平，这与我们之前的发现一致。有趣的是，12个月龄的半合子TDP-43M337V小鼠(但是8个月龄的小鼠不能)显示在皮质层2和3中最明显的皮质神经元的损失(Fig.9D,E和补充的图3,8个月龄的小鼠未示出)，其与在这些限制性皮质区域所观察到的TDP-43错误定位有关。在PM1处理后，在半合子TDP-43^M337V小鼠中在皮质层2和3中的神经元密度与WT小鼠或使用cPM处理的WT小鼠相当，表明PM1完全抑制突变体TDP-43^M337V诱导的神经元损失。在海马体、小脑或脊髓中未见明显的神经元损失(数据未示出)。

在TDP-43M337V Tg小鼠中PM1逆转运动协调性和认知缺陷

考虑到PM1肽处理对线粒体和神经元的保护作用，我们最终解决通过PM1抑制TDP-43线粒体定位在症状发作后是否能够逆转半合子TDP-43M337V小鼠的行为缺陷。通过连续的皮下灌注，通过PM1或cPM处理11-12个月龄的WT或转基因小鼠，持续6周。我们证明在处理之前，对于PM1和cPM灌注而言，在旋转和平衡木行走测试中，多组转基因小鼠之间不存在明显的差异(p>0.1，对于旋转而言,数据未示出；F1,16＝1.51/0.18/0.01，对于12mm正方形/12mm圆形/9mm正方形平衡木行走而言，无意义；补充图10)。与cPM处理的WT小鼠(NTG/cPM组)相比，使用cPM灌注的转基因小鼠(Tg/cPM组)(但是使用PM1灌注的转基因小鼠(Tg/PM1组)不能)显示明显损害的旋转和平衡木行走能力(F2,21＝11.93,p<0.001，对于旋转而言；F2,21＝3.3,p<0.1，对于12mm正方形平衡木而言；F2,21＝8.8,p<0.01，对于12mm圆形平衡木而言；F2,21＝9.61,p<0.01，对于12mm正方形平衡木而言；图10A,B)，表明在PM1灌注后改善的运动协调性和平衡性。在所有三组中，未记录握力强度、自主活动或触觉感觉的差异(F2,21＝1.803,对于旷场测试而言无意义；F2,21＝0.53和F2,21＝0.37,对于前肢/后肢握力强度而言无意义；F2,21＝1.368,对于粘纸测试而言无意义；图10C–E)。一致地，除了在运动协调性功能的缺陷以外，在小鼠中还可见明显损害的记忆(F2,21＝3.92,p<0.05，对于Y-迷宫而言；F2,21＝4.97,p<0.05，对于T-迷宫而言；F2,21＝1.43/7.22/5.16,p>0.1/<0.01/<0.05，对于在新目标辨别测试中分别T1-3期而言；F2,21＝1.31/4.35/8.55/3.08/4.19,p>0.1/<0.05/<0.01/<0.1/<0.05，对于在恐惧条件测试中分别的适应和第1至第4的US8暴露而言；F2,21＝7.93,p<0.01，对于背景依赖的学***大幅恢复至NTG/cPM小鼠的水平，表明在半合子TDP-43^M337V小鼠中，PM1改善的认知功能。可能由于CS刺激(白噪声)在小鼠中保持诱导僵直，所以在所有组中在恐惧条件测试中未观察到消退(F8,84＝1.065,p>0.1,数据未示出)。总之，这些结果表明通过PM1抑制TDP-43线粒体定位在半合子TDP-43M337V小鼠中在症状发作后足以逆转运动协调性功能障碍和认知缺陷。

实施例3

我们之前的结果显示，通过PM1肽抑制TDP-43线粒体定位在ALS和FTD动物模型中足以完全消除运动和认知缺陷。在本实例中，我们测试在5xFAD转基因小鼠(总结了许多Alzheimer病(AD)相关特征的广泛使用的小鼠)中PM1肽对运动和认知功能的保护作用。在10个月龄时，使用PM1或对照cPM肽皮下灌注非转基因(NTg)或5xFAD转基因小鼠(Tg)。我们证明在灌注后4周，在使用PM1处理的Tg小鼠的脑中，线粒体中TDP-43的水平实际上减少(图12A,B)。在11个月龄时，使用cPM处理的Tg小鼠证明旋转(运动功能测试)和Barnes迷宫(空间学习和记忆测试)中能力的显著损害，这可以分别通过停留在旋转杆(图12C)的降低的能力和靶向孔的长的潜伏期(图12D)表明。刺激的是，与使用cPM1处理的Tg小鼠相比，使用PM1处理的Tg小鼠证明明显改善的旋转能力(图12C)和大幅减少的靶向孔的潜伏期(图12D)。由于在5XFAD小鼠中早至6个月龄时可以记录行为缺陷，所以这些结果表明PM1在5XFAD转基因小鼠中在症状发作后还能够改善运动和认知功能。

由本发明的上述描述，本领域那些技术人员将意识到改善、改变和修改。在本领域技术范围内的这种改善、改变和修改意图涵盖在所附的权利要求书内。本申请中所述的所有参考文献、公开和专利的全部内容均以引用方式并入本文。

Claims (34)

1.一种包含治疗试剂的药物组合物，其中所述的治疗试剂包含：大约5至大约10个氨基酸的合成治疗肽，其具有与TDP-43的至少一个线粒体内部靶向序列的大约5至大约8个连续氨基酸至少大约70％,至少大约75％,至少大约80％,至少大约85％,至少大约90％,或至少大约95％一致性的氨基酸序列；以及转运部分，其与所述的治疗肽连接并促进所述的治疗肽被细胞摄取。

2.权利要求1所述的组合物，所述的治疗肽抑制线粒体呼吸复合物I的TDP-43介导的分解。

3.权利要求1所述的组合物，所述的TDP-43的至少一个线粒体内部靶向基序具有选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的组合物，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

5.权利要求1所述的组合物，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

6.权利要求1所述的组合物，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

7.权利要求9所述的组合物，所述的转运部分包含TAT肽。

8.权利要求1所述的组合物，所述的治疗试剂具有选自SEQ ID NO:12-17的氨基酸序列。

9.一种治疗受试对象的神经退行性疾病的方法，该方法包括向所述的受试对象给予治疗有效量的TDP-43线粒体定位抑制剂。

10.权利要求9所述的方法，其中所述的TDP-43定位抑制剂的治疗有效量为抑制TDP-43诱导的线粒体功能障碍和神经元损失所需的量。

11.权利要求9所述的方法，所述的TDP-43线粒体定位抑制剂包含大约5至大约10个氨基酸的合成治疗肽，其具有与TDP-43的至少一个线粒体内部靶向序列的大约5至大约8个连续氨基酸至少大约70％,至少大约75％,至少大约80％,至少大约85％,至少大约90％,或至少大约95％一致性的氨基酸序列。

12.权利要求11所述的方法，所述的治疗肽抑制线粒体呼吸复合物I的TDP-43介导的分解。

13.权利要求11所述的方法，所述的TDP-43的至少一个线粒体内部靶向基序具有选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

14.权利要求11所述的方法，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

15.权利要求11所述的方法，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

16.权利要求11所述的方法，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

17.权利要求14所述的方法，所述的TDP-43定位抑制剂进一步包含与所述的治疗肽连接的并且促进所述的治疗肽被细胞摄取的转运部分。

18.权利要求17所述的方法，所述的转运部分包含TAT肽。

19.权利要求17所述的方法，所述的TDP-43定位抑制剂具有选自SEQ ID NO:12-17的氨基酸序列。

20.权利要求9所述的方法，其中所述的神经退行性疾病选自侧索硬化(ALS),额颞痴呆,Alzheimer病,Parkinson病和Huntington病。

21.权利要求9所述的方法，其中所述的神经退行性疾病为额颞痴呆。

22.权利要求9所述的方法，其中所述的神经退行性疾病为侧索硬化。

23.权利要求9所述的方法，所述的TDP-43定位抑制剂通过连续的皮下灌注给予所述的受试对象。

24.一种治疗受试对象的侧索硬化(ALS)的方法，该方法包括：向所述的受试对象给予治疗有效量的TDP-43线粒体定位抑制剂。

25.权利要求24所述的方法，其中所述的TDP-43定位抑制剂的治疗有效量为抑制TDP-43诱导的线粒体功能障碍和神经元损失所需的量。

26.权利要求24所述的方法，所述的TDP-43线粒体定位抑制剂包含大约5至大约10个氨基酸的合成治疗肽，其具有与TDP-43的至少一个线粒体内部靶向序列的大约5至大约8个连续氨基酸至少大约70％,至少大约75％,至少大约80％,至少大约85％,至少大约90％,或至少大约95％一致性的氨基酸序列。

27.权利要求24所述的方法，所述的治疗肽抑制线粒体呼吸复合物I的TDP-43介导的分解。

28.权利要求24所述的方法，所述的TDP-43的至少一个线粒体内部靶向基序具有选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

29.权利要求24所述的方法，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

30.权利要求24所述的方法，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

31.权利要求24所述的方法，所述的治疗肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

32.权利要求24所述的方法，所述的TDP-43定位抑制剂进一步包含与所述的治疗肽连接的并且促进所述的治疗肽被细胞摄取的转运部分。

33.权利要求32所述的方法，所述的转运部分包含TAT肽。

34.权利要求24所述的方法，所述的TDP-43定位抑制剂具有选自SEQ ID NO:12-17的氨基酸序列。