CN109557015B - 流式细胞仪光谱重叠信号数字处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种流式细胞仪光谱重叠信号数字处理方法，所述方法包括以下步骤：1)利用互相关算法对荧光信号相对于散射光信号的时延进行估计，并对电路***引入的时延进行校正，得到荧光信号相应的荧光寿命，2)利用得到的荧光寿命τ₁，τ₂对检测到的类高斯脉冲信号进行人为调制，利用相移特征对时延量进行表征，3)引入具有特定相移特性的参考信号，实现原始脉冲信号的频谱迁移，并经过低通滤波实现光谱重叠影响的消除。

Description

流式细胞仪光谱重叠信号数字处理方法

本申请是申请号为201610934604.2，申请日为2016年11月01日，发明名称为流式细胞仪光谱重叠信号数字处理方法的分案申请。

技术领域

本发明涉及荧光检测及光谱分析领域，具体涉及流式细胞仪的荧光强度检测及数字调制消除光谱重叠领域。

背景技术

流式细胞仪是一种采用激光束激发快速直线流动状态中的单行细胞或生物颗粒，对它的散射光和激发的荧光信号进行探测采集，从而进行多参数、快速的定性、定量分析或分选的仪器。目前商品化的流式细胞仪产品已具有6色、8色甚至十几色荧光同时标记检测的能力。随着多色多参数流式细胞仪的快速发展，光谱重叠补偿算法在流式数据分析中越来越重要，该算法不仅影响定性分析检测结果的正确性，而且直接决定检测结果定量分析的准确性。荧光寿命测量能够提供有机荧光素、荧光蛋白和其他可发荧光的无机分子相关的荧光弛豫、强度衰减等信息。并且荧光寿命不存在荧光强度测量过程中存在的非线性问题，所以荧光寿命被引入到流式细胞仪单细胞测量中作为一个多参数信息。

为了更加精细的分析细胞特性而进行多色法荧光测量，即使用多种荧光染料标记微粒，并且使用具有不同接收光波段的多个光检测器(如PD、PMT等)测量从每种荧光染料所发射的荧光。利用多色法荧光测量时，通过根据使用的荧光染料的荧光波长选择在光检测器侧的滤光片进行荧光的检测。然而目前所使用的各种荧光染料的激发或发射波长具有宽发射谱的性质，经光学滤片滤光后，发射光谱范围仍有一定的干扰重叠。因此，若将这些染料组合进行多色测量，即使使用滤光片将从荧光染料发出的荧光分成各个波段，从非目标荧光染料发出的荧光也可能泄漏进目标荧光检测器。如果发生荧光泄漏，在光检测器处测量的荧光强度和来自目标荧光染料的真实荧光强度之间将存在差异，导致测量误差。为了补偿测量误差，需要对检测器的实际测量值进行荧光补偿。荧光补偿是修正荧光信号渗漏的过程，其目的是从荧光目标检测器中除去除匹配荧光以外的任何干扰荧光信号。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种流式细胞仪光谱重叠信号数字处理方法，所述方法包括以下步骤：1)利用互相关算法对荧光信号相对于散射光信号的时延进行估计，并对电路***引入的时延进行校正，得到荧光信号相应的荧光寿命，所述互相关算法的公式为：

其中，fs为散射光信号；fl_a，fl_b为光谱重叠后检测到的荧光信号，K₁，C₁，D₁为实际荧光信号强度；t₀为fs的中心点位置；t₀’为散射光信号未经过电路***之前的中心点位置；τ₁，τ₂为fl₁，fl₂的荧光寿命；h₀(t),h₁(t),h₂(t)分别为fs，fl₁，fl₂电路***传递函数；2)利用得到的荧光寿命τ₁，τ₂对检测到的类高斯脉冲信号进行人为调制，利用相移特征对时延量进行表征，所述进行人为调制的方法如下述公式：

其中，K₂，C₂，D₂为调制后的荧光信号强度；φ₁，φ₂为人为引入的相移，用于对时延特性进行表征，φ₁＝ω₀*τ₁，φ₂＝ω₀*τ₂；ω₀为调制频率；3)引入具有特定相移特性的参考信号，实现原始脉冲信号的频谱迁移，并经过低通滤波实现光谱重叠影响的消除。

优选地，所述步骤3)中引入具有特定相移特性的参考信号通过如下公式来实现：

其中，φ_ref1，φ_ref2为参考信号的相位，φ_ref1＝φ₂，φ_ref2＝φ₁。

优选地，所述步骤3)中经过低通滤波实现光谱重叠影响的消除通过如下公式来实现：

优选地，所述步骤1)中fs、fla、flb的采样频率为100MHz。

优选地，所述散射光采用波长488nm的激光激发荧光染料的荧光发射光。

优选地，所述荧光染料选自FITC、PE。

应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本发明所要求保护内容的限制。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1为荧光发射光谱交叉重叠示意图；

图2为光谱重叠的影响示意图；

图3为本发明的利用数字调制消除光谱重叠原理示意图；

图4为利用本发明的数字处理方法得到的结果图，其中图4(a)为原始信号；图4(b)为调制后信号；图4(c)为引入参考信号的输出；图4(d)为消除光谱重叠影响的荧光信号。

具体实施方式

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在附图中，相同的附图标记代表相同或类似的部件，或者相同或类似的步骤。

本发明提供了一种数字处理方法对荧光脉冲信号进行人为调制，并引入具有特性相移的参考信号对光谱重叠的影响进行消除，实现对检测通道的真实荧光信号的测量。首先，利用互相关算法对荧光信号相对于散射光信号的时延进行估计。然后，利用数字信号处理方法对初始荧光信号进行人为调制，利用相移特征对时延量进行表征。最后，引入具有特定相移特性的参考信号并经过低通滤波实现光谱重叠影响的消除。光谱重叠信号数字处理方法具有以下优势：(1)硬件电路***结构简单，易于实现；(2)避免了光强调制及高速处理模块之间的同步等问题；(3)完全由数字信号处理芯片完成，计算速度快，灵活性好。

基于流式细胞仪散射光及荧光脉冲信号的类高斯特性，散射光信号(fs)及两路荧光信号(fl₁,fl₂)可利用公式1表示，其中K,A,B为信号强度；t₀为fs的中心点位置；Δt₁,Δt₂为fl₁，fl₂相对于fs的时延。Δt₁,Δt₂为荧光寿命与电路***引入时延的总和。

假定荧光激发过程为单指数衰减特性，检测通道的光谱重叠信号可用公式2表示。其中，K₁，C₁，D₁为实际荧光信号强度；t₀’为散射光信号未经过电路***之前的中心点位置；τ₁，τ₂为fl₁，fl₂的荧光寿命；h₀(t),h₁(t),h₂(t)分别为fs，fl₁，fl₂电路***传递函数。

利用互相关算法对荧光信号相对于散射光信号的时延进行估计，并对电路***引入的时延进行校正得到荧光信号相应的荧光寿命。利用得到的荧光寿命τ₁，τ₂对检测到的类高斯脉冲信号进行人为调制，如公式3所示。其中，K₂，C₂，D₂为调制后的荧光信号强度；φ₁，φ₂为人为引入的相移，用于对时延特性进行表征，φ₁＝ω₀*τ₁，φ₂＝ω₀*τ₂；ω₀为调制频率。

分别将两路调制后的荧光信号与具有特定相移的参考信号进行混合，实现原始脉冲信号的频谱迁移，如公式4所示。其中，φ_ref1，φ_ref2为参考信号的相位。φ_ref1＝φ₂，φ_ref2＝φ₁。

与参考信号混合后的信号经过低通滤波即可得到去除光谱重叠影响后的真实荧光信号，如公式5所示。最终得到的荧光信号不包括光谱重叠引入的误差，信号幅值降为原始强度的1/2*cos(φ₁-φ₂)倍。

本发明的一个具体实施例中由488nm激光激发的荧光染料(FITC、PE)荧光发射光谱交叉重叠示意图如图1所示。fl₁，fl₂为真实荧光信号，fl_a，fl_b为光谱重叠后检测到的荧光信号。k₁₁，k₁₂，k₂₁，k₂₂为泄漏系数。

本发明对光谱重叠的影响进行了分析，光谱重叠会造成脉冲信号的峰值点位置及峰值发生变化。光谱重叠影响示意图如图2所示。当脉冲信号特征及泄漏系数按照表1变化时，引入的误差如表2所示。其中A,B为fl₁，fl₂的信号强度；Δt₁,Δt₂为fl₁，fl₂相对于fs的时延。

本发明利用数字调制方法实现光谱重叠消除的原理图如图3所示。单细胞流在流动室内经激光逐个激发，产生散射光信号fs及荧光信号fl₁，fl₂。光脉冲信号经过光学***(滤光片，二向色镜)后进行光电准换。fs经光电二极管转换为电脉冲信号经过电路***0；光谱重叠后的荧光信号fl_a，fl_b经PMT转换为电脉冲信号经过电路***1,2，并进行模数转换。本发明对脉宽为4μs左右的荧光脉冲信号进行处理，fs、fl_a、fl_b的采样频率为100MHz，即脉冲序列相邻数据点之间的时间间隔为10ns。

本发明利用互相关算法对数字脉冲信号进行计算，得到荧光信号相对于散射光信号的时延，并经电路***时延校准后得到真实的荧光寿命τ₁，τ₂。本发明调制频率ω₀＝10MHz，参考信号的相位φ_ref1＝φ₂＝ω₀*τ₂，φ_ref2＝φ₁＝ω₀*τ₁。本发明方法的关键步骤处理结果如图4所示。

表1.脉冲信号特性及泄漏系数

表2.光谱重叠引入的误差

结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。

Claims (4)

1.一种流式细胞仪光谱重叠信号数字处理方法，所述方法包括以下步骤：

1)利用互相关算法对荧光信号相对于散射光信号的时延进行估计，并对电路***引入的时延进行校正，得到荧光信号相应的荧光寿命，所述互相关算法的公式为：

其中，fs为散射光信号；fl_a，fl_b为光谱重叠后检测到的荧光信号，K₁，C₁，D₁为实际荧光信号强度；t₀为fs的中心点位置；t₀’为散射光信号未经过电路***之前的中心点位置；τ₁，τ₂为fl₁，fl₂的荧光寿命；h₀(t),h₁(t),h₂(t)分别为fs，fl₁，fl₂电路***传递函数；K₀，C₀，D₀为荧光信号强度；Δt_a,Δt_b为fl_a，fl_b相对于fs的时延；t为时间，σ为标准差；

2)利用得到的荧光寿命τ₁，τ₂对检测到的类高斯脉冲信号进行人为调制，利用相移特征对时延量进行表征，所述进行人为调制的方法如下述公式：

其中，K₂，C₂，D₂为调制后的荧光信号强度；

为人为引入的相移，用于对时延特性进行表征，

ω₀为调制频率；t为时间，σ为标准差，fs_mod为散射光信号fs经过人为调制后的光强信号；fl_a_mod为荧光信号fl_a经过人为调制后的光强信号；fl_b_mod为荧光信号fl_b经过人为调制后的光强信号；

3)引入具有特定相移特性的参考信号，实现原始脉冲信号的频谱迁移，并经过低通滤波实现光谱重叠影响的消除，其中，

引入具有特定相移特性的参考信号通过如下公式来实现：

其中，

为参考信号的相位，

t为时间，fl_a_mix为信号fl_a_mod经过频谱迁移后的光强信号；fl_b_mix为信号fl_b_mod经过频谱迁移后的光强信号；

经过低通滤波实现光谱重叠影响的消除通过如下公式来实现：

其中，t为时间，σ为标准差，fl₁，fl₂为信号fl_a_mix，fl_b_mix经过低通滤波后的光强信号，即为光谱重叠剔除后原始荧光信号。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)中fs、fl_a、fl_b的采样频率为100MHz。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述散射光采用波长488nm的激光激发荧光染料的荧光发射光。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述荧光染料选自FITC、PE。

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