CN109554332A - 一种使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法，包括：1)样本准备：将传代培养的CHO‑K1细胞离心5min，使用无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液或者传代培养基重悬，使细胞密度为1E6cells/mL；2)液滴调整参数设置：启动单细胞打印机的液滴质量控制，设置触发延迟为3ms，深度为10μm，速度为120μm/ms；3)分选参数设置：设置细胞直径12μm‑18μm、细胞圆度55％‑100％以及细胞检测半径为60μm；4)分选：将单细胞打印机的墨盒中的细胞样本分选到孔板中，每孔分选1个细胞。本发明的方法能使提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率，相比现有技术中的CHO‑K1细胞其他分选和培养条件有显著的进步。
Description
技术领域
本发明属于生物制药和生物技术领域，特别是涉及使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法，可应用于生产用细胞株的构建。
背景技术
单克隆抗体等生物药是近年来研发越来越火热的领域，随之而来的相关法规的要求也是越来越严格。对于生产用稳定细胞株构建，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese HamsterOvary，CHO)是最常用的宿主细胞之一。为了保证生物药的安全性，监管部门对生产用细胞株的单克隆性的要求非常高，因此，细胞单克隆化是整个细胞株构建过程中非常关键的步骤。
目前，细胞单克隆化常用的两种方法是有限稀释法和流式细胞仪分选。有限稀释法是一种较常规的方法，通过将细胞逐步稀释至很低的密度并铺板于96孔板中，同时结合Cell Metric(Solentim)等成像仪器，可以获得较高的单克隆率。由于低密度铺板，一块96孔板中的有效孔数目较少，需要增加铺板数目，比较耗费时间和人力，所以有限稀释法的效率比较低。流式细胞仪分选单细胞是一种相对高效的方法，通过对细胞内或者对细胞分泌产物进行荧光染色，从而有效的将单细胞分选至96孔板。该方法相较于有限稀释法，减少了非单细胞孔的数目，提高了单克隆率。同时流式细胞仪的清洁流程已经验证，以避免污染和交叉污染，能够保证细胞株的单克隆性。但是流式细胞仪的清洗流程繁琐，操作复杂，当同时有多个样品进行单细胞分选时，需要完成一个样品的单细胞分选及完整的清洗步骤之后才能进行下一个样品的分选，导致分选的操作效率降低。并且所用相关耗材配件价格昂贵，仪器需要专人负责维护。
单细胞打印机(Single-Cell Printer，Cytena)技术是一种新型的单细胞分选技术。单细胞打印机是利用微流体技术和实时图像分析将单个细胞分选并沉积到标准微孔板中。与喷墨打印技术类似的创新墨盒用于单向分配。当细胞分配时捕获五个图像，提供单细胞分离的证据。它能够通过高分辨率成像快速的区分单细胞，多细胞，无细胞和碎片，轻松区分单细胞。该方法进行单细胞分选要比有限稀释法具有更高的效率，并且具有比流动分选更高的活力。同时单细胞打印机采用一次性无菌墨盒，独立包装，以避免样品之间的交叉污染。单细胞打印机相对流式细胞仪，使用过程中不需要清洗仪器，操作更加快速和简单，也无需消耗昂贵的耗材，无需专人维护仪器，降低了时间、经济和人力成本。但是，单细胞打印机的单细胞分选效率和单克隆的恢复率受到细胞分选和培养条件的影响很大，不同细胞的分选和培养条件差异化显著，因此，探求某种特定细胞的合适的分选和培养条件以提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率，是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法，以进一步提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率。
为解决上述技术问题，本发明提供一种单细胞分选的方法，包括以下步骤：
1)样本准备：将传代培养的CHO-K1细胞离心5min，使用无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液(D-PBS，Hyclone SH30028.02)或者传代培养基重悬，使细胞密度为1E6cells/mL；然后再使用40μm的过滤器将重悬后的细胞悬液过滤，待用；
2)单细胞打印机的液滴调整参数设置：启动单细胞打印机的液滴质量控制，设置触发延迟为3ms，深度为10μm，速度为120μm/ms；
3)单细胞打印机的分选参数设置：设置细胞直径12μm-18μm、细胞圆度55％-100％以及细胞检测半径为60μm；
4)分选：将单细胞打印机的墨盒中的细胞样本分选到孔板中，每孔分选1个细胞。
具体的，所述步骤2)之前，先启动单细胞打印机，待软件初始化完成，再启动液滴质量控制。
具体的，所述液滴质量控制的结果以图像的形式储存。
具体的，所述细胞检测半径为自动或者手动进行设置。
具体的，所述墨盒中的细胞样本为10-80μL。
具体的，所述孔板为96孔板，预先每孔加入了100μL培养基。
具体的，所述方法还包括评估单克隆率步骤：在孔板预先加入培养基后，使用CellMetric(Solentim)单克隆细胞株分析仪扫描培养基，然后进行分选；待分选完成后，孔板静置使细胞充分沉降，再使用Cell Metric单克隆细胞株分析仪进行成像，以判断孔板每孔是否为单克隆；所述培养基为含乙醇的培养基。
优选的，所述培养基为体积分数90％的传代培养基+体积分数10％的75％乙醇。
具体的，所述方法还包括评估克隆恢复率步骤：待分选完成后，将细胞在二氧化碳培养箱静置培养，分别在2h、1天、2天、5天和9天后使用Cell Metric单克隆细胞株分析仪拍照，评估细胞的恢复情况。
优选的，二氧化碳培养箱的培养条件为36.5℃，6％CO2。
本发明提供了单细胞打印机进行单细胞分选和生产用细胞株构建的分选和培养条件，解决了进一步提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率的问题。现有的有限稀释克隆方法，假设按照0.4细胞/孔铺板，每块96孔板单克隆孔的百分比一般为20％左右，单克隆恢复率通常低于50％。使用本发明的方法，单细胞打印机进行单细胞分选，83.8％的孔为单克隆，8.3％的孔为空孔，7.9％的孔含有2个或2个以上细胞。使用本发明分选细胞，单克隆的平均恢复率高达82.7％。使单细胞分选效率以及单克隆的恢复率达到了很高的水准，相比现有技术中的CHO-K1细胞其他分选和培养条件有显著的进步，相较于有限稀释法，单克隆化的效率大大提高，相较于流式细胞仪分选，无需进行仪器的清洗，进一步提高了操作效率。且无需消耗昂贵的耗材，无需专人维护仪器，降低了时间、经济和人力成本。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所开发的流式细胞仪单克隆分选方法，可应用于CHO-K1等生产用稳定细胞株的构建。
实施例一
一种具体实施方法如下：
1、仪器启动：打开单细胞打印机的主电源开关，启动仪器。点击软件，自动执行ROI(Region of Interest，定义了产生液滴时从芯片喷嘴喷出的体积)检测，等待软件初始化完成。
2、样本准备：将传代培养的CHO-K1细胞300g离心5min，使用无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液(D-PBS，Hyclone SH30028.02)或者传代培养基重悬，使细胞密度为1E6cells/mL。然后再使用40μm的过滤器将重悬后的细胞悬液过滤，待用。
3、仪器准备：首先启动液滴质量控制，按“启动质量控制”按钮，启动液滴QC。液滴QC的结果可以以图像的形式储存。然后进行液滴调整，触发延迟设置为3ms，深度为10μm，速度为120μm/ms，要确认液滴是单一和稳定的。再进行真空快门检查，真空可以通过使用“打开/关闭真空”按钮来开关。
4、分选参数设置：细胞直径12μm-18μm、细胞圆度55％-100％以及细胞检测半径为60μm。细胞检测半径可以自动或者手动进行设置，手动设置是通过点击“手动设置ROI”按钮来实现的。在显示喷嘴的背景中会出现一个图像窗口。点击窗口，手动定位ROI。单击将设置ROI的中心。将绘制ROI圆，进行ROI的定位。
5、单细胞分选：将10-80μL的细胞样本加入至墨盒中，并安装墨盒。将预先每孔加入了100μL培养基的96孔板放置到仪器上，待各项参数设置完毕后，开始分选。96孔板每孔分选1个细胞。
6、分选后细胞培养：分选结束之后，将细胞放在二氧化碳培养箱静置培养(36.5℃，6％CO2)，分别在2h，1天，2天，5天和9天后使用Cell Metric拍照，待克隆生长恢复后，将克隆扩增，从而进行后续的筛选。
实施例二
基于实施例一的方法进行单细胞打印机分选单克隆率评估：
预先在96孔板每孔加入100μL含有乙醇的培养基(90％传代培养基+10％75％乙醇)，使用单细胞打印机进行单细胞分选，每孔分选1个细胞。培养基中加入乙醇，目的是使细胞不再***。分选完成后，96孔板静置2h使细胞充分沉降，然后使用Cell Metric(Solentim)进行成像，以判断96孔板每孔是否为单克隆。为了区分96孔板和培养基中的杂质，96孔板加入培养基后预先使用Cell Metric扫描。分选24h，使用Cell Metric重新扫描一次96孔板，以再次确认96孔板每孔的单克隆性。分选单克隆率评估结果如表1所示。
表1单细胞打印机单细胞分选效率
| 96孔板数 | 空孔数 | 单细胞孔数 | 2个或2个以上细胞孔数 |
| 5 | 40(8.3％) | 402(83.8％) | 38(7.9％) |
实施例三
基于实施例一的方法进行单细胞打印机分选克隆恢复率评估：
预先在96孔板每孔加入100μL培养基，使用单细胞打印机进行单细胞分选，每孔分选1个细胞。分选后，细胞在二氧化碳培养箱静置培养(36.5℃、6％CO2)，分别在2h、1天、2天、5天和9天后使用Cell Metric拍照。9天后，评估细胞的恢复情况。评估细胞的恢复情况如表2所示。
表2单细胞打印机单细胞分选的克隆恢复率
| 96孔板数 | 单细胞孔数 | 生长恢复的单细胞孔数 | 恢复率 |
| 1 | 81 | 67 | 82.7％ |
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种单细胞分选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样本准备：将传代培养的CHO-K1细胞离心5min，使用无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液或者传代培养基重悬，使细胞密度为1E6cells/mL；
2)单细胞打印机的液滴调整参数设置：启动单细胞打印机的液滴质量控制，设置触发延迟为3ms，深度为10μm，速度为120μm/ms；
3)单细胞打印机的分选参数设置：设置细胞直径12μm-18μm、细胞圆度55％-100％以及细胞检测半径为60μm；
4)分选：将单细胞打印机的墨盒中的细胞样本分选到孔板中，每孔分选1个细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，再使用40μm的过滤器将重悬后的细胞悬液过滤，待用。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)之前，先启动单细胞打印机，待软件初始化完成，再启动液滴质量控制。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，液滴质量控制的结果以图像的形式储存。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，细胞检测半径为自动或者手动进行设置。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，墨盒中的细胞样本为10-80μL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述孔板为96孔板，预先每孔加入了100μL培养基。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括评估单克隆率步骤：在孔板预先加入培养基后，使用Cell Metric单克隆细胞株分析仪扫描培养基，然后进行分选；待分选完成后，孔板静置使细胞充分沉降，再使用Cell Metric单克隆细胞株分析仪进行成像，以判断孔板每孔是否为单克隆；所述培养基为含乙醇的培养基。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基为体积分数90％的传代培养基+体积分数10％的75％乙醇。
10.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括评估克隆恢复率步骤：待分选完成后，将细胞在二氧化碳培养箱静置培养，分别在2h、1天、2天、5天和9天后使用Cell Metric单克隆细胞株分析仪拍照，评估细胞的恢复情况。
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