CN109550041B - 奥利万星磷酸盐在制备防治牛传染性鼻气管炎药物中的应用 - Google Patents
奥利万星磷酸盐在制备防治牛传染性鼻气管炎药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种奥利万星磷酸盐在制备防治牛传染性鼻气管炎的药物中的应用，奥利万星磷酸盐在体外实验MDBK细胞模型上能抑制和杀灭牛传染性鼻气管炎病毒，能够有效地抑制牛传染性鼻气管炎病毒的入侵和复制，且细胞毒性小，可作为一类新的抗牛传染性鼻气管炎病毒的药物，为牛传染性鼻气管炎病的防控和药物研发奠定了基础，也为开发高效特异的抗牛传染性鼻气管炎病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及奥利万星磷酸盐在制备防治牛传染性鼻气管炎药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，以高热、呼吸困难、流鼻汁、上呼吸道及气管、黏膜发炎等为特征。20世纪50年代早期，美国科罗拉多州某些牧场首次出现以鼻气管炎为症状的传染性牛病，1955年首次报道了该病的临床症状。我国于20世纪70年代首次在进口种牛中鉴定并分离获得，牛传染性鼻气管炎病毒可导致持续性感染，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为B类疾病，也是我国进境动物必检疾病之一。目前牛传染性鼻气管炎病毒有效的疫苗是灭活疫苗和弱毒疫苗，但存在免疫抑制与潜伏感染等问题。灭活苗免疫后个体无法与自然感染个体进行鉴别诊断，因此会给根除牛传染性鼻气管炎带来一定的障碍。传统弱毒苗存在毒力返强现象，存在一定的安全隐患。最重要的是牛传染性鼻气管炎病毒为胞内增殖病毒，灭活疫苗不能清除体内的病毒，只能预防。基于防控的难点和免疫的限制，研发能抑制和杀灭牛传染性鼻气管炎病毒的药物成为众多研究者的热点之一。
奥利万星磷酸盐(Oritavancin Diphosphate)，是糖肽类抗生素，具有多重作用机制，如通过结合抑制细胞壁合成的肽而破坏细菌细胞膜的完整性，导致细胞死亡；适用于治疗由敏感革兰氏阳性菌导致的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。CAS号为192564-14-0，化学名称为：(4"R)-22-O-(3-Amino-2,3,6-trideoxy-3-C-methyl-α-L-arabino-hexopyranosyl)-N3"-[(4′-chloro[l,1′-biphenyl]-4-yl)methyl]vancomycindiphosphate，经验分子式(希尔表示法)C86H97Cl3N10O26·2H3PO4，分子量为1989.09。奥利万星磷酸盐的结构如式(I)所示：
式(I)奥利万星磷酸盐
发明内容
本发明提供了奥利万星磷酸盐化合物在抑制和/或杀灭牛传染性鼻气管炎病毒中的应用，奥利万星磷酸盐化合物能够有效地抑制牛传染性鼻气管炎病毒的增殖，对细胞的毒性较小，具有开发成抗牛传染性鼻气管炎药物的前景。本发明所述应用是首次公开，与奥利万星磷酸盐已知的临床用药用途不同。
本发明所述的奥利万星磷酸盐(Oritavancin Diphosphate)为奥利万星的二磷酸盐，其结构及信息如背景技术中所示。
本发明建立了牛传染性鼻气管炎病毒在细胞水平上药物筛选体系。确定了奥利万星磷酸盐对MDBK细胞(即牛肾细胞)的半数毒性浓度(CC50)大于100μM，对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(EC50)为0.3944μM，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的治疗指数大于253.55。
本发明还提供了根据病毒的致病机制，分别采用不同时间点给药实验以及先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
具体地，本发明的技术方案如下所示：
在本发明的第一方面，本发明提供了奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备治疗牛传染性鼻气管炎药物中的应用。
在本发明的第二方面，本发明提供了奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备抗牛传染性鼻气管炎病毒的药物中的应用。
在本发明的第三方面，本发明提供了奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备抑制和/或杀灭牛传染性鼻气管炎病毒的药物中的应用。
在本发明的第四方面，本发明提供了奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备抑制牛传染性鼻气管炎病毒增殖的药物中的应用。
在本发明的第五方面，本发明提供了奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备阻断牛传染性鼻气管炎病毒复制的药物中的应用。
在本发明的第六方面，本发明提供了奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备抑制牛传染性鼻气管炎病毒增殖的药物中的应用。
本发明所述制剂包括奥利万星磷酸盐的制剂或包含奥利万星磷酸盐的组合物的制剂。
本发明所述包含奥利万星磷酸盐的组合物为以奥利万星磷酸盐为活性成分的组合物、以奥利万星磷酸盐为主要活性成分的组合物或者以奥利万星磷酸盐为唯一活性成分的组合物。
根据本发明的上述应用，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(EC50)为0.3944μM；奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的治疗指数大于253.55。
根据本发明的实施方式，奥利万星磷酸盐在药物浓度安全范围内，随着浓度的升高，抑制或杀灭效果随之提升。本发明所述的药物在浓度安全范围内即指药物在抑制或杀灭牛传染性鼻气管炎病毒细胞时，对牛传染性鼻气管炎病毒的易感细胞没有伤害。
奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的易感细胞毒性低，比如MDBK细胞的半数毒性浓度(CC50)大于100μM，在将其制备为药物的应用中，在未接触或未被牛传染性鼻气管炎病毒感染的状况下使用该药物，然后接触或被牛传染性鼻气管炎病毒感染后对牛传染性鼻气管炎病毒的抑制作用并不明显，有效抑制率低于20％。如本发明图3所示，在先给药后感染牛传染性鼻气管炎病毒病毒的情况下(对应图3中的-2h)，相较于其他给药时间，几乎并未发挥抑制作用。因此，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的抗病毒作用主要在牛传染性鼻气管炎病毒吸附到细胞后或被牛传染性鼻气管炎病毒感染后发挥。
以及，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的作用呈现多位点、多环节性，在本发明的药物体外研究中可以发现(如实施例4和5)，不同给药时间包括感染病毒前给药、感染病毒后给药以及感染病毒的同时给药三种给药时间，和不同作用方式包括先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用三种作用方式，通过不同时间给药发现，除感染病毒前给药无明显效果外，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒均有明显的抑制作用；而通过不同作用方式给药发现奥利万星磷酸盐与牛传染性鼻气管炎病毒直接接触(或称为预先作用)可实现对牛传染性鼻气管炎病毒的直接杀伤作用(EC50＝0.4091μM，图4)；将牛传染性鼻气管炎病毒即加入到已加好奥利万星磷酸盐(即与细胞预先作用后)的细胞中，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒并未体现出明显的阻断其对细胞的吸附作用；将奥利万星磷酸盐加入到已加好毒液(即与细胞预先作用后)的细胞中，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒具有复制阻断作用(EC50＝2.030μM，图5)。
根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。
本发明上述应用中所述的药物表示一种物质，其所含有的奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒具有明显的抑制和/或杀灭作用，并主要作用于牛传染性鼻气管炎病毒生活周期的多个阶段，可以实现对该病毒的直接杀灭、可以阻断或抑制该病毒的复制，尤其具有特别优异的对该病毒直接性抑制或杀灭的效果。
此外，本发明还公开了，施用奥利万星磷酸盐与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，奥利万星磷酸盐还可以与其它非药物活性成分组合使用。
本发明的具体实施方式中，提供一种抗牛传染性鼻气管炎的药物组合物，所述药物组合物由奥利万星磷酸盐与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
本发明的又一具体实施方式中，奥利万星磷酸盐比如可以取不低于半数有效浓度的药物浓度EC50＝0.3944μM；当然，当奥利万星磷酸盐与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭牛传染性鼻气管炎病毒等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是奥利万星磷酸盐常用的剂型形式，或者其他可行的剂型，比如本领域技术人员可以在常规的剂型中选择适合于奥利万星磷酸盐的剂型，通过加入与奥利万星磷酸盐相容的载体、赋形剂、粘合剂、溶剂等等来实现。该处所述的常规剂型比如液体剂型、固体剂型、外用制剂、喷剂等等，比如下列剂型：真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。
本发明的药物组合或药物制剂中还可以含有常用的载体，这里所述可药用载体首先应该是适合于奥利万星磷酸盐的，本领域技术人员可以在下列常用的载体中选择：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘油、山梨酯、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜂蜡、羊毛酯等。载体在药物组合物中的含量可以是1wt％-98wt％，通常大约占到80wt％。为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，缓冲剂等可直接溶于载体中。
口服片剂和胶囊可以含有赋形剂如粘合剂，但其首先应该是适合于奥利万星磷酸盐的，如糖浆、***胶、山梨醇、黄芪胶、或聚乙烯吡咯烷酮，填充剂，如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、氨基乙酸、润滑剂，如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、硅土、崩解剂、如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学上公知的方法包衣。
口服液可以与适宜于奥利万星磷酸盐的溶剂制成悬浮液、溶液、乳浊液、糖浆，也可以制成干品，用前补充适宜溶剂或本领域已知适合于奥利万星磷酸盐的媒质。这种液体制剂可以包含常规的添加剂，但这些添加剂同样首先应该是适宜于奥利万星磷酸盐的，如悬浮剂：山梨醇、纤维素甲醚、葡萄糖糖浆、凝胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化的食用油脂；乳化剂：如卵磷脂，山梨聚糖单油酸盐，***树胶；或非水载体(可能包含可食用油)：如杏仁油，油脂如甘油、乙二醇或乙醇；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸。如需要可添加调味剂或着色剂。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示为实施例2中奥利万星磷酸盐对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)；
图2显示为实施例3中奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(EC50)；
图3显示为实施例4中奥利万星磷酸盐不同时间点给药(40μM)对牛传染性鼻气管炎病毒抑制的效果图；
图4显示为实施例5中奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒直接杀伤作用效果图；
图5显示为实施例5中奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒复制作用效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。以下实施例中所述药物，如无特殊说明，均表示奥利万星磷酸盐。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1牛传染性鼻气管炎病毒TCID50的测定
将MDBK细胞(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)消化后以每孔1×105个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将牛传染性鼻气管炎病毒(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10-1～10-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE(细胞病变效应)情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按Karber法计算病毒TCID50。
表1、牛传染性鼻气管炎病毒-F9的TCID50
注：TCID50，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。
结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，5天后各孔的细胞病变不再继续,统计出不同浓度的CPE孔数,并计算出不同浓度的CPE比率，并按Karber法计算牛传染性鼻气管炎病毒的TCID50值：
LgTCID50＝L-D(S-0.5)
(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)
LgTCID50＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(5.5-0.5)＝-6
TCID50＝10-6/0.1mL
即将该病毒稀释106接种100μL可使50％的细胞发生病变。
实施例2奥利万星磷酸盐对MDBK细胞的毒性实验：
MDBK细胞是牛传染性鼻气管炎病毒的易感细胞。因此，首先检测奥利万星磷酸盐对MDBK细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(MDBK 5000个/孔)。
(2)培养约12h后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度(以50μM为起始浓度，按两倍梯度依次稀释得到25μM,12.5μM,6.25μM,3.125μM等9个浓度)的2％FBS DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL含0.9％DMSO的2％FBS DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％CO2条件下培养48h后，弃去孔内的培养基。用100μL PBS洗涤两遍，排除药物对MTT反应的影响。每孔再补加100μL DMEM培养基+10μL MTT。
(4)37℃，5％CO2条件下继续培养4h后，每孔加入100μL Formazan溶解液。37℃，5％CO2继续孵育，直至Formazan紫色结晶完全溶解。
(5)在570nm测定吸光值。将0.9％DMSO处理的细胞的A570nm设为100％细胞对照。
(6)分析数据，利用GraphPad Prism 5计算奥利万星磷酸盐的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图1所示。
结果：奥利万星磷酸盐出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定奥利万星磷酸盐半数中毒浓度为大于100μM。
实施例3奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的抑制实验：
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个MDBK细胞，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 100TCID50的牛传染性鼻气管炎病毒病毒稀释液(用2％FBS DMEM细胞长满后加入病毒稀释液，按照50μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值-病毒对照组D450nm值)/(正常细胞对照组D450nm值-病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC50)值。其结果如图2所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对牛传染性鼻气管炎病毒的有效抑制率。从结果可以看出，奥利万星磷酸盐在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(EC50)为0.3944μM。奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的治疗指数大于253.55。
实施例4奥利万星磷酸盐作用机制的初步研究
通过不同的给药时间，即对应的时刻是先给药后感染病毒(0h之前)、先感染病毒后给药(0h之后)、病毒和药物同时加入细胞(0h)三个时间点，将待测化合物加入到接种了牛传染性鼻气管炎病毒的MDBK细胞中，进而初步判断奥利万星磷酸盐的作用时期。具体实验步骤如下：
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个MDBK细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)根据已测得的相关药物的药效学评价结果，确定实验所需药物的浓度，并用维持培养基把药物稀释至所需浓度。
(3)细胞过夜培养后，将96孔板中第二列三个复孔的细胞上清吸走，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍。然后加入50μL的待测药物，记为-2h。
(4)2h后，将其他孔的细胞上清全部吸走，将稀释好的牛传染性鼻气管炎病毒稀释液加到第2-11列的每孔中，每孔加样体积为50μL。同时在第3列的三个复孔中加入50μL相应待测物，此刻记为0h。
(5)以后每隔一定时间在下一列的三个复孔中加入相应待测化合物，标记好相应时间。以第11列的MDBK细胞作为病毒对照组。
(6)培养48h后，进行OD值测定。分析数据，得出结论，给药浓度为40μM时的结果如图3所示。
结果：从不同时间点给药实验结果分析可知，奥利万星磷酸盐在病毒吸附和病毒感染后都发挥明显的抗病毒作用，呈现出多位点、多环节的作用。
实施例5奥利万星磷酸盐不同时间加入对牛传染性鼻气管炎病毒复制的影响
我们对奥利万星磷酸盐进行了进一步的作用机制研究。分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的100TCID50病毒液与不同浓度的药物稀释液(以50μM为起始浓度，按两倍梯度依次稀释得到25μM,12.5μM,6.25μM,3.125μM等9个浓度)混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用4h后,加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism 5软件得化合物的EC50。
结果：奥利万星磷酸盐与牛传染性鼻气管炎病毒预先作用的给药方式下，各浓度的试验加药组细胞病变较病毒对照组轻微，细胞的变圆、脱落、空泡化等病理现象有所减轻，通过分析软件，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的作用效果如图4所示。从图4中可以看出，在这种作用式下，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒表现出一定的抑制作用，并且药物在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。表明奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒具有一定的直接灭活的作用，图4示出了-4小时(即药物与病毒先作用4h再加入细胞中)时奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的EC50值为0.4091μM。
(2)药物对牛传染性鼻气管炎病毒吸附的阻断作用
按每孔个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的100TCID50病毒液置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
结果：CPE观察结果显示，药物预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。细胞活力检测结果显示，此种药物对牛传染性鼻气管炎病毒的有效抑制率在20％以下，表明奥利万星磷酸盐不能阻止牛传染性鼻气管炎病毒对细胞的吸附作用。
(3)药物对牛传染性鼻气管炎病毒复制的阻断作用
按每孔个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的100TCID50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，48h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。
结果：该种给药方式下，各浓度的试验加药组细胞病变较病毒对照组轻微，细胞的变圆、脱落、空泡化等病理现象有所减轻，通过分析软件，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的作用效果如图5所示。从图5中可以看出，在这种作用式下，奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒表现出一定的抑制作用，并且药物在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系，表明奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒具有一定的直接灭活的作用，图5示出了2小时(即病毒侵染细胞2h后再加入药物)时奥利万星磷酸盐对牛传染性鼻气管炎病毒的EC50值为2.030μM。
本发明应用实施例以牛肾细胞(MDBK)为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现奥利万星磷酸盐的新型抗病毒作用，对牛传染性鼻气管炎病毒有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用和复制阻断作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备治疗与牛传染性鼻气管炎病毒相关的疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与牛传染性鼻气管炎病毒相关的疾病为牛传染性鼻气管炎。
3.奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备抗牛传染性鼻气管炎病毒的药物中的应用。
4.奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备抑制和/或杀灭牛传染性鼻气管炎病毒的药物中的应用。
5.奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备抑制牛传染性鼻气管炎病毒增殖的药物中的应用。
6.奥利万星磷酸盐或包含奥利万星磷酸盐的组合物或其制剂在制备阻断牛传染性鼻气管炎病毒复制的药物中的应用。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的应用，其特征在于，所述制剂包括奥利万星磷酸盐的制剂或包含奥利万星磷酸盐的组合物的制剂。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的应用，其特征在于，所述包含奥利万星磷酸盐的组合物为以奥利万星磷酸盐为活性成分的组合物、以奥利万星磷酸盐为主要活性成分的组合物或者以奥利万星磷酸盐为唯一活性成分的组合物。
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