CN109536567B - 组合物、含有该组合物的细胞活性的检测试剂及细胞活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及组合物、含有该组合物的细胞活性的检测试剂及细胞活性的检测方法。本发明提供的细胞活性检测的组合物和试剂，用使促肝细胞生长素表现出一定的刺激指数。用RPMI‑1640培养基(‑Gln)替代RPMI‑1640培养基(+Gln)，+Gln的存在会促进细胞的生长代谢，影响药物本身的作用。通过改变检测血清的种类，使促肝细胞生长素表现出明显的刺激指数。用四季青的新生牛血清替代Gibco的胎牛血清，刺激指数从1.2提升到4.6以上。实验结果表明，细胞浓度为2.5×10⁴/mL～4.0×10⁴/mL，培养3.5小时，促肝细胞生长素肠溶胶囊作用于L02正常肝细胞的活性检测方法表现出很高的刺激指数。

Description

组合物、含有该组合物的细胞活性的检测试剂及细胞活性的 检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及组合物、含有该组合物的细胞活性的检测试剂及细胞活性的检测方法。

背景技术

在生物活性检测方面，由于癌细胞具有无限增殖的能力，且稳定性较好，相对于正常细胞难培养、传代次数少，因此其在体外活性检测方面具有广泛的应用。在促肝类药物体外活性检测方面，目前应用的较多的细胞有SMMC7721，MHCC-97L，HepG2，Huh7，Bel7402等等，这些肝癌细胞基因存在着大量的突变，其在遗传性，代谢途径，生长习性，细胞形态等都和正常肝细胞相差较大。虽然肝癌细胞在生物活性检测方面具有巨大的优势，但药物对肝癌细胞具有作用并不一定能说明其对正常肝细胞具有作用，在活性检测方面肝癌细胞并不能很好的替代正常肝细胞来说明某一类药物对肝脏具有的作用。

L02细胞是一种贴壁生长的人正常肝细胞，容易培养，稳定性好，且传代次数多，相比于肝癌细胞在促进细胞增殖、活性机理研究、代谢调控等方面更接近于正常的肝组织，从而说明药物对肝脏的作用。

L02细胞在研究肝功能方面应用广泛，在肝损伤机制，肝细胞凋亡通路，糖脂代谢等方面都有相关文献报道，但未见促肝类药物促进肝细胞增殖方面的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种组合物、含有该组合物的细胞活性的检测试剂及细胞活性的检测方法。选择了合适的细胞株来研究药物对肝脏的作用。L02细胞是一种贴壁生长的人正常肝细胞，用L02正常肝细胞来验证药物对肝脏的作用，并建立了一种适合L02正常肝细胞的活性检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种组合物，由不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养基和四季青的新生牛血清组成。

在本发明的一些具体实施方案中，四季青的新生牛血清与不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养基的体积比为1：9。

本发明还提供了所述的组合物在制备细胞活性的检测制剂中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞为L02人正常肝细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞为预防和/或治疗肝脏疾病的药物作用后的L02人正常肝细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为促肝细胞生长素肠溶胶囊。

在此基础上，本发明还提供了细胞活性的检测试剂，包括所述的组合物和制剂中可用的辅料。

本发明还提供了试剂盒，包括所述的检测试剂。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括胰蛋白酶－乙二胺四醋酸二钠消化液。

本发明还提供了所述的试剂盒在检测细胞活性中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞为L02人正常肝细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞为预防和/或治疗肝脏疾病的药物作用后的L02人正常肝细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为促肝细胞生长素肠溶胶囊。

本发明还提供了一种细胞活性的检测方法，取所述的组合物、所述的检测试剂或所述的试剂盒中的检测试剂与待测细胞混合，培养，检测活性。

在本发明的一些具体实施方案中，所述混合获得的细胞培养液中细胞数为2.5×10⁴/mL～4.0×10⁴/mL，所述培养的时间为3.5h。

本发明提供了一种细胞活性检测的组合物和试剂，用使促肝细胞生长素表现出一定的刺激指数。用RPMI-1640培养基(-Gln)替代RPMI-1640培养基(+Gln)，+Gln的存在会促进细胞的生长代谢，影响药物本身的作用。通过改变检测血清的种类，使促肝细胞生长素表现出明显的刺激指数。用四季青的新生牛血清替代Gibco的胎牛血清，刺激指数从1.2提升到4.6以上。实验结果表明，细胞浓度为2.5×10⁴/mL～4.0×10⁴/mL，培养3.5小时，促肝细胞生长素肠溶胶囊作用于L02正常肝细胞的活性检测方法表现出很高的刺激指数。

具体实施方式

本发明公开了一种组合物、含有该组合物的细胞活性的检测试剂及细胞活性的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的组合物、含有该组合物的细胞活性的检测试剂及细胞活性的检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)

取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.15g、磷酸二氢钾0.2g,超纯水1000ml溶解后，121℃灭菌20min过滤除菌。

RPMI-1640培养液

Gibco的RPMI-1640培养基(+Gln)

10％小牛血清培养液

取上述RPMI－1640培养液45ml，加已分装的四季青小牛血清5ml。

RPMI-1640检测液

Gibco的RPMI-1640培养基(-Gln)

10％小牛血清检测液

取上述RPMI－1640检测液45ml，加已分装的四季青小牛血清5ml。

0.25％胰蛋白酶－乙二胺四醋酸二钠消化液

取0.25g胰蛋白酶及0.02g乙二胺四醋酸二钠，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液100ml溶解后，用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，过滤除菌，－20℃保存。

噻唑蓝(MTT)溶液

取MTT50mg，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液10ml溶解后，60℃水浴助溶，过滤除菌。分装避光保存于冷处，使用不超过两周(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)

培养用品的清洗和灭菌：

玻璃器皿：新的器皿先用洗涤剂彻底清洗，晾干，使用后的玻璃器皿应立即浸入清水中，避免器皿内蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗。浸泡时应将器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。用洗涤剂彻底清洗，晾干。

晾干后的器皿放入铬酸洗液中浸泡过夜，最少不低于6小时。浸泡时应将器皿内部完全充满洗液，不留气泡。

浸泡后的器皿清洗：第一步，使用流水(自来水)彻底冲洗，灌满、倒掉，须重复十次以上，直至洗液全部冲洗干净，不留任何残迹为止，再用纯化水冲洗6至8遍，烘箱内烘干。

灭菌：干热灭菌180℃2小时。

胶塞和盖子等杂物均不能用洗液浸泡，新的先用自来水冲洗干净，再进行常规清洗，使用后的胶塞、盖子应及时浸泡在清水中，然后用洗涤剂刷洗，再用1％稀盐酸浸泡30min，自来水冲洗，再用纯化水冲洗4至6遍。晾干。用牛皮纸包好。

灭菌：高压灭菌121℃20min。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1细胞活性的检测

所用样品为促肝细胞生长素肠溶胶囊，样品来源为杭州华津药业股份有限公司。

供试品溶液的制备取供试品(预防和/或治疗肝脏疾病的药物，本实施例中为促肝细胞生长素肠溶胶囊)适量，用水稀释成10mg/ml，用无菌过滤头过滤后，用RPMI－1640检测液制成每1ml中含多肽100μg的溶液。

测定：

试验前用75％乙醇或0.2％新洁尔灭擦拭超净工作台，再打开超净工作台的紫外灯半个小时。

把冷藏在冰箱内的(1)RPMI-1640培养液(2)1640检测液(3)0.25％胰蛋白酶－乙二胺四醋酸二钠消化液放在37℃的水浴锅内复温加热。

移液枪、枪头、96孔细胞培养板、0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)、针筒和一次性0.22的滤膜及PBS经75％乙醇擦拭后放在超净工作台，打开紫外灯照射30min。

进入测定室，带上口罩，穿上实验服，带上手套。用75％酒精擦拭手套。打开二氧化碳培养箱，把细胞瓶取出，放到倒置显微镜上看细胞生长如何，瓶底长满80％为佳(要求用10％小牛血清培养液培养L-02细胞至对数增长期)，弃去培养液，先用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.3)清洗细胞2次，用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化(消化时间大约5min，瓶底出现网状即可)加10％小牛血清检测液终止消化转移至15ml离心管中1500转离心3分钟。弃上清，加入10％小牛血清检测液稀释至每1ml中含(2.5×10⁴/mL～4.0×10⁴/mL)个细胞(计数板中间的大方格四角均对应有十六个中方格，共计四角细胞之和为10～16个即可)，将上述细胞悬液在96孔细胞培养板上铺板，每孔100μl，其中留3孔加10％小牛血清检测液100μl作为空白对照，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3.5小时使其贴壁。3.5小时后供试品组，每孔加供试品溶液100μl，每批供试品均做3孔，细胞对照组和空白对照组每孔分别加RPMI-1640检测液100μl，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养44小时,结束培育后取出培养板，吸去培养液，每孔加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)洗一次，然后再在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液(pH7.3)100μl和MTT溶液20μl，继续培养4h。培养结束后，弃尽培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜，在摇床上低速摇匀10min，在酶标仪上以570nm的波长处分别测定其吸收度A值。

计算：

配制方法：取2颗胶囊(50mg多肽每颗)，加入20ml纯化水使溶解，过滤后，用RPMI-1640检测液制成每1ml中含多肽100μg的溶液。

按照L02正常肝细胞活性检测方法进行检测，其结果如下表。

实验结果见表1。

表1

结果表明，L02正常肝细胞的刺激指数较高，该方法可行。

实施例2

改变细胞浓度，保持实施例1的其它条件不变，用同一个样品，比较当细胞浓度改变时其活性的变化。

实验结果见表2。

表2

通过改变细胞浓度，其刺激指数均在3以上，该L02正常肝细胞用于促肝类药物活性检测具有较好的效果。

实施例3

保持实施例1的其它条件不变，改变使用的培养基。

实验结果见表3。

表3

注：^*示与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)；^#示与对照组相比具有极显著差异(P＜0.01)。

当用RPMI-1640培养基(+Gln)时，细胞生长快，且供试品和对照组的吸光度值高于RPMI-1640培养基(-Gln)，但RPMI-1640培养基(+Gln)的供试品和对照组之间差距不大，刺激指数较低，与RPMI-1640培养基(-Gln)相比具有显著差异(P＜0.05)，因此培养基选用RPMI-1640培养基(-Gln)。

实施例4

保持实施例1的其它条件不变，改变检测培养基所使用的血清，分别用四季青的新生牛血清和Gibco的胎牛血清。

实验结果见表4。

表4

注：^*示与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)；^#示与对照组相比具有极显著差异(P＜0.01)。

从表4中可知胎牛血清组刺激指数比四季青新生牛血清小，具有显著差异(P＜0.05)。胎牛血清组细胞对照组和供试品组细胞都长的较快，四季青小牛血清细胞对照组细胞生长较慢，表明促肝细胞生长素含有一些活性物质起到和胎牛血清的营养成分一致效果，弥补了四季青新生牛血清缺少的活性成分。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.组合物在制备利用L02人正常肝细胞检测促肝细胞生长素的制剂中的应用；所述组合物由不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养基和四季青的新生牛血清组成；所述四季青的新生牛血清与不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养基的体积比为1:9，所述L02人正常肝细胞细胞数为2.5×10⁴/mL～4.0×10⁴/mL。

2.试剂盒在利用L02人正常肝细胞检测促肝细胞生长素中的应用；所述试剂盒包括权利要求1中所述的组合物和制剂中可用的辅料。

3.一种细胞活性的检测方法，其特征在于，取如权利要求1中所述的组合物或如权利要求2中所述的试剂盒与L02人正常肝细胞混合，细胞数为2.5×10⁴/mL～4.0×10⁴/mL，培养，检测L02人正常肝细胞活性。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述培养的时间为3.5h。