CN109536557A - 一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其包括以下步骤：（1）将海藻干燥和粉碎，加入冷水和石英砂，在研磨得到海藻浆液；（2）将步骤1得到的海藻浆液离心并且分离收集上清；（3）向收集的上清液中加入硫酸铵粉末，将上清液避光沉淀，离心，得到蛋白沉淀；（4）将步骤3得到的蛋白沉淀溶于磷酸缓冲液中，加入弹性蛋白酶和胰蛋白酶酶解，并且使用透析方法来进行脱盐；（5）将步骤4得到的酶解和脱盐后的蛋白肽溶液冷冻干燥，得到藻胆蛋白多肽粉。本发明的方法能够有效从海藻中提取出藻胆蛋白，并且将其进行水解处理，得到质量优越的多肽粉。
Description
技术领域
本发明涉及肽的制备，尤其是一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法。
背景技术
藻胆蛋白主要包括藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白。藻胆蛋白是一种非常重要的光动力药物的原料，特有的光敏效应可辅助激光治癌，在病灶部位富集，吸收光后高效产生自由基和活泼态氧，从而实现对肿瘤细胞的杀伤。有光毒性而没有暗毒性，在人体内代谢快，藻胆蛋白还具有抗氧化清除自由基和提高免疫力的功效。藻胆蛋白可作为功能因子用于保健食品和功能食品及特殊饲料，同时还是理想的天然色素，可大量用于食品工业和化妆品工业等，无毒副作用，是安全的添加剂。
近期藻红蛋白的生产基本由美国Sigma公司垄断。国内有以红毛菜、紫球藻和螺旋藻作为原料提取藻红蛋白的报导，现在仍处于研究阶段，未有成品进入市场销售。目前，市场可以购买的藻胆蛋白往往品质不高，除非使用凝胶色谱进行分离，很难得到纯度较高的藻胆蛋白，这也限制了藻胆蛋白的深度工业使用。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种容易消化吸收的藻胆蛋白多肽的制备方法。
在本发明的一个方面，提供了一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
（1）将10重量份海藻干燥和粉碎，加入2000-4000重量份0-6摄氏度的冷水和50-100重量份的石英砂，在0-6摄氏度下研磨30-60分钟，得到海藻浆液；
（2）将步骤1得到的海藻浆液在3000-5000转/分下离心30-60分钟，并且分离收集上清；
（3）向收集的上清液中加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵在上清液中的浓度达到45-65%，将上清液置于0-6摄氏度下避光沉淀2-6小时，在0-6摄氏度和3000-5000转/分下进行离心，得到蛋白沉淀；
（4）将步骤3得到的蛋白沉淀溶于pH为8-9的磷酸缓冲液中，加入弹性蛋白酶和胰蛋白酶在30-40摄氏度下酶解2-4小时，并且使用透析方法来进行脱盐；
（5）将步骤4得到的酶解和脱盐后的蛋白肽溶液冷冻干燥，得到藻胆蛋白多肽粉。
在本发明优选的方面，在步骤1中，将10重量份海藻干燥和粉碎，加入3200重量份4摄氏度的冷水和60重量份的石英砂，在4摄氏度下研磨40分钟，得到海藻浆液。
在本发明优选的方面，在步骤2中，将步骤1得到的海藻浆液在4500转/分下离心40分钟，并且分离收集上清。
在本发明优选的方面，在步骤3中，向收集的上清液中加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵在上清液中的浓度达到55%，将上清液置于4摄氏度下避光沉淀4小时，在4摄氏度和4500转/分下进行离心，得到蛋白沉淀。
在本发明优选的方面，在步骤4中，将步骤3得到的蛋白沉淀溶于pH为8.5的磷酸缓冲液中，加入弹性蛋白酶和胰蛋白酶在38摄氏度下酶解3.5小时，并且使用透析方法来进行脱盐。
在本发明优选的方面，在步骤1中，所述的海藻选自条斑紫菜、坛紫菜、红藻、蓝藻、钝顶螺旋藻。
在本发明优选的方面，在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入20-40重量份的丙氨酸。
在本发明优选的方面，在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入32重量份的丙氨酸。
在本发明优选的方面，在步骤3中，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入10-20g/L的硫酸镁，5-10g/L的乙醇。
在本发明优选的方面，在步骤3中，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入14g/L的硫酸镁，8g/L的乙醇。
在本发明优选的方面，在步骤3中，避光沉淀过程中不对上清液进行扰动。
本发明的方法能够有效从海藻中提取出藻胆蛋白，并且将其进行水解处理，得到质量优越的多肽粉，在食品加工和保健品加工领域具有广泛的用途。
具体实施方式
除非另外地说明，本发明中的弹性蛋白酶和胰蛋白酶均购自安徽陆荣生物技术有限公司。所述的弹性蛋白酶和胰蛋白酶的添加量均为4000U/mL。
除非另外地说明，海藻系发明人采购自本地海鲜市场的坛紫菜，并且所有实施例和对比例的海藻均为粉碎之后混合均匀后均匀称取的，其种类和品质完全一致。
除非另外地说明，在步骤3中，避光沉淀过程中不对上清液进行扰动，并且该避光沉淀过程在冰箱中完成。
实施例1
在本实施例中，一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将10千克海藻干燥和粉碎，加入3200千克4摄氏度的冷水和60千克的石英砂，在4摄氏度下研磨40分钟，得到海藻浆液；
（2）将步骤1得到的海藻浆液在4500转/分下离心40分钟，并且分离收集上清；
（3）向收集的上清液中加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵在上清液中的浓度达到55%，将上清液置于4摄氏度下避光沉淀4小时，在4摄氏度和4500转/分下进行离心，得到蛋白沉淀；
（4）将步骤3得到的蛋白沉淀溶于pH为8.5的磷酸缓冲液中，加入弹性蛋白酶和胰蛋白酶在38摄氏度下酶解3.5小时，并且使用透析方法来进行脱盐；
（5）将步骤4得到的酶解和脱盐后的蛋白肽溶液冷冻干燥，得到藻胆蛋白多肽粉。
实施例2
在本实施例中，一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将10千克海藻干燥和粉碎，加入4000千克6摄氏度的冷水和100千克的石英砂，在6摄氏度下研磨30分钟，得到海藻浆液；
（2）将步骤1得到的海藻浆液在5000转/分下离心30分钟，并且分离收集上清；
（3）向收集的上清液中加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵在上清液中的浓度达到65%，将上清液置于6摄氏度下避光沉淀2小时，在6摄氏度和5000转/分下进行离心，得到蛋白沉淀；
（4）将步骤3得到的蛋白沉淀溶于pH为9的磷酸缓冲液中，加入弹性蛋白酶和胰蛋白酶在40摄氏度下酶解2小时，并且使用透析方法来进行脱盐；
（5）将步骤4得到的酶解和脱盐后的蛋白肽溶液冷冻干燥，得到藻胆蛋白多肽粉。
实施例3
在本实施例中，一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将10千克海藻干燥和粉碎，加入2000千克0摄氏度的冷水和50千克的石英砂，在0摄氏度下研磨60分钟，得到海藻浆液；
（2）将步骤1得到的海藻浆液在3000转/分下离心60分钟，并且分离收集上清；
（3）向收集的上清液中加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵在上清液中的浓度达到45%，将上清液置于0摄氏度下避光沉淀6小时，在0摄氏度和3000转/分下进行离心，得到蛋白沉淀；
（4）将步骤3得到的蛋白沉淀溶于pH为8的磷酸缓冲液中，加入弹性蛋白酶和胰蛋白酶在30摄氏度下酶解4小时，并且使用透析方法来进行脱盐；
（5）将步骤4得到的酶解和脱盐后的蛋白肽溶液冷冻干燥，得到藻胆蛋白多肽粉。
实施例4
本实施例和实施例1的区别在于，在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入32重量份的丙氨酸。
实施例5
本实施例和实施例1的区别在于，在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入40重量份的丙氨酸。
实施例6
本实施例和实施例1的区别在于，在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入20重量份的丙氨酸。
实施例7
本实施例和实施例1的区别在于，在步骤3中，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入14g/L的硫酸镁，8g/L的乙醇。
实施例8
本实施例和实施例1的区别在于，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入10g/L的硫酸镁，10g/L的乙醇。
实施例9
本实施例和实施例1的区别在于，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入20g/L的硫酸镁，5g/L的乙醇。
实施例10
本实施例和实施例1的区别在于：
（1）在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入32重量份的丙氨酸。
（2）在步骤3中，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入14g/L的硫酸镁，8g/L的乙醇。
实施例11
本实施例和实施例1的区别在于：
（1）在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入40重量份的丙氨酸。
（2）在步骤3中，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入14g/L的硫酸镁，8g/L的乙醇。
对比例1
本对比例和实施例1的区别在于，不执行步骤4。
对比例2
本对比例和实施例1的区别在于，在步骤4中只使用弹性蛋白酶。
对比例3
本对比例和实施例1的区别在于，在步骤4中只使用胰蛋白酶。
一、藻胆蛋白多肽粉的重量测定试验
在本试验中，对实施例1-9的藻胆蛋白多肽粉的重量进行了称量，并且记录在表1中。
表1：实施例1-9的藻胆蛋白多肽粉的重量
从表1的数据可以看到，本发明的方法的藻胆蛋白多肽粉的回收率均在5%以上，实现了很高的藻胆蛋白回收率。值得注意的是，在研磨阶段加入丙氨酸时没有提升藻胆蛋白的回收率，但是在沉降阶段加入硫酸镁和乙醇之后，蛋白质沉降回收产率有所上升。
二、含铅量测定试验
针对人民群众普遍关心的养殖海产品含有重金属的顾虑，本申请人试验了各个实施例和对比例中藻胆蛋白产品的含铅量。本试验中，采用基体改进石墨炉原子吸收法来测定干浒苔中的铅含量。具体的试验方法参见《食品工业》杂志2015年第36卷第5期279-281页，题为《基体改进石墨炉原子吸收法测定干浒苔中的铅》一文。其中样品处理按照其1.3.1的“样品处理”部分来进行试验，并且使用二氯化铅来作为基体改进剂。铅含量测定按照1.3.3的“铅含量的测定”来进行测量。测量结果记录在表2中。其中，“相对于国家标准的百分比”按照“GB2762-2012”所规定的藻类制品铅含量1.0 mg/kg的标准来进行计算，计算基准为藻胆蛋白多肽粉中的铅含量。
表2：实施例1-11和对比例1-3的产品中的铅含量
申请人另行对原料坛紫菜进行了铅含量测定，发现其铅含量约为0.215mg/kg，远远低于国家对于藻类制品的铅含量限定要求。从表2的数据中可以看到，在经过了蛋白富集过程之后，其蛋白制品的铅含量有所提升，逼近了铅含量限定要求。在研磨阶段加入丙氨酸或者在沉降阶段加入镁离子都不能显著降低铅含量。两种手段的结合实现了铅离子的明显去除。申请人认为，在以上的条件下，对溶液中离子类型和配体类型和浓度的改变使得铅离子在蛋白质中被吸附的程度下降，实现了铅离子意想不到的浓度降低。
值得注意的是，申请人观察到实施例10-11得到的蛋白多肽粉的颜色基本为淡黄色，没有坛紫菜的紫褐色。实施例1-3，对比例1-3的蛋白多肽粉的颜色均带有一定的褐色。其他实施例的蛋白多肽粉的颜色介于淡黄色和褐色之间。
三、溶解速度试验
在本试验中，还对实施例1、实施例4、实施例7、实施例10、实施例11和对比例1-3的蛋白/多肽粉进行了溶解速度试验。分别称取以上的实施例或者对比例的最终产品7克，并且加入93mL去离子水，在20摄氏度下以80转/分的速度使用烧杯-转子进行搅拌，每隔15分钟观察一次，并且记录各个时间点的样品的溶解情况。其中仍有絮状固体记录为“2”，半透明乳白状记录为“1”，完全清澈记录为“0”。试验数据记录在表3中。在记录到数值“0”之后，停止对该样品的观测。
表3：各试验组样品溶解速度记录
从以上的表中可以看到，本发明的各个实施例相比，具有明显更快的溶解速度，其溶解速度基本在30分钟内，可以用于很好地制作高品质的抗氧化性口服液等保健食品。
Claims (10)
1.一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
（1）将10重量份海藻干燥和粉碎，加入2000-4000重量份0-6摄氏度的冷水和50-100重量份的石英砂，在0-6摄氏度下研磨30-60分钟，得到海藻浆液；
（2）将步骤1得到的海藻浆液在3000-5000转/分下离心30-60分钟，并且分离收集上清；
（3）向收集的上清液中加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵在上清液中的浓度达到45-65%，将上清液置于0-6摄氏度下避光沉淀2-6小时，在0-6摄氏度和3000-5000转/分下进行离心，得到蛋白沉淀；
（4）将步骤3得到的蛋白沉淀溶于pH为8-9的磷酸缓冲液中，加入弹性蛋白酶和胰蛋白酶在30-40摄氏度下酶解2-4小时，并且使用透析方法来进行脱盐；
（5）将步骤4得到的酶解和脱盐后的蛋白肽溶液冷冻干燥，得到藻胆蛋白多肽粉。
2.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤1中，将10重量份海藻干燥和粉碎，加入3200重量份4摄氏度的冷水和60重量份的石英砂，在4摄氏度下研磨40分钟，得到海藻浆液。
3.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤2中，将步骤1得到的海藻浆液在4500转/分下离心40分钟，并且分离收集上清。
4.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤3中，向收集的上清液中加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵在上清液中的浓度达到55%，将上清液置于4摄氏度下避光沉淀4小时，在4摄氏度和4500转/分下进行离心，得到蛋白沉淀。
5.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤4中，将步骤3得到的蛋白沉淀溶于pH为8-9的磷酸缓冲液中，加入弹性蛋白酶和胰蛋白酶在38摄氏度下酶解3.5小时，并且使用透析方法来进行脱盐。
6.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤1中，所述的海藻选自条斑紫菜、坛紫菜、红藻、蓝藻、钝顶螺旋藻。
7.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入20-40重量份的丙氨酸。
8.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤1中，在研磨之前，还向研磨混合物中加入32重量份的丙氨酸。
9.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤3中，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入10-20g/L的硫酸镁，5-10g/L的乙醇。
10.根据权利要求1所述的一种藻胆蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于：在步骤3中，在加入硫酸铵粉末之后，还向上清液中加入14g/L的硫酸镁，8g/L的乙醇。
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