CN109529117A - 一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法 - Google Patents

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Abstract

本技术方案公开了一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，包括以下步骤：(1)溶解脱胶蚕丝得到丝素蛋白水溶液；(2)浓缩丝素蛋白水溶液得到浓度为8～45％的丝素蛋白纺丝液；(3)添加活性蛋白溶液，制得活性丝素蛋白纺丝液；(4)在温度为0～37℃的高压空气喷射流为拉伸动力，进行溶喷纺丝，并用纤维接收器接收纺丝；并且在所述纤维接收器上设有乙醇喷雾装置，所述乙醇喷雾装置对纺丝进行后处理，制得纤维支架；(5)将含有种子细胞或细胞生长因子的活性溶液打印到步骤(4)中制得纤维支架中，最终制得活性丝素蛋白生物组织工程支架。采用所述制备方法制备的活性丝素蛋白生物组织工程支架具有高的孔隙率和良好的孔道连通性，能为细胞的生长提供良好的微环境。

Description

一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法
技术领域
本技术方案属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法。
背景技术
丝素蛋白由Gly、Ala、Ser等18种氨基酸组成，具有两性电荷，是一种天然结构性蛋白。它由蚕丝经脱丝胶而得，是自然界中生物相容性、可生物降解性良好的天然高分子。
丝素蛋白生物组织工程支架因能在一定程度上模仿细胞外基质的结构和功能，为细胞提供理想的生长、增殖和分化的微环境，在短短几年内，已被广泛应用于包括软骨、骨、血管、皮肤等组织工程研究的各个领域。静电纺丝技术是目前活性丝素蛋白纤维膜的唯一制备技术，丝素蛋白生物组织工程支架的机械性能可以满足不同组织工程应用时的力学强度需求。然而，初纺得到的丝素蛋白生物组织工程支架的力学性能比较差，必须经过一定后处理工艺处理后，才能达到组织工程支架应用所需的力学强度要求。后处理工艺的存在就增加了丝素蛋白生物组织工程支架的生产成本。
静电纺技术制备丝素蛋白生物组织工程支架还具有一下劣势：(1)需要较高电压，在操作安全性方面有缺陷，不容易在工业生产中大规模应用，并且高电压会降低丝素蛋白中活性成分的活性；(2)在速度极快的静电纺丝过程中，单一的静电拉伸力作用无法促进丝素蛋白分子由水溶液状态下的无规卷曲/α-螺旋结构转变为β-折叠结构，以致丝素蛋白难以发生结晶重排，导致收集到的纤维结晶度低，力学性能差。
发明内容
本技术方案提供一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，所述制备方法能模仿自然界的动物纺丝过程，并且通所述制备方法制备的活性丝素蛋白生物组织工程支架的力学性能好。
为实现上述目的，本技术方案采用的下述技术手段。
一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，包括以下步骤：
(1)以脱胶蚕丝为原料，在40℃水浴环境下，使用溶剂溶解脱胶蚕丝2～12小时，得到丝素蛋白水溶液；
(2)将步骤(1)制得的丝素蛋白水溶液进行离心、过滤、透析和浓缩处理后，得到浓度为12～45％的丝素蛋白纺丝液；
(3)向步骤(2)中制得的丝素蛋白水溶液中加入活性蛋白溶液，制得活性丝素蛋白纺丝液，所加活性蛋白溶液中的活性蛋白浓度为5～15％；
(4)将步骤(3)制得的活性丝素蛋白纺丝液，在温度为0～37℃的高压空气喷射流为拉伸动力，进行溶喷纺丝，并用纤维接收器接收纺丝；并且在所述纤维接收器上设有乙醇喷雾装置，所述乙醇喷雾装置对纺丝进行后处理，实现纺丝纤维成型过程中丝素蛋白构象的转变，制得纤维支架；
(5)在纤维接收器之后设有细胞打印装置，将含有种子细胞或细胞生长因子的活性溶液打印到步骤(4)中制得纤维膜中，最终制得活性丝素蛋白生物组织工程支架。
进一步地，所述活性蛋白溶液中的活性蛋白为免疫球蛋白、乳铁蛋白、金属硫蛋白、超氧化物歧化酶、大豆蛋白、溶菌酶中的任一种。
进一步地，所述溶解脱胶蚕丝的溶剂为LiBr水溶液或乙醇/CaCl水溶液。
一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法还包括以下步骤：对步骤(1)制得的丝素蛋白溶液加入pH值调节剂进行pH值调节，其添加的pH值调节剂为金属离子或无机纳米粉体。
进一步地，所述金属离子为钙离子、银离子中的一种。
进一步地，所述无机纳米粉体为羟基磷灰石、磷酸三钙中的一种。
进一步地，所述乙醇喷雾装置中的乙醇喷雾速度为100～1000mL/min，且所用乙醇浓度为50～100％。
进一步地，所述纤维接收器为纤维接收平板或纤维接收滚筒；当所述纤维接收器采用的是纤维接收平板时，获得活性丝素蛋白纤维膜；当所述纤维接收器采用的是纤维接收滚筒时，获得单向拉伸且单方向有序排列的活性丝素蛋白连续长纤维膜。
进一步地，步骤(2)中所述的高压空气喷射流为经过干燥的压缩空气，其相对湿度为10％～50％。
进一步地，所用高压空气喷射流中的喷射压力为10MPa～30MPa。
本技术方案的有益效果为：本技术方案中采用在40℃水浴环境下对脱胶蚕丝溶解2～12小时，在此条件下对脱胶蚕丝进行溶解能够在保证脱胶蚕丝能够充分溶解的同时，还能保证其中的丝素蛋白不被分解，保证丝素蛋白结构的完整性；并且在丝素蛋白溶液中添加活性蛋白溶液，活性蛋白质的添加能够增强提高所述活性活性丝素蛋白生物组织工程支架的细胞相容性，并且有利于种子细胞的粘附、增殖，并且能有效地激活细胞特异的基因表达，维持细胞的表型表达；采用本技术方案中所述的制备方法制备的活性丝素蛋白生物组织工程支架中的丝素蛋白纤维的直径为微米和亚微米级别，甚至可以达到纳米级别，可以最大程度地模仿人体细胞外基质的结构；本技术方案中所述的制备方法中不需要电压，并且所述制备方法不采用有机溶剂，其操作性及安全性高，并且对环境友好，能在工业生产中大规模应用；本技术方案中在纺丝接收器上方设置了乙醇蒸汽喷雾装置对丝素蛋白纤维进行乙醇喷雾处理，这样能够促进丝素蛋白纤维中SF结构的进一步转变，从而提高其力学性能；本技术方案中所述的制备方法可以通过调节加工参数，使得制备的活性丝素蛋白生物组织工程支架中的孔隙率满足不同细胞生长的需求；采用所述制备方法制备的活性丝素蛋白生物组织工程支架具有高的孔隙率和良好的孔道连通性，并且也具有大的比表面积，能为细胞的生长提供良好的微环境，有利于细胞的粘附、分化和增殖。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，包括以下步骤：(1)将蚕茧用碳酸钠水溶液脱胶，得到脱胶蚕丝，以9mol/L的溴化锂水溶液为溶剂溶解脱胶蚕丝，在40℃水浴环境下溶解脱胶蚕丝2小时，得到丝素蛋白水溶液；(2)经离心、过滤、透析和浓缩后，获得浓度为12wt％的丝素蛋白纺丝液；(3)向步骤(2)制得的丝素蛋白纺丝液中加入浓度为5％的免疫球蛋白溶液，制得活性丝素蛋白纺丝液；(4)以温度10℃，相对湿度为10％的高压空气喷射流为拉伸动力，所用高压空气喷射流的喷射压力为30MPa，对活性丝素蛋白纺丝液进行拉伸，纤维接收器上方乙醇喷雾速度为100mL/min，且乙醇浓度为80％，所用纤维接收器为纤维接收平板，制得丝素蛋白纤维膜；(5)对步骤(4)制得的丝素蛋白纤维膜进行细胞打印，其中细胞打印液为含有浓度为2％的成纤维细胞生长因子和浓度为30％的皮肤成纤维细胞的牛血清蛋白水溶液，最后得到活性丝素蛋白纤维膜，且纤维平均直径为1μm。
实施例2
一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，包括以下步骤：(1)将蚕茧用碳酸钠水溶液脱胶，得到脱胶蚕丝，以9mol/L的溴化锂水溶液为溶剂溶解脱胶蚕丝，在40℃水浴环境下溶解脱胶蚕丝2小时，得到丝素蛋白水溶液；(2)经离心、过滤、透析和浓缩后，获得浓度为12wt％的丝素蛋白纺丝液；(3)向步骤(2)制得的丝素蛋白纺丝液中加入浓度为15％的免疫球蛋白溶液，制得活性丝素蛋白纺丝液；(4)以温度10℃，相对湿度为10％的高压空气喷射流为拉伸动力，所用高压空气喷射流的喷射压力为20MPa，对活性丝素蛋白纺丝液进行拉伸，纤维接收器上方乙醇喷雾速度为100mL/min，且乙醇浓度为50％，所述纤维接收器为纤维接收平板，制得丝素蛋白纤维膜；(5)对步骤(4)制得的丝素蛋白纤维膜进行细胞打印，其中细胞打印液为含有浓度为10％的血管内皮生长因子和浓度为30％的脐静脉内皮细胞的牛血清蛋白水溶液；最后得到活性丝素蛋白纤维膜，且纤维平均直径为2μm。
实施例3
一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，包括以下步骤：(1)将蚕茧用碳酸钠水溶液脱胶，得到脱胶蚕丝，以9mol/L的溴化锂水溶液为溶剂溶解脱胶蚕丝，在40℃水浴环境下溶解脱胶蚕丝12小时，得到丝素蛋白水溶液；(2)经离心、过滤、透析和浓缩至20wt％后，添加CaCl至丝素蛋白水溶液中钙离子浓度为0.3mol/L，继续浓缩至丝素蛋白浓度为45wt％；(3)向步骤(2)制得的丝素蛋白纺丝液中加入浓度为10％的免疫球蛋白溶液，制得活性丝素蛋白纺丝液；(4)以温度37℃，相对湿度为50％的高压空气喷射流为拉伸动力，所用高压空气喷射流的喷射压力为25MPa，对活性丝素蛋白纺丝液进行拉伸，纤维接收器上方乙醇喷雾速度为500mL/min，且乙醇浓度为100％，所用纤维接收器为纤维接收平板，制得丝素蛋白纤维膜；(5)对步骤(4)制得的丝素蛋白纤维膜进行细胞打印，其中细胞打印液为含有浓度为4％的血管内皮生长因子和浓度为30％的脐静脉内皮细胞的牛血清蛋白水溶液；最后得到活性丝素蛋白纤维膜，且纤维平均直径为10μm。
实施例4
一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，包括以下步骤：(1)将蚕茧用碳酸钠水溶液脱胶，得到脱胶蚕丝，以7mol/L的氯化钙/乙醇水溶液为溶剂溶解脱胶蚕丝，在40℃水浴环境下溶解脱胶蚕丝6小时，得到丝素蛋白水溶液；(2)经离心、过滤、透析和浓缩，得到丝素蛋白浓度为12wt％的纺丝液；(3)将改性后的纳米羟基磷灰石加入到丝素蛋白水溶液中，搅拌均匀后，浓缩至30wt％；(4)向步骤(2)制得的丝素蛋白纺丝液中加入浓度为10％的免疫球蛋白溶液，制得活性丝素蛋白纺丝液；(5)以温度37℃，相对湿度为50％的高压空气喷射流为拉伸动力，所用高压空气喷射流的喷射压力为15MPa，对活性丝素蛋白纺丝液进行拉伸，纤维接收器上方乙醇喷雾速度为500mL/min，且乙醇浓度为80％，所用纤维接收器为纤维接收平板，制得丝素蛋白纤维膜；(6)对步骤(5)制得的丝素蛋白纤维膜进行细胞打印，其中细胞打印液为含有浓度为4％的含有转化生长因子β2和浓度为20％的骨髓间充质干细胞的股形态发生蛋白水溶液，最后得到活性丝素蛋白纤维膜，且纤维平均直径为5μm。
实施例5
一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，包括以下步骤：(1)将蚕茧用碳酸钠水溶液脱胶，得到脱胶蚕丝，以7mol/L的氯化钙/乙醇水溶液为溶剂溶解脱胶蚕丝，在40℃水浴环境下溶解脱胶蚕丝12小时，得到丝素蛋白水溶液；(2)经离心、过滤、透析和浓缩，得到丝素蛋白浓度为20wt％的纺丝液；(3)向步骤(2)制得的丝素蛋白纺丝液中加入浓度为15％的免疫球蛋白溶液，制得活性丝素蛋白纺丝液；(4)以温度10℃，相对湿度为10％的高压空气喷射流为拉伸动力，所用高压空气喷射流的喷射压力为30MPa，对活性丝素蛋白纺丝液进行拉伸，纤维接收器上方乙醇喷雾速度为500mL/min，且乙醇浓度为80％，制得丝素蛋白纤维膜；(5)对步骤(4)制得的丝素蛋白纤维膜进行细胞打印，其中细胞打印液为含有浓度为5％的转化生长因子β3和浓度为25％的关节软骨细胞的骨形态发生蛋白水溶液；最后得到活性丝素蛋白纤维膜，且纤维平均直径为3μm。
以上对本技术方案的较佳实施方式进行了具体说明，但本技术方案并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本技术方案精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以脱胶蚕丝为原料，在40℃水浴环境下，使用溶剂溶解脱胶蚕丝2～12小时，得到丝素蛋白水溶液；
(2)将步骤(1)制得的丝素蛋白水溶液进行离心、过滤、透析和浓缩处理后，得到浓度为8～45％的丝素蛋白纺丝液；
(3)向步骤(2)中制得的丝素蛋白水溶液中加入活性蛋白溶液，制得活性丝素蛋白纺丝液，所加活性蛋白溶液中的活性蛋白浓度为5～15％；
(4)将步骤(3)制得的活性丝素蛋白纺丝液，在温度为0～37℃的高压空气喷射流为拉伸动力，进行溶喷纺丝，并用纤维接收器接收纺丝；并且在所述纤维接收器上设有乙醇喷雾装置，所述乙醇喷雾装置对纺丝进行后处理，实现纺丝纤维成型过程中丝素蛋白构象的转变，制得纤维支架；
(5)在纤维接收器之后设有细胞打印装置，将含有种子细胞或细胞生长因子的活性溶液打印到步骤(4)中制得纤维支架中，最终制得活性丝素蛋白生物组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，所述活性蛋白溶液中的活性蛋白为免疫球蛋白、乳铁蛋白、金属硫蛋白、超氧化物歧化酶、大豆蛋白、溶菌酶中的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，所述溶解脱胶蚕丝的溶剂为LiBr水溶液或乙醇/CaCl水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：对步骤(1)制得的丝素蛋白溶液加入pH值调节剂进行pH值调节，其添加的pH值调节剂为金属离子或无机纳米粉体。
5.根据权利要求4所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，所述金属离子为钙离子、银离子中的一种。
6.根据权利要求4所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，所述无机纳米粉体为羟基磷灰石、磷酸三钙中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，所述乙醇喷雾装置中的乙醇喷雾速度为100～1000mL/min，且所用乙醇浓度为50～100％。
8.根据权利要求1所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，所述纤维接收器为纤维接收平板或纤维接收滚筒；当所述纤维接收器采用的是纤维接收平板时，获得活性丝素蛋白纤维膜；当所述纤维接收器采用的是纤维接收滚筒时，获得单向拉伸且单方向有序排列的活性丝素蛋白连续长纤维膜。
9.根据权利要求1所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的高压空气喷射流为经过干燥的压缩空气，其相对湿度为10％～50％。
10.根据权利要求1所述的一种活性丝素蛋白生物组织工程支架的溶喷制备方法，其特征在于，所用高压空气喷射流中的喷射压力为10MPa～30MPa。
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