CN109516970B

CN109516970B - 一种新单萜环烯醚衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109516970B
Application number: CN201710855589.7A
Authority: CN
Inventors: 李红玉; 裴月娟; 李洋; 支德娟; 刘映红; 张占欣; 费冬青; 蒋云龙
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: CN109516970A

Abstract

本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种新的式Ⅰ的单萜环烯醚衍生物，其中R表示CHO或COOH或OH或CH₃，本发明还涉及该化合物的制备方法，以及具有良好的抑菌和抗肿瘤的效果。

Description

一种新单萜环烯醚衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种结构式为式Ⅰ的单萜环烯醚衍生及其制备方法及应用，该式Ⅰ中R表示CHO或COOH或OH或CH₃，所述化合物可被应用于制药领域，尤其是制备抗肿瘤和抗菌药物中的应用。

背景技术

缬草属包含约250种植物，广泛分布在世界各地，尤其是欧洲，南美和亚洲。缬草属因其含有各种类型的广富生物活性的单萜环烯醚而著名，其中一些显示有强的细胞毒和抗癌活性。蜘蛛香(拉丁名：ValerianajatamansiJones)，别名马蹄香，为多年生草本，广泛分布于中国和印度，是欧洲宽叶缬草的重要替代物。通常意义上的蜘蛛香的根常用于治疗多种疾病，比如失眠，神经疾病等。目前关于蜘蛛香的药学研究表明其含有的单萜环烯醚、倍半萜和木脂素是作为药用植物或民族药中生物活性成分研究的一部分，我们研究了蜘蛛香中的化学成分并意外地从蜘蛛香根的乙醇提取物中分离得到一种新的单萜环烯醚类衍生物式Ⅱ化合物，其骨架结构为单萜环烯醚式Ⅲ，目前单萜环烯醚式Ⅲ的骨架结构是本领域的公知常识，然而作为单萜环烯醚衍生物的式Ⅱ化合物是尚未公开的一种全新化合物，也尚未有文献公开或者能够通过常规的技术手段能够通过单萜环烯醚式Ⅲ合成得到式Ⅱ化合物，本发明为得到式Ⅱ单萜环烯醚衍生物提供了一种新的途径，另外本发明通过从蜘蛛香根中提取得到的式Ⅱ单萜环烯醚类衍生物经实验研究表明该化合物具有抑菌和抗肿瘤作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有药用价值的单萜环烯醚衍生物，包括其制备方法及在制备抑菌和抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供的新的单萜环烯醚衍生物用下述式Ⅰ表示：

其中R表示CHO或COOH或OH或CH₃。

其中优选的是R为CHO的化合物。

其中R为CHO的化合物是由蜘蛛香根中提取得到的，具体方法包括以下步骤：

(1)将蜘蛛香的干燥根粉碎，并用乙醇浸泡一周，纱布过滤取滤液，重复浸泡四次，合并四次滤液浓缩后得到乙醇提取物；

(2)将步骤(1)中的乙醇提取物分散于水中，并用乙酸乙酯重复萃取3次得乙酸乙酯提取物；

(3)将乙酸乙酯提取物进行硅胶柱色谱，用石油醚-丙酮按40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1梯度洗脱，取10:1洗脱部分得到C部分；

(4)将C部分进行硅胶色谱分离，通过以石油醚-丙酮按40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1梯度洗脱，然后分别通过薄层色谱展开，用5％的硫酸乙醇显色后合并，得到C₃部分；

(5)C₃部分由硅胶柱色谱分离，按氯仿-丙酮100:1，80:1,40:1,20:1,10:1,5:1,2:1，1:1梯度洗脱分离，取按氯仿-丙酮10:1分离得到M部分，；

(6)将M部分按氯仿-甲醇2:3的洗脱液通过葡聚糖柱色谱洗脱分离纯化后得到该化合物。

进一步地，上述步骤(1)中的乙醇浓度为95％。

R表示COOH的化合物可以上述R为CHO的产品为原料，按照化学领域常规的方法氧化得到。

R表示OH或CH₃的化合物可以上述R为CHO的产品为原料，按照化学领域常规的还原方法得到。

本发明的优点在于：

①采用本发明所述的方法不仅可在实验室小规模制备，而且可工业化大量分离得到该单萜环烯醚类衍生物，该方法所用柱材料及溶剂可反复利用，不污染环境，成本较低，产率较高，易于控制和操作，适合工业化生产。

②本发明直接从植物中提取分离得到的单萜环烯醚类衍生物是全新的化合物，目前尚未有文献公开能够通过合成得到该化合物。

③本发明所提供的单萜环烯醚类衍生物式Ⅰ化合物，当单萜环烯醚类衍生物式Ⅰ中R为CHO、COOH、OH以及CH₃的化合物对抑菌和抗肿瘤具有一定的效果。

具体实施方式(以下实施例公开了本发明的更多细节，但不希望将本发明本身限制到所述实施例)

主要实验仪器：

旋光度用Perkin Elmer 341旋光仪测定。红外光谱用Nicolet NEXUS 670光谱仪测定。核磁用Varian INOVA-600和Varian Mercury-300BB核磁共振仪测定。高分辨质谱用Thermo LTQ Orbitrap Elite质谱仪测定。葡聚糖凝胶购于Amersham Pharmacia Biotech。硅胶(200-300目)用于柱色谱，硅胶GF254(10-40μM)用于薄层色谱，均购于青岛海洋化工。薄层色谱的点用紫外和5％硫酸/乙醇溶液喷洒加热检测。

主要实验材料：

1、植物材料

蜘蛛香的根于2015年9月买自河北安国药材市场，并由兰州大学药学院李建银博士鉴别。标本(No.201509VJ)存放于兰州大学药学院药学实验室。

2、生物材料

铜绿假单胞杆菌(P.Aeruginosa)购自于美国模式培养物集存库American TypeCulture Collection(ATCC)。

金黄色葡萄球菌(S.aureus)购自于美国模式培养物集存库American TypeCulture Collection(ATCC)。

结肠腺癌细胞HT29购买自中国科学院细胞库。

黑色素瘤细胞B16购买自中国科学院细胞库。

慢性粒细胞白血病癌细胞K562购买自中国科学院细胞库。

实施例1R为CHO时的式Ⅱ化合物的制备方法

取蜘蛛香的干燥根10kg在室温下粉碎，用95％的乙醇浸泡一周，纱布过滤取滤液，重复浸泡四次，合并四次滤液浓缩后得到乙醇提取物1.3kg，并将其分散于1.5L水中，用乙酸乙酯重复萃取三次。其中取乙酸乙酯提取物409g进行硅胶柱色谱，用石油醚-丙酮按40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1梯度洗脱，依次得到六个部分A-F，C部分为石油醚-丙酮10:1洗脱得到共68g，将C部分进行硅胶色谱分离，通过以石油醚-丙酮为40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1梯度洗脱，然后分别通过薄层色谱展开，用5％的硫酸乙醇显色后合并，得到C₃部分5g，C₃部分由硅胶柱色谱分离，按氯仿-丙酮为100:1，80:1，40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1梯度洗脱分离，将其中10:1洗脱部分再由以氯仿-甲醇2:3的洗脱液通过葡聚糖柱色谱分离纯化后即得到式Ⅱ化合物11mg。

实施例2实施例1中式Ⅱ化合物的结构检测

经光谱分析和该化合物的核磁数据证明，其结构与式Ⅱ化合物所示的结构一致：

Yellow oil；[α]²⁰ _D+30.00(c 0.10,CHCl₃)；IR(KBr)ν_max:2963,1738,1647,1638,1468,1392,1183,1124,1025,763cm^–1；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃,δ,ppm,J/Hz):0.92(3H,d J＝6.6,H-10′),0.94(3H,d,J＝6.6,H-9′),0.95(3H,d,J＝6.0,H-5′),0.97(3H,d,J＝6.0,H-4′),2.11(1H,m,H-8′),2.22(1H,m,H-3′),2.26(2H,d,J＝7.2,H-7′),4.84(1H,d,J＝4.2,H-2′),5.31(2H,s,H-11),6.59(1H,d,J＝3.0,H-6),7.86(1H,d,J＝3.0,H-7),7.88(1H,s,H-3),9.16(1H,s,H-1),9.91(1H,s,H-10).13C-NMR(150MHz,CDCl3,δ,ppm):17.2(C-5′),18.6(C-4′),22.3(C-9′),22.3(C-10′),25.6(C-8′),30.0(C-3′),42.9(C-7′),60.8(C-11),76.5(C-2′),109.6(C-6),118.8(C-4),123.0(C-9),124.7(C-8),133.8(C-5),142.2(C-3),146.4(C-7),150.6(C-1),169.6(C-1′),172.8(C-6′),184.8(C-10).HRESIMS m/z361.1644[M+H]⁺(calcd.for C₂₀H₂₅O₆,361.1646).

实施例3实施例1中式Ⅱ化合物对肿瘤细胞的毒性实验

1、实验方法：MTT；

2、实验细胞：结肠腺癌细胞HT29、黑色素瘤细胞B16、慢性粒细胞白血病癌细胞K562；

3、药物处理：二甲基亚砜(DMSO)初步溶解，后用相应培养基进行倍比稀释。即HT29实验组药物用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12稀释，B16实验组药物用含10％FBS的RPMI-1640稀释，K562实验组药物用含10％FBS的RPMI-1640稀释，同时确保DMSO终浓度≤0.1％；

4、实验设定：

(1)阳性对照：抗癌药物-顺铂(pt)；

(2)阴性对照组：HT29阴性组为含10％FBS的DMEM/F12；B16阴性组为含10％FBS的RPMI-1640；K562阴性组为含10％FBS的RPMI-1640；

(3)实验组：倍比稀释的式Ⅱ化合物，该化合物来源于实施例1；

5、实验步骤：

(1)HT29、B16、K562细胞培养；①细胞复苏：将冻存在液氮罐中的细胞迅速取出，于37℃水浴快速解冻，再分别将细胞加入含10％FBS的相应培养基，HT29、B16、K562细胞对应培养基分别为DME/F12、RPMI-1640、RPMI-1640，再置于5％CO2、37℃条件下培养。培养第二天，贴壁细胞HT29、B16直接弃去过夜培养的细胞培养上清，用4mLPBS清洗后加入5mL含10％FBS的相应培养基；悬浮细胞K562在1000rpm条件下离心5min后，加入含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，置于5％CO2、37℃条件下继续培养。

②细胞传代：待细胞生长密度达培养皿体积的80-90％，此时进行细胞传代。贴壁细胞HT29、B16先弃去培养上清，用4mL PBS清洗残余培养基后，加入1mL胰酶进行消化，消化完毕，加入3mL相应培养基终止消化，轻轻吹打混合均匀。按细胞培养基:细胞重悬液体积比为9:1的比例对细胞进行传代培养。悬浮细胞K562在混合均匀后按细胞培养基与细胞悬浮液体积比为9:1的比例对细胞进行传代培养；

(2)96孔板铺板：每孔180μL，密度约为3×10⁵vc/mL，37℃，5％CO₂条件下培养24h；

(3)加样：①实验组:将待测样品按照80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL的浓度加入不同的孔内，每孔20μL，同时为了保证实验重复率，需做一组重复；②阳性对照组:将pt分别按照80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL的浓度加入不同的孔内，每孔20μL，同时为了保证实验重复率，需做一组重复；

④阴性对照组:加入20μL细胞对应的培养基，同时为了保证实验重复率，需做一组重复；

将以上各组置于37℃，5％CO₂条件下培养24h；

(4)加MTT:各孔加入20μLMTT，37℃，5％CO₂条件下继续孵育4h；

(5)加DMSO:终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解；

(6)检测：使用Thermo多功能酶标仪检测OD490；

(7)结果分析：使用SPSS 17.0进行IC₅₀结果分析。

6、实验结果：

7、结果讨论：

从上述的实验结果可以得出，在相同实验体系下，本发明中的化合物对三株肿瘤细胞具有明显的抑制作用,尤其对B16的毒性作用要远远强于阳性对照Pt，足以推断该化合物具有抗肿瘤的效果。

实施例4实施例1中式Ⅱ化合物的抑菌实验

1、实验方法：微量肉汤稀释法；

2、选择菌株：铜绿假单胞杆菌(P.Aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)；

3、药物处理：用DMSO初步溶解，后用MH肉汤培养基稀释，确保DMSO终浓度≤0.1％；

4、实验设定：

(1)阳性对照：庆大霉素(GE)；

(2)阴性对照：MH肉汤培养基；

(3)实验组：式Ⅱ化合物，该化合物来源于实施例1；

5、实验步骤：

(1)菌液培养：铜绿假单胞杆菌(P.Aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)置于100mL LB培养基中，37℃、150rpm条件培养箱培养12h；

(2)OD600值测定：利用紫外分光光度计测定OD600值，MH肉汤调整菌浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约10^8cfu/mL；

(3)上样菌液稀释：将上述菌液用MH肉汤培养基按照1:1000进行稀释，此时菌液浓度约10^5cfu/mL；

(4)药敏试验操作：

①将式Ⅱ化合物储液用MH肉汤培养基进行稀释得到浓度0.512mg/mL的式Ⅱ化合物待测液；

②无菌96孔板第1-12列加入灭菌后的MH肉汤培养基100μL；

③无菌96孔板第1列加入稀释的式Ⅱ化合物待测药液100μL，逐次倍比稀释至第11列，使每孔液体终体积是100μL；

④无菌96孔板的每一个孔内加入待测菌液100μL，此时每孔内液体终体积是200μL；

⑤无菌96孔板的第12列上4孔每孔加入100μL灭菌MH肉汤培养基作为阴性对照，第12列下4孔每孔加入100μL GE作为阳性对照；

⑥药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置37℃恒温箱培养24h；

⑦结果观察与分析：肉眼观察，若孔内菌液澄清，无菌体生长，则视为药物在该浓度下有抑菌效果，若观察到无细菌生长，则此时的药物浓度即为最小抑菌值(MIC)。

6、实验结果：

Tested菌株	P.Aeruginosa	S.aureus
			式Ⅱ化合物MIC(μg/mL)	64	128
GEMIC(μg/mL)	5	5

7、结果讨论：

从上述的实验结果可以得出，在相同实验体系下，本发明中的化合物对铜绿假单胞杆菌(P.Aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)均具有明显的抑菌效果，因此可以推断该化合物具有抑菌的效果。

Claims

1.一种化合物，其结构式为

。

2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，

包括以下步骤：

(1)将蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones)的干燥根粉碎，并用95％乙醇浸泡一周，纱布过滤取滤液，重复浸泡四次，合并四次滤液浓缩后得到乙醇提取物；

(4)将C部分进行硅胶色谱分离，通过以石油醚-丙酮按40:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1梯度洗脱，然后分别通过薄层色谱展开，用5％的硫酸乙醇显色后合并，得到C3部分；

(5)C3部分由硅胶柱色谱分离，按氯仿-丙酮100:1，80:1,40:1,20:1,10:1,5:1,2:1，1:1梯度洗脱分离，取按氯仿-丙酮10:1分离得到M部分；

3.权利要求1所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备抗铜绿假单胞杆菌(P.Aeruginosa)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)药物中的应用。

4.权利要求1所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗黑色素瘤B16细胞药物。

5.权利要求3所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备抗铜绿假单胞杆菌或金黄色葡萄球菌药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括：注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或滴丸。

6.权利要求4所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括：注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或滴丸。