CN109511681A - 一种噬菌体水剂防腐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种噬菌体水剂防腐剂及其制备方法和应用，属于微生物防腐技术领域。其技术方案要点是一种噬菌体水剂防腐剂，以重量组分计，包括以下组分：脱氢乙酸钠1‑3份、防腐剂7‑9份、水剂余量。本发明适用于副溶血性弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、地毯草黄单胞杆菌、根癌农杆菌噬菌体等菌种。本发明防腐剂具有防止细菌滋生，对噬菌体无毒害，提高噬菌体的稳定性，使其不易变质，保持效价的稳定。在实际案例中，可以对动植物病害起到良好的防治作用，特别适用于噬菌体制剂的工业大规模生产以及用户储存及田间施用过程中。

Description

一种噬菌体水剂防腐剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物防腐技术领域，更具体地说，它涉及一种噬菌体水剂防腐剂及其制备方法和应用。
背景技术
噬菌体是一类能够感染细菌的病毒，体积微小，结构简单，主要由蛋白质衣壳和内部包裹的核酸组成。噬菌体具有严格的寄生性，广泛分布于自然界，能够专一性的裂解细菌，安全性好，对机体及环境无毒副作用。
噬菌体是分子生物学领域的重要实验工具和最理想的材料，可用于防治疾病、鉴定细菌分型、筛选和检测致癌物质等。但噬菌体非常脆弱，非常容易变质。如何做好噬菌体及其制剂的防腐工作进而保证其长期保存是一项亟需解决的技术问题。
现有公开号为CN106011082A的国内专利公开了一种新型噬菌体保存保护剂以及该新型噬菌体保存保护剂的制备和应用方法。该新型噬菌体保存保护剂，通过脱脂乳、硅藻土、牛血清白蛋白、麦芽糖糊精等形成整个保存保护剂的骨架，并增加有尼泊金乙酯、苯甲酸钠或山梨酸钾等作为防腐剂。
但上述专利采用的组分繁多，成本较高，制备工艺麻烦，并且可应用噬菌体及其制剂种类有限。存在诸多使用问题，亟需本领域人员提供一种工艺简单防腐效果好无毒害的防腐剂。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种噬菌体水剂防腐剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种噬菌体水剂防腐剂，以重量组分计，包括以下组分：脱氢乙酸钠1-3份、防腐剂7-9份、水剂余量。
通过上述技术方案，本发明提供了一种无抗生素的防腐剂，在防止噬菌体变质增长细菌的同时还不会造成毒害，而且成本较低。并且为水剂，制备工艺简单，当用于对动植物的进行使用时也非常方便。
进一步的，所述防腐剂包括壳聚糖，尼泊金乙酯、苯甲酸钠或山梨酸钾。其他常用的防护剂均可以替代或组合使用。其中，壳聚糖具有提高免疫、活化细胞的作用。
一种噬菌体水剂防腐剂配制方法，制备方法如下：将脱氢乙酸钠和/或苯甲酸钠和/或山梨酸钾和/或尼泊金乙酯加水溶解，在常温下搅拌5-10分钟，即可获得防腐剂。
一种噬菌体水剂防腐剂的应用，所述防腐剂在弧菌属噬菌体、埃希氏菌属噬菌体、沙门氏菌属噬菌体、黄单胞菌属噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、葡萄球菌属噬菌体、气单胞菌属噬菌体、链球菌属噬菌体、假单胞菌属噬菌体、克雷伯氏菌属噬菌体、不动杆菌属噬菌体、丙酸杆菌属噬菌体、农杆菌噬菌体、棒形杆菌属噬菌体、李斯特菌属噬菌体、弯曲杆菌属噬菌体或梭菌属噬菌体的应用。
进一步的，所述防腐剂在副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、哈维氏弧菌噬菌体、霍乱弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、无乳链球菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体、痤疮丙酸杆菌噬菌体、根癌农杆菌噬菌体、密执安棒杆菌噬菌体、李斯特菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体或产气荚膜梭菌噬菌体的应用。
进一步的，所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticusphage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)，其中所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏编号为CCTCCNO.M2016290，副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏编号为CCTCC NO.M2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phageVP7)保藏编号为CCTCC NO.M2016289。
进一步的，所述沙门氏菌噬菌体为肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)，其保藏编号为CCTCC NO.M2015145。
进一步的，所述地毯草黄单胞菌噬菌体为地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，其保藏编号为CCTCC NO.M2018579。
进一步的，所述茄科雷尔氏菌噬菌体为茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstoniasolanacearum phage GP3)，其保藏编号为CCTCC NO.M2016635。
进一步的，所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)，保藏编号CCTCC NO.M2016535。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.通过在噬菌体中应用防腐剂的设计，能够起到让噬菌体及其组合制剂不易变质生长细菌并能持续防腐效果；
2.通过在噬菌体中应用防腐剂的设计，能够起到对噬菌体及其制剂安全使用无毒害的效果；
3.通过在噬菌体中应用防腐剂的设置，同时还起到提高噬菌体的稳定性、稳定噬菌体效价的效果；
4.本发明特别适用于噬菌体制剂的工业大规模生产以及用户储存及田间施用过程中。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
以下实例中，所涉及菌株代号均以本公司的命名方式编号。
副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO.M2016290；
副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO.M2016291；
副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO.M2016289。
地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2018年8月30日；保藏编号为CCTCC NO.M2018579。
肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO.M2015145。
金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年9月28日、保藏编号CCTCCNO.M2016535。
茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年11月10日；保藏编号为CCTCC NO.M2016635。
本发明的防腐剂配方及制备方法：将脱氢乙酸钠加水溶解，在常温下搅拌1-3分钟，即可获得本发明所需的防腐剂。
需注意的是，本发明的防腐剂还可以添加其它成分。例如，将1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖加水溶解，在常温下搅拌1-3分钟，获得防腐剂。再例如添加尼泊金乙酯、苯甲酸钠或山梨酸钾等。各组分比例可根据需求适当优化。
以下为关于本发明防腐剂的应用实验
防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48、VP7及其混合制剂的应用实验
实验例1：
静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP46的应用实验：取两组效价为5.0x1010PFU/ml的500ml副溶血性弧菌噬菌体VP46以敞口形式置于常温37℃环境中。添加终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂至其中一组。将两组副溶血性弧菌噬菌体VP46制剂静置，每8小时取样涂布，测定细菌含量，直至72小时。同时每8小时取样测定副溶血性弧菌噬菌体VP46的效价。
效价测定方法：
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体VP46按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
表1静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP46细菌含量的影响
表2静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP46效价的影响
实施例2：
摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP46的应用实验：取两组效价为5.0x1010PFU/ml的500ml副溶血性弧菌噬菌体VP46以敞口形式于常温37℃环境下，添加终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂至其中一组。将两组副溶血性弧菌噬菌体VP46于150转摇培，每8小时取样涂布，测定细菌含量，直至72小时。同时每8小时取样测定副溶血性弧菌噬菌体VP46的效价。效价测定方法：
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体VP46按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
表3摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP46细菌含量的影响
表4摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP46效价的影响
实验例3：
静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP48的应用实验：取两组效价为5.0x1010PFU/ml的500ml副溶血性弧菌噬菌体VP48以敞口形式置于常温37℃环境中。添加终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L山梨酸钾的防腐剂至其中一组。将两组副溶血性弧菌噬菌体VP48静置，每8小时取样涂布，测定细菌含量，直至72小时。同时每8小时取样测定副溶血性弧菌噬菌体VP48的效价。
效价测定方法：
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体VP48按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
表5静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP48细菌含量的影响
表6静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP48效价的影响
实施例4：
摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP48的应用实验：取两组效价为5.0x1010PFU/ml的500ml副溶血性弧菌噬菌体VP48以敞口形式于常温37℃环境下添加终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L山梨酸钾的防腐剂至其中一组。将两组副溶血性弧菌噬菌体VP48于150转摇培，每8小时取样涂布，测定细菌含量，直至72小时。同时每8小时取样测定副溶血性弧菌噬菌体VP48的效价。效价测定方法：
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体VP48按分别10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
表7摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP48细菌含量的影响
表8摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP48效价的影响
实验例5：
静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP7的应用实验：取两组效价为5.0x1010PFU/ml的500ml副溶血性弧菌噬菌体VP7以敞口形式置于常温37℃环境中。添加终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L苯甲酸钠的防腐剂至其中一组。将两组副溶血性弧菌噬菌体VP7静置，每8小时取样涂布，测定细菌含量，直至72小时。同时每8小时取样测定副溶血性弧菌噬菌体VP7的效价。
效价测定方法：
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体VP7按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
表9静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP7细菌含量的影响
表10静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP7效价的影响
实施例6：
摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP7的应用实验：取两组效价为5.0x1010PFU/ml的500ml副溶血性弧菌噬菌体VP7以敞口形式于常温37℃环境下添加终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L苯甲酸钠的防腐剂至其中一组。将两组副溶血性弧菌噬菌体VP7于150转摇培，每8小时取样涂布，测定细菌含量，直至72小时。同时每8小时取样测定副溶血性弧菌噬菌体VP7的效价。
效价测定方法：
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体VP7按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
表11摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP7细菌含量的影响
表12摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体VP7效价的影响
实验例7：
静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体组合制剂的应用实验：副溶血性弧菌噬菌体制剂由副溶血性弧菌噬菌体VP46、副溶血性弧菌噬菌体VP48、副溶血性弧菌噬菌体VP7按体积比1：1：1配置而成。取两组效价为5.0x1010PFU/ml的500ml副溶血性弧菌噬菌体组合制剂以敞口形式置于常温37℃环境中。添加终浓度2g/L脱氢乙酸钠、8g/L壳聚糖的防腐剂至其中一组。将两组副溶血性弧菌噬菌体制剂静置，每8小时取样涂布，测定细菌含量，直至72小时。同时每8小时取样测定副溶血性弧菌噬菌体组合制剂的效价。
效价测定方法：
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体组合制剂按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
表13静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体制剂细菌含量的影响
表14静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体效价的影响
实施例8：
摇培状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体制剂的应用实验：副溶血性弧菌噬菌体制剂由副溶血性弧菌噬菌体VP46、副溶血性弧菌噬菌体VP48、副溶血性弧菌噬菌体VP7按体积比1：1：1配置而成。取两组效价为5.0x1010PFU/ml的500ml副溶血性弧菌噬菌体制剂以敞口形式于常温37℃环境下添加终浓度2g/L脱氢乙酸钠、8g/L壳聚糖的防腐剂至其中一组。将两组副溶血性弧菌噬菌体制剂于150转摇培，每8小时取样涂布，测定细菌含量，直至72小时。同时每8小时取样测定副溶血性弧菌噬菌体组合制剂的效价。
效价测定方法：
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体组合制剂按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
表15静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体制剂细菌含量的影响
表16静置状态下防腐剂对副溶血性弧菌噬菌体组合制剂效价的影响
防腐剂对地毯草黄单胞菌噬菌体制剂的应用实验
实施例9：
取六组效价为7.0x109PFU/ml的500ml地毯草黄单胞菌噬菌体制剂以敞口形式静置。添加终浓度3g/L脱氢乙酸钠、7g/L壳聚糖的防腐剂至其中三组。将含有防腐剂和不含有防腐剂的对照例合并为一组，这样的三组地毯草黄单胞菌噬菌体制剂分别放置在4℃、25℃、37℃环境下，每2周取样经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，直至52周。
效价测定方法：
用SM液做稀释液，将地毯草黄单胞菌噬菌体制剂按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌地毯草黄单胞菌D1菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
结果如表17所示，4℃条件下含有防腐剂地毯草黄单胞菌噬菌体制剂存放52周效价未降低，且高于4℃条件下无防腐剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂效价；25℃下14周时含有防腐剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂效价仍具有109PFU/ml且可存活至40周，无防腐剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂32周时已丧失活性；37℃下6周时含有防腐剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂效价仍具有109PFU/ml且可存活至24周，无防腐剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂20周时已丧失活性；各保存温度下含有防腐剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂均具有较强防腐能力及较高的稳定性。
表17防腐剂对地毯草黄单胞菌噬菌体制剂效价的影响
防腐剂对沙门氏菌噬菌体制剂的应用实验
实施例10：
取六组效价为6.0x109PFU/ml的500ml沙门氏菌噬菌体制剂以敞口形式静置。添加终浓度3g/L脱氢乙酸钠、7g/L壳聚糖的防腐剂至其中三组。将含有防腐剂和不含有防腐剂的对照例合并为一组，这样的三组沙门氏菌噬菌体制剂分别放置在4℃、25℃、37℃环境下，每2周取样经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，直至52周。
效价测定方法：
用SM液做稀释液，将沙门氏菌噬菌体制剂按10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌沙门氏菌S5菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
结果如表18所示，4℃条件下含有防腐剂沙门氏菌噬菌体制剂存放52周效价未降低，且高于4℃条件下无防腐剂的沙门氏菌噬菌体制剂效价；25℃下14周时含有防腐剂的沙门氏菌噬菌体制剂效价仍具有109PFU/ml且可存活至38周，无防腐剂的沙门氏菌噬菌体制剂28周时已丧失活性；37℃下6周时含有防腐剂的沙门氏菌噬菌体制剂效价仍具有109PFU/ml且可存活至22周，无防腐剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂20周时已丧失活性；各保存温度下含有防腐剂的沙门氏菌噬菌体制剂均具有较强防腐能力及较高的稳定性。
表18防腐剂对沙门氏菌噬菌体制剂效价的影响
防腐剂对南美白对虾生长影响的攻毒实验
实施例11：
在南美白对虾的养殖池中加入终浓度为1x105CFU/ml AHPND型副溶血性弧菌对南美白对虾进行攻毒试验。然后加入终浓度为1x106PFU/ml副溶血性弧菌噬菌体制剂，分为含有防腐剂的试剂和不含有防腐剂的试剂。防腐剂选择终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂。观察2周，每日观察南美白对虾的死亡率，参见表19。并同时设置了阳性对照组(1x105CFU/ml AHPND副溶血性弧菌菌液)、阴性对照组(无攻毒处理)、防腐剂对照组(终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂，无攻毒处理)和噬菌体对照组(1x106PFU/ml溶血性弧菌噬菌体制剂，无攻毒处理)。死亡率＝(南美白对虾死亡虾数/南美白对虾总数)×100％。
如表19，使用含防腐剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂组的南美白对虾死亡率较无防腐剂的副溶血性弧菌噬菌体组的低，说明含有防腐剂的副溶血性弧菌噬菌体治疗效果更好，且防腐剂对南美白对虾无毒害作用，安全性较高。
表19防腐剂对南美白对虾死亡率的影响
防腐剂对小鸡鸡百痢的田间实验应用
实施例12：
在小鸡的养殖饮用水槽中加入终浓度为1x105CFU/ml鸡白痢沙门氏菌对小鸡进行攻毒试验。然后加入终浓度为1x106PFU/ml沙门氏菌噬菌体制剂，分为含有防腐剂的试剂和不含有防腐剂的试剂。防腐剂选择终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂。观察2周，每日观察小鸡的死亡率，参见表20。并同时设置了阳性对照组并同时设置了阳性对照组(1x105CFU/ml鸡白痢沙门氏菌菌液)、阴性对照组(无攻毒处理)、防腐剂对照组(终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂，无攻毒处理)和噬菌体对照组(1x106PFU/ml沙门氏菌噬菌体制剂，无攻毒处理)。死亡率＝(小鸡死亡数/小鸡总数)×100％。
如表20，使用含防腐剂的沙门氏菌噬菌体制剂组的小鸡死亡率较无防腐剂的沙门氏菌噬菌体组的低，说明含有防腐剂的沙门氏菌噬菌体治疗效果更好，且防腐剂对小鸡无毒害作用，安全性较高。
表20防腐剂对小鸡死亡率的影响
防腐剂对仔猪油皮病的应用
实施例13：
将仔猪表皮用砂纸打磨至至轻微创伤，在其创口处涂抹终浓度为1x105CFU/ml金黄色葡萄球菌对仔猪进行攻毒试验。然后加入终浓度为1x106PFU/ml金黄色葡萄球菌噬菌体制剂，分为含有防腐剂的试剂和不含有防腐剂的试剂。防腐剂选择终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂。观察2周，每日观察仔猪表皮的发病率，参见表21。并同时设置了阳性对照组1x105CFU/ml金黄色葡萄球菌菌液)、阴性对照组(无攻毒处理)、防腐剂对照组(终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂，无攻毒处理)和噬菌体对照组(1x106PFU/ml金黄色葡萄球菌噬菌体制剂，无攻毒处理)。发病率＝(仔猪病猪数量/仔猪总数)×100％。
如表21，使用含防腐剂的金黄色葡萄球菌噬菌体制剂组的仔猪发病率较无防腐剂的金黄色葡萄球菌噬菌体组的低，说明含有防腐剂的金黄色葡萄球菌噬菌体治疗效果更好，且防腐剂对仔猪无毒害作用，安全性较高。
表21防腐剂对仔猪油皮病发病率的影响
防腐剂对姜瘟病的应用
实施例14：
在生姜根部灌注终浓度为1x105CFU/ml茄科雷尔氏菌对生姜进行攻毒试验。然后加入终浓度为1x106PFU/ml茄科雷尔氏菌噬菌体制剂，分为含有防腐剂的试剂和不含有防腐剂的试剂。防腐剂选择终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂。观察2周，每日观察生姜的死亡率，参见表22。并同时设置了阳性对照组(1x105CFU/ml茄科雷尔氏菌菌液)、阴性对照组(无攻毒处理)、防腐剂对照组(终浓度1.5g/L脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂，无攻毒处理)和噬菌体对照组(1x106PFU/ml茄科雷尔氏菌噬菌体制剂，无攻毒处理)。死亡率＝(生姜死亡数/生姜总数)×100％。
如表22，使用含防腐剂的茄科雷尔氏菌噬菌体制剂组的生姜死亡率较无防腐剂的茄科雷尔氏菌噬菌体组的低，说明含有防腐剂的茄科雷尔氏菌噬菌体治疗效果更好，且防腐剂对生姜无毒害作用，安全性较高。
表22防腐剂对生姜死亡率的影响
防腐剂对细菌生长的动态影响
实施例15：
将终浓度1.5g/L为脱氢乙酸钠、5g/L壳聚糖的防腐剂，终浓度102CFU/ml无乳链球菌加到200ml TSB中，37℃下150转摇培8小时，每1小时取样涂布，涂布在TSA上，37℃过夜培养，记录细菌数量(表23)。涂布结果菌落数为0CFU/ml，TSB中无细菌生长。
实施例16：
将终浓度102CFU/ml无乳链球菌加到200ml TSB中，37℃下150转摇培8小时，每1小时取样涂布，涂布在TSA上，37℃过夜培养，记录细菌数量(表23)。涂布结果为TSA上菌落数量随取样时间增加而递增，8小时后TSB中细菌数量可达108CFU/ml。
实施例17：
空白对照，在37℃下，150转摇培8小时，每1小时取样涂布，涂布在TSA上，37℃过夜培养，记录细菌数量(表23)。
表23实施例15-17中防腐剂对无乳链球菌细菌数量的动态影响
综合实施例1-17，本发明防腐剂可防止细菌滋生，对噬菌体无毒害。在一定程度上对噬菌体起保护作用，提高噬菌体的稳定性，使其不易变质，保持效价的稳定。在实际案例中，可以对动植物病害起到良好的防治作用。本发明特别适用于噬菌体制剂的工业大规模生产以及用户储存及田间施用过程中。
本发明防腐剂的应用并不局限于上述实施例1-17中所列菌种，还可以包括溶藻弧菌噬菌体、哈维氏弧菌噬菌体、霍乱弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体、痤疮丙酸杆菌噬菌体、根癌农杆菌噬菌体、密执安棒杆菌噬菌体、李斯特菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体、产气荚膜梭菌噬菌体等菌种。
当然，上述菌种所在菌属，例如弧菌属噬菌体、埃希氏菌属噬菌体、沙门氏菌属噬菌体、黄单胞菌属噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、葡萄球菌属噬菌体、气单胞菌属噬菌体、链球菌属噬菌体、假单胞菌属噬菌体、克雷伯氏菌属噬菌体、不动杆菌属噬菌体、丙酸杆菌属噬菌体、农杆菌噬菌体、棒形杆菌属噬菌体、李斯特菌属噬菌体、弯曲杆菌属噬菌体或梭菌属噬菌体等菌属，本发明防腐剂均可在其中得到良好应用。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种噬菌体水剂防腐剂，其特征在于：以重量组分计，包括以下组分：
脱氢乙酸钠1-3份、防腐剂7-9份、水剂余量。
2.根据权利要求1所述的一种噬菌体水剂防腐剂，其特征在于：所述防腐剂还包括壳聚糖、尼泊金乙酯、苯甲酸钠或山梨酸钾。
3.一种根据权利要求1所述的噬菌体水剂防腐剂配制方法，其特征在于：制备方法如下：将脱氢乙酸钠和防腐剂加水溶解，在常温下搅拌1-3分钟，即可获得防腐剂。
4.根据权利要求1所述的一种噬菌体水剂防腐剂的应用，其特征在于：所述防腐剂在弧菌属噬菌体、埃希氏菌属噬菌体、沙门氏菌属噬菌体、黄单胞菌属噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、葡萄球菌属噬菌体、气单胞菌属噬菌体、链球菌属噬菌体、假单胞菌属噬菌体、克雷伯氏菌属噬菌体、不动杆菌属噬菌体、丙酸杆菌属噬菌体、农杆菌噬菌体、棒形杆菌属噬菌体、李斯特菌属噬菌体、弯曲杆菌属噬菌体或梭菌属噬菌体中的应用。
5.根据权利要求4所述的一种噬菌体水剂防腐剂的应用，其特征在于：所述防腐剂在副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、哈维氏弧菌噬菌体、霍乱弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、无乳链球菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体、痤疮丙酸杆菌噬菌体、根癌农杆菌噬菌体、密执安棒杆菌噬菌体、李斯特菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体或产气荚膜梭菌噬菌体的应用。
6.根据权利要求4所述的一种噬菌体水剂防腐剂的应用，其特征在于：所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)，其中所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)的保藏编号为CCTCC NO.M2016290，副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏编号为CCTCC NO.M2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)保藏编号为CCTCCNO.M2016289。
7.根据权利要求4所述的一种噬菌体水剂防腐剂的应用，其特征在于：所述沙门氏菌噬菌体为肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)，其保藏编号为CCTCC NO.M2015145。
8.根据权利要求4所述的一种噬菌体水剂防腐剂的应用，其特征在于：所述地毯草黄单胞菌噬菌体为地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，其保藏编号为CCTCC NO.M2018579。
9.根据权利要求4所述的一种噬菌体水剂防腐剂的应用，其特征在于：所述茄科雷尔氏菌噬菌体为茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)，其保藏编号为CCTCC NO.M2016635。
10.根据权利要求4所述的一种噬菌体水剂防腐剂的应用，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)，保藏编号CCTCC NO.M2016535。
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