CN109504764A - 一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因snp位点的检测***与应用 - Google Patents
一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因snp位点的检测***与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测***与应用。本发明的检测***含有6个工作单元,分别是(1)PCR反应单元、(2)PCR产物碱性磷酸酶处理单元、(3)单碱基延伸反应单元、(4)纯化单元、(5)芯片点样单元、(6)质谱检测及数据输出单元。本发明的PCR反应单元含有23对特异性引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑46所示。该23对特异性引物可检测与癫痫用药相关10个基因的23种变异位点。本发明还提供了上述检测***在检测癫痫用药相关基因并指导用药中的应用,检测结果准确、针对性强、灵敏度高、特异性强,简便快速,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及PCR检测技术和质谱检测技术领域,特别是涉及一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测***及其应用。
背景技术
癫痫是常见的慢性神经***脑部疾患。其发病机制目前尚未完全阐明。一般认为,兴奋性和抑制性神经传递的失调是导致癫痫发作的主要原因。目前,世界上约有5000多万人患有癫痫病,我国有900万人左右患有此病。癫痫发病率是指每年每10万人口中新发现的癫痫病人数。世界上每年会出现150万癫痫新病人,我国每年也有近30万人患此病。研究表明,癫痫具有遗传性。不同的患者即使具有相同的临床症状,药物的治疗结果也可能因人而异。这种治疗结果的不同可能至少部分由遗传因素引起。原发性癫痫的遗传有的是单基因遗传,多数情况下是多基因遗传,但不一定都有临床发作。
目前,对于癫痫的发作主要采用抗癫痫药物(anti-epileptic drugs,AEDs)来控制,药物治疗的机制主要是使兴奋性和抑制性神经传递恢复平衡。AEDs的治疗往往为一个长期过程,有的甚至伴随患者的终生。
对于患有癫痫的个体而言,关键的问题在于,发作是否能够得到完全控制,AEDs的最佳剂量是什么,是否会有严重的不良反应发生。在癫痫的治疗过程中,临床发现AEDs的代谢存在较大的个体差异,不同个体所用的药物剂量相差4倍,即使患者发作类型相同,应用相同剂量的同种AEDs治疗,其血药浓度与疗效也相差甚远,有的患者用到最大耐受剂量时,仍不能控制发作,而有的患者应用常规剂量,就会出现严重的药物副作用。同一种癫痫综合征,用相同的AEDs进行治疗,治疗效果和预后也可能完全不同。多种因素导致了这些差异,而这种差异是无法预测的。因此对于AEDs而言,个体化给药显得尤为重要。
遗传因素无疑是所有影响因素中的一个重要部分,药物基因组学为个体化给药的研究提供了一个新的手段,以药物效应及安全性为目标,研究各种基因突变与药效及安全性的关系。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异,在人群中这种变异的发生频率至少大于1%,否则被认为是点突变。人类遗传基因的各种差异,有90%都可归因于SNP所引起的基因变异。药物基因组学的终极目标是用个体基因层面的差异来预测药物的反应和有效性。
飞行质谱技术是一种先进的基因分析工具,通过引物延伸反应与灵敏、可靠的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术相结合,实现基因分型检测。根据应用需要,对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时,具有最佳性价比。特别适合于有限数量的研究位点已经确定的情况。
该技术是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出含有待测SNP位点的目的DNA片段,然后用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase,SAP)去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)和引物,再加入单碱基延伸引物,其3‘末端碱基紧挨SNP位点,且与目的片段上的碱基完全互补,采用四种ddNTP替代dNTP,这样,探针在SNP位点处仅延伸一个碱基,连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。目前没有基于飞行质谱技术来检测癫痫用药相关基因突变的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测***及其应用。
本发明的基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测***,含有6个工作单元,分别是(1)PCR反应单元、(2)PCR产物碱性磷酸酶处理单元、(3)单碱基延伸反应单元、(4)纯化单元、(5)芯片点样单元、(6)质谱检测及数据输出单元;所述(1)PCR反应单元含有SEQ ID NO.1-46所示的引物。
所述(3)单碱基延伸反应单元含有SEQ ID NO.47-69所示的单碱基延伸引物。
所述癫痫用药相关基因分别为SCN1A,SCN2A,GABRA1,ABCB1,ABCC2,EPHX1,UGT1A6/UGT1A4,UGT2B7,CYP2C9,CYP2C19。
进一步地,本发明的检测***,其工作程序包括以下步骤:
(1)PCR反应单元:以待测样品的基因组DNA为模板,以SEQ ID NO.1-46所示的引物按照编码的奇数偶数两两顺序组合的方式,分别进行23次PCR反应;
(2)PCR产物中游离的dNTPs处理单元:去除PCR产物体系中游离的dNTPs;
(3)单碱基延伸反应单元:向步骤(2)处理过的PCR反应体系中加入单碱基延伸反应混合液进行单碱基延伸反应,所述延伸反应混合液中含有23条单碱基延伸反应引物,使用方式是每条单碱基延伸反应引物对应一对特异引物扩增的PCR产物;
例如SEQ ID NO.1、24的引物的扩增产物使用SEQ ID NO.47的单碱基延伸反应引物进行延伸反应;
SEQ ID NO.2、25的引物的扩增产物使用SEQ ID NO.48的单碱基延伸反应引物进行延伸反应,以此类推,至SEQ ID NO.23、46的引物的扩增产物使用SEQ ID NO.69的单碱基延伸反应引物进行延伸反应。
(4)纯化单元:将(3)单碱基延伸反应单元的产物进行纯化;
(5)芯片点样单元:将纯化后的单碱基延伸反应产物移至芯片点样;
(6)质谱检测及数据输出单元:点样后的芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析,获得基因分型图。
本发明检测***的(1)中PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃20s,56℃30s,72℃60s,45个循环;72℃延伸3min。
本发明检测***的(3)中单碱基延伸反应混合液由水、iPLEX试剂、iPLEX终止试剂、单碱基延伸引物、iPLEX酶组成;所述单碱基延伸反应条件为:
(a)94℃预变性5min;
(b)94℃5s;
(c)52℃30s,80℃5s,共5个循环;
重复步骤(b)和(c),共40个循环;
(d)72℃延伸3min。
本发明检测***的(6)中根据基因分型图中每个待测样品23个热点变异位点的基因型别判断癫痫相关基因是否发生突变。
本发明还提供了一种用于检测癫痫用药相关基因突变的检测试剂盒,含有23对特异性引物和23条单碱基延伸引物;所述23对特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-46所示,引物按照编码的奇数偶数两两顺序组合的方式成对;所述23条单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.47-69所示,且根据编码顺序依次与前述23对特异性引物逐一对应搭配使用。例如,SEQ ID NO.1-2的引物与SEQ ID NO.47的单碱基延伸反应引物构成一个反应组合,SEQ ID NO.3-4的引物与SEQ ID NO.48的单碱基延伸反应引物构成一个反应组合,SEQ ID NO.5-6的引物与SEQ ID NO.49的单碱基延伸反应引物构成一个反应组合,以此类推。
本发明提供了一种引物组合在制备用于检测癫痫用药相关基因突变检测试剂盒中的应用,所述引物组合含有23对特异性引物和23条单碱基延伸引物;所述23对特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-46所示,引物按照编码的奇数偶数两两顺序组合的方式成对;所述23条单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.47-69所示,且根据编码顺序依次与前述23对特异性引物逐一对应搭配使用。
本发明提供了上述检测***或检测试剂盒在指导癫痫用药中的应用。
本发明的有益效果在于,本发明根据抗癫痫药物的特点,结合现有研究报道,从三方面对相关基因进行选择,包括癫痫药物作用的靶点基因(SCN1A,SCN2A,GABRA1)、参与癫痫药物转运与分布的基因(ABCB1,ABCC2)、参与癫痫药物代谢与清除的基因(EPHX1,UGT1A6/UGT1A4,UGT2B7,CYP2C9,CYP2C19),共计10个基因。之后确定这10个基因中与疾病相关的热点变异位点共计23个,作为检测的目的位点。本发明通过反复筛选和优化反应条件,设计并选择SEQ ID NO.1-46,SEQ ID NO.47-69的引物序列在扩增体系中,不仅能够克服同一体系中多条引物互相干扰和制约或错配的问题,还能够保证各对引物的特异性和准确度。
本发明克服现有技术的缺点与不足,提供的一种基于Agena Massarray飞行质谱***分析癫痫药物相关基因谱的检测***。通过利用Agena Massarray飞行质谱平台,能够成功检测10个与癫痫药物在人体内作用、转运与代谢相关的基因、共涉及23种热点变异位点。针对这23个热点变异位点,基于飞行质谱技术的原理和特点,设计扩增引物对以及延伸引物(SEQ ID NO.1-46,SEQ ID NO.47-69),见表1。用于后续PCR扩增反应以及单碱基延伸反应。建立了基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测方法,进一步可用于检测癫痫用药相关基因并指导用药中的应用,检测结果准确、针对性强、灵敏度高、特异性强,简便快速,临床应用前景良好。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段;若未特别指明,实施例中所用试剂均为市售。
实施例1用于检测癫痫用药相关基因变异位点的特异性引物的设计
1、从三方面对癫痫用药相关基因进行选择,包括癫痫药物作用的靶点基因(SCN1A,SCN2A,GABRA1)、参与癫痫药物转运与分布的基因(ABCB1,ABCC2)、参与癫痫药物代谢与清除的基因(EPHX1,UGT1A6/UGT1A4,UGT2B7,CYP2C9,CYP2C19),共计10个基因。
2、确定这10个基因中与疾病相关的热点变异位点共计23个,作为检测的目的位点。
3、针对上述23个热点变异位点,基于飞行质谱技术的原理和特点,设计扩增引物对(SEQ ID NO.1-46,SEQ ID NO.47-69),以及延伸引物,见表1。表1中的引物对应的数字为序列的编码(例如1为SEQ ID NO.1,24为SEQ ID NO.24),其编码号与序列表编码一致。
表1
表2
实施例2基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测方法的建立
使用血液组织DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit,QIAGEN),提取血液样本中的DNA。使用NanoDrop2000仪器进行OD值检测,1.25%琼脂糖凝胶电泳检测,DNA质检合格,转移至96孔板,-20℃储存备用。
1、PCR扩增反应
在1.5mlEP管中配置PCR反应体系(具体反应组分见表3),并振荡混匀低速离心。针对23个SNP位点分别用23对上下游引物配制不同的PCR预混液。
表3 PCR反应体系相关试剂配置组分
注:MgCl2的最终浓度为3.5mM,其中1.875mM来自PCR试剂,1.625mM来自MgCl2试剂。
选用8道或12道移液器,在384孔板的每个加样孔加入4ulPCR master mix,最后加入1ul模板DNA(20ng/ul)混匀,小心盖上384孔封板膜,并压牢每个孔,防止PCR程序时出现蒸发现象。1000rpm离心1分钟。
设置如下(表4)PCR扩增反应程序,将PCR反应板置于PCR仪上,启动程序。
表4 PCR反应条件设置
2、产物碱性磷酸酶处理
在PCR反应结束后,将PCR产物用SAP处理,以去除体系中游离的dNTPs:首先在新1.5mlEP管中配制碱性磷酸酶处理反应液,SAP Mix反应组分见表5。
表5 SAP反应组分
将SAP Mix加入384孔PCR反应板,对于每个碱性磷酸酶处理反应孔,反应总体积为7ul,其中PCR产物5ul,SAP Mix 2ul。移液完成后,小心盖上384孔封板膜,并压牢每个孔,防止PCR程序时出现蒸发等现象,离心后进行如下反应程序。设置SAP反应程序,37℃20分钟,85℃5分钟,4℃维持。并将384孔反应板置于PCR仪上,启动程序。
3、单碱基延伸反应
在碱性磷酸酶处理结束后,进行单碱基延伸反应,反应体系总体积9ul:在新1.5mlEP管中配制碱性磷酸酶处理反应液,EXTEND Mix反应组分见表6。
表6延伸反应组分(EXTEND Mix)构成
延伸反应组分 | 浓度 | 体积 |
水 | NA | 0.619ul |
iPLEX试剂 | 0.222x | 0.200ul |
iPLEX终止试剂 | 1× | 0.200ul |
引物 | 0.625uM:1.25uM | 0.940ul |
iPLEX酶 | 1× | 0.041ul |
总计 | - | 2.00ul |
将EXTEND Mix对应加入384孔PCR反应板,对于每个反应孔,单碱基延伸反应体系:EXTEND Mix 2ul,SAP+PCR reaction 7ul。移液完成后,小心盖上384孔封板膜,并压牢每个孔,防止PCR程序时出现蒸发等现象,离心后进行如下反应程序。设置延伸反应程序,见表7。
表7延伸反应条件设置
4、树脂纯化
1)在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。
2)在384孔板的每个孔中加16ul水。
3)将384孔板轻轻翻转过来扣在Dimple板上,然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。
4)将384孔板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
5、芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪,将树脂纯化后的延伸产物移至384-well SpectroCHIP bioarray上。
6、质谱检测及数据输出
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图,检查数据分析的完整性和正确性,将结果保存入相应存储媒介。
按照上述检测方法,共检测10个健康人标本基因组DNA,遵照上述检测流程,最终得到每个标本的23个热点变异位点的基因型别,见表8-表12。
表8
表9
表10
表11
表12
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 精治基因技术(北京)有限公司
<120> 一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因SNP位点的检测***与应用
<130> KHP171115323.4
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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acgttggatg acttcatcca cgtgaagccc 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg aggcattgac cctatccaac 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acgttggatg agaaagacag ttgtatgtcc 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgttggatg tggcgttttg caaacatacc 30
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg cctgttccac tttctttgat g 31
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgttggatg atgacgctgc ggaattttgg 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgttggatg gaaggtgttt caaagggtaa 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg gcaggatgaa aagatggcac 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acgttggatg gctgacgtat ggcttattcg 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgttggatg cgcactttca gagtcttgag 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg catgagagac agagcacaag 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acgttggatg gggacctgaa ggttatacaa 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acgttggatg aagtgtggtt ccagaaaagg 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acgttggatg gggtggctga agtgttttac 30
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acgttggatg ggggtgataa ttgtatgc 28
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acgttggatg catatttagt ttgactcacc 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acgttggatg tcagaaggca tagtaccagc 30
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tggccacagg actcc 15
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cacagggtct gggct 15
<210> 49
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tggggagaag gtcaa 15
<210> 50
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttggccttac ctggat 16
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gcctttgctg ccctcac 17
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gggatcactt gtgacat 17
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tcaagggctt cggggta 17
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ggttcactgt ttctccaa 18
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
agatctttcc caatttctg 19
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggtggagatt ctcaacaga 19
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gggtgactgc gtctggaac 19
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tctggcttcc tcttgaacac 20
<210> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aaacataagc acaccatagt t 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gcactagcag caagggattc c 21
<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
aaacatttgg taagagtgga t 21
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cctatccttt actctaatca ctt 23
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggcaaaagag gagaaggctt ca 22
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gcctttgtat ctaattttgc att 23
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
taatattgat gtactacagt gac 23
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aagagaaagg aatagaaaga atca 24
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gttacttatt tgtctttgtt ttctg 25
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggaaagataa gaaagaacta gaaggt 26
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ataagtttgt attaaaacaa caattac 27
Claims (10)
1.一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测***,其特征在于,所述检测***含有6个工作单元,分别是(1)PCR反应单元、(2)PCR产物碱性磷酸酶处理单元、(3)单碱基延伸反应单元、(4)纯化单元、(5)芯片点样单元、(6)质谱检测及数据输出单元;所述(1)PCR反应单元含有SEQ ID NO.1-46所示的引物。
2.如权利要求1所述的检测***,其特征在于,所述(3)单碱基延伸反应单元含有SEQID NO.47-69所示的单碱基延伸引物。
3.如权利要求1所述的检测***,其特征在于,所述癫痫用药相关基因分别为SCN1A,SCN2A,GABRA1,ABCB1,ABCC2,EPHX1,UGT1A6/UGT1A4,UGT2B7,CYP2C9,CYP2C19。
4.如权利要求1-3任一所述的检测***,其特征在于,其工作程序包括以下步骤:
(1)PCR反应单元:以待测样品的基因组DNA为模板,以SEQ ID NO.1-46所示的引物按照编码的奇数偶数两两顺序组合的方式,分别进行23次PCR反应;
(2)PCR产物中游离的dNTPs处理单元:去除PCR产物体系中游离的dNTPs;
(3)单碱基延伸反应单元:向步骤(2)处理过的PCR反应体系中加入单碱基延伸反应混合液进行单碱基延伸反应,所述延伸反应混合液中含有23条单碱基延伸反应引物,使用方式是每条单碱基延伸反应引物对应一对特异引物扩增的PCR产物;
(4)纯化单元:将(3)单碱基延伸反应单元的产物进行纯化;
(5)芯片点样单元:将纯化后的单碱基延伸反应产物移至芯片点样;
(6)质谱检测及数据输出单元:点样后的芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析,获得基因分型图。
5.如权利要求4所述的检测***,其特征在于,步骤(1)中PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃20s,56℃30s,72℃60s,45个循环;72℃延伸3min。
6.如权利要求4所述的检测***,其特征在于,步骤(3)中单碱基延伸反应混合液由水、iPLEX试剂、iPLEX终止试剂、单碱基延伸引物、iPLEX酶组成;所述单碱基延伸反应条件为:
(a)94℃预变性5min;
(b)94℃5s;
(c)52℃30s,80℃5s,共5个循环;
重复步骤(b)和(c),共40个循环;
(d)72℃延伸3min。
7.如权利要求4-6任一所述的检测***,其特征在于,(6)中根据基因分型图中每个待测样品23个热点变异位点的基因型别判断癫痫相关基因是否发生突变。
8.一种用于检测癫痫用药相关基因突变的检测试剂盒,其特征在于,含有23对特异性引物和23条单碱基延伸引物;所述23对特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-46所示,引物按照编码SEQ ID NO.1、24,SEQ ID NO.2、25,依次类推将23对引物按此顺序组合的方式成对;所述23条单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.47-69所示,且根据编码顺序依次与前述23对特异性引物逐一对应搭配使用。
9.一种引物组合在制备用于检测癫痫用药相关基因突变检测试剂盒中的应用,所述引物组合含有23对特异性引物和23条单碱基延伸引物;所述23对特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-46所示,引物按照编码SEQ ID NO.1、24,SEQ ID NO.2、25,依次类推将23对引物按此顺序组合的方式成对;所述23条单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.47-69所示,且根据编码顺序依次与前述23对特异性引物逐一对应搭配使用。
10.权利要求1-7任一所述的检测***或权利要求8所述的检测试剂盒在指导癫痫用药中的应用。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110106236A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-09 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 利用高分辨率熔解曲线法检测左乙拉西坦用药相关基因scn1a多态性的试剂盒及其方法 |
CN110157800A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-08-23 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 精神类药物相关基因的检测引物组、试剂盒、体系和方法 |
CN113136424A (zh) * | 2021-05-21 | 2021-07-20 | 广州合一生物科技有限公司 | 一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测试剂盒及其应用 |
CN113192649A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-07-30 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种指导癫痫疾病个体化精准用药的*** |
CN113322315A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-31 | 上海浦东解码生命科学研究院 | 癫痫用药相关snp位点的检测产品及方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009006793A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-15 | The Chinese University Of Hong Kong | Polymorphisms of scn2a associated with resistance to antiepileptic drugs and use thereof |
US20140315737A1 (en) * | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Ucb Pharma, S.A. | Biomarkers for epilepsy |
CN104561336A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-04-29 | 复旦大学附属华山医院 | 利用高分辨熔解曲线分析技术检测ugt2b7基因多态性的方法 |
-
2018
- 2018-12-17 CN CN201811541290.5A patent/CN109504764A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009006793A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-15 | The Chinese University Of Hong Kong | Polymorphisms of scn2a associated with resistance to antiepileptic drugs and use thereof |
US20140315737A1 (en) * | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Ucb Pharma, S.A. | Biomarkers for epilepsy |
CN104561336A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-04-29 | 复旦大学附属华山医院 | 利用高分辨熔解曲线分析技术检测ugt2b7基因多态性的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
RUCHI BAGHEL等: "Evaluating the Role of Genetic Variants on first-line antiepileptic drug response in North India: Significance of SCN1A and GABRA1 Gene Variants in Phenytoin Monotherapy and its Serum Drug Levels", 《CNS NEUROSCIENCE & THERAPEUTICS》 * |
SANDEEP GROVER: "Pharmacogenetic studies of antiepileptic drugs", 《THESIS SUBMITTED TO UNIVERSITY OF PUNE》 * |
WEIXING FENG等: "Effects of UGT1A6 and GABRA1 on Standardized Valproic Acid Plasma Concentrations and Treatment Effect in Children With Epilepsy in China", 《THER. DRUG MONIT.》 * |
岳丽: "ABCB1基因多态性在癫痫患者中的分布及其与抗癫痫药物疗效的相关性研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110106236A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-09 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 利用高分辨率熔解曲线法检测左乙拉西坦用药相关基因scn1a多态性的试剂盒及其方法 |
CN110157800A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-08-23 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 精神类药物相关基因的检测引物组、试剂盒、体系和方法 |
CN110157800B (zh) * | 2019-06-28 | 2022-11-04 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 精神类药物相关基因的检测引物组、试剂盒、体系和方法 |
CN113136424A (zh) * | 2021-05-21 | 2021-07-20 | 广州合一生物科技有限公司 | 一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测试剂盒及其应用 |
CN113192649A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-07-30 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种指导癫痫疾病个体化精准用药的*** |
CN113192649B (zh) * | 2021-06-01 | 2023-09-22 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种指导癫痫疾病个体化精准用药的*** |
CN113322315A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-31 | 上海浦东解码生命科学研究院 | 癫痫用药相关snp位点的检测产品及方法 |
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